“PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實驗的突破

張 瑾 （北京市第四中學 北京 100034）

1 問題的提出

高中生物學課程標準的內(nèi)容標準中，要求組織學生“嘗試PCR（DNA聚合酶鏈式反應）技術的基本操作和應用”，建議開展“用某個DNA片段進行PCR擴增”的實驗活動。為此，浙科版教材設有“DNA片段的PCR擴增”實驗。該實驗有助于學生理解PCR反應的原理，掌握PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術，認同現(xiàn)代生物技術的應用價值。教材中使用亞甲基藍溶液對電泳后的凝膠進行染色，亞甲基藍基本無毒，能將無色的DNA染成藍色，染色結果穩(wěn)定且肉眼可見，染液可回收和反復利用。

但是，本實驗選用的實驗材料是市售的λ噬菌體DNA或大腸桿菌，前者較為昂貴，后者需進行培養(yǎng)。該實驗流程約為3課時，其中的電泳和染色需安排2節(jié)課連堂，教師調(diào)課有困難。此外，教材對實驗數(shù)據(jù)的處理也沒有具體要求，通過實驗培養(yǎng)學生理性思維的預期目標也難以實現(xiàn)。

2 實踐中探索

針對以上問題，筆者在近年的教學實踐中逐步對該實驗進行了探索，具體如表1。

表1 實驗改進前、后對比表

2.1 以酵母菌為實驗材料 為了便于實驗準備，筆者將實驗材料改為超市購買的食用高活性干酵母（釀酒酵母），并將其制成酵母細胞懸液。具體操作是：稱取0.1 g干酵母粉，放于盛有100 mL無菌水的三角瓶中，蓋上封口膜用皮筋綁好，搖勻后在溫暖環(huán)境下活化2 h即可。

2.2 簡化實驗步驟

1）PCR擴增酵母細胞的核糖體DNA（rDNA）部分片段。酵母細胞中編碼核糖體18S rRNA、5.8S rRNA、25S rRNA的3個DNA序列，中間相隔2個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）。 成熟的核糖體RNA中不包括ITS序列，因此自然選擇壓力較小，能容忍更多變異。此外，ITS序列拷貝數(shù)高，長度多在1 000 bp以內(nèi)，容易被PCR擴增。PCR擴增ITS序列，不僅可以鑒定病原真菌，篩選釀酒的酵母菌株，還可以通過測序和比對不同物種的序列建立進化樹，體現(xiàn)了PCR技術在醫(yī)療、工業(yè)和進化研究上的應用價值。

本實驗使用真菌通用ITS引物（ITS1引物和ITS4引物）擴增5.8S rDNA及其兩端的2個ITS的全部序列，以及相鄰的18S rDNA和25S rDNA的部分序列，總長度為841 bp。引物A（ITS1引物）序列為 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′。 引物 B（ITS4引物）序列為 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′［2］。實驗所用擴增緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶和引物均為市售產(chǎn)品。

圖1 核糖體DNA部分片段示意圖

PCR具體步驟為：使用微量移液器將PCR反應體系（見表2）各成分加入到0.2 mL已滅菌的微量離心管中。陰性對照則是用無菌水代替酵母細胞懸液。切記不可加入過多酵母，否則細胞壁會影響PCR效果；且酵母細胞懸液需搖勻后再吸取。反復吹吸使反應液混合均勻，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 s,使反應液集中于微量離心管的底部。將微量離心管放入PCR儀中，反應條件參數(shù)設置如圖2。擴增后的PCR產(chǎn)物可貯存于-20℃冰箱中。

表2 PCR反應體系配方

圖2 PCR反應條件流程圖

2）縮短凝膠電泳時間。教材上是80 V電壓下電泳40 min，現(xiàn)壓縮到25 min即可看到PCR產(chǎn)物和Marker條帶。具體操作方法是：①制備瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖0.25 g加到盛有25 mL電泳緩沖液的三角瓶中（電泳緩沖液為市售50×TBE電泳緩沖液加蒸餾水稀釋而成。5×TBE電泳緩沖液制備方法為:稱取54 g Tris，27.5 g硼酸溶于800 mL蒸餾水中，加入 20 mL 0.5 mol/L EDTA，調(diào)節(jié) pH至 8.0，加水定容至1 L，室溫保存?zhèn)溆茫?。蓋上封口膜并用橡皮筋綁?。挥梦⒉t加熱1 min，使瓊脂糖熔化呈透明；倒入膠盒，注意避免產(chǎn)生氣泡。待凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將其從膠盒中取出，放入電泳槽內(nèi)，加樣孔一端朝向負極。向電泳槽中加入電泳緩沖液，并沒過凝膠。②加樣：用微量移液器向50 μL PCR產(chǎn)物中加入 10 μL 6×上樣緩沖液，并反復吹吸混合均勻。將10 μL和20 μL樣品混合液分別緩慢加到2個加樣孔內(nèi)。陰性對照組方法同上，加樣 10 μL。 將 20 μL DNA Marker 與4 μL 6×上樣緩沖液混合均勻，全部加到加樣孔內(nèi)；若市售DNA Marker已含有上樣緩沖液，則無需混合，直接加樣25 μL。每次加樣需更換1個槍頭。盡量避免使用最外側的加樣孔，其染色效果有時不理想。③電泳：蓋上電泳槽蓋，連接好電極插頭后再接通電源。將直流電泳儀電源的電壓設置成80 V，電泳25 min。注意觀察溴酚藍不要遷移出凝膠。

2.3 優(yōu)化染色方案 教材中的3步染色法，操作時間較長。筆者通過反復實踐，提出2種可行的染色方案，既確保實驗效果理想，又能滿足教師的不同排課需求。

染色方案1：壓縮并改進3步染色法，1課時完成電泳和染色。具體方法是：①將凝膠放入培養(yǎng)皿里，倒入0.1% 亞甲基藍溶液沒過凝膠約5 mm，染色8 min。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間，不要留有氣泡。染色后回收染液，染液需避光保存。②倒入75%乙醇沒過凝膠約5 mm，不斷晃動培養(yǎng)皿1～1.5 min。再倒去乙醇。③加入冷的蒸餾水進行脫色，當出現(xiàn)清晰的藍色條帶時，倒去蒸餾水終止脫色。此過程中可更換被染藍的蒸餾水。此外，凝膠在蒸餾水中不宜浸泡過久，否則條帶顏色變淡直至無色。

上述方案主要改進之處有：將染色時間從“15～20 min”壓縮為“8 min”，因電泳時間已經(jīng)從“40 min”壓縮到“25 min”,從而 1 課時就可以完成電泳、染色和觀察，較原有方案減少了1課時，同時染色結果十分清晰（如圖3）。染色時間縮短之后，染液的深度對染色結果的影響就顯現(xiàn)出來。同樣是染色8 min,圖3是染液沒過凝膠約5 mm的結果，圖4是染液覆蓋凝膠的結果（使用Marker 5 000），可見前者較為清晰。因此，將“染液覆蓋凝膠”改為“沒過凝膠約5 mm”，即向裝有凝膠的普通中號培養(yǎng)皿中倒?jié)M染液。此外，將“冷水”改為“冷的蒸餾水”，是由于自來水中的氯會影響染色效果。此外，凝膠厚度不同，染色效果也有所差異，教師可進行預實驗并適當調(diào)整染色時間。

染色方案2：向盛有凝膠的培養(yǎng)皿中倒入0.002%亞甲基藍溶液（將2 mL的0.1%亞甲基藍溶液加入10 mL電泳緩沖液中,再加入88 mL蒸餾水，避光保存），并沒過凝膠約5 mm。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間。蓋上培養(yǎng)皿蓋，4℃冷藏過夜。次日觀察經(jīng)過染色處理的凝膠板，看到清晰的藍色區(qū)帶后，倒去染液，終止染色。

本方案將染色步驟簡化為1步，染色效果仍很好。教師可利用剩余時間講解觀察實驗現(xiàn)象的時間和方法，由于亞甲基藍的染色效果較為穩(wěn)定，可組織學生利用次日的課余時間觀察實驗結果。

2.4 細化觀察方法 學生觀察凝膠板上呈現(xiàn)的DNA藍色條帶時，可先在桌上鋪一張白紙，在光下手持盛有凝膠的培養(yǎng)皿距白紙5 cm以上，找到較為清晰的條帶。再將凝膠置于平的透明玻璃板上，放在三腳架上面進行觀察和手機拍照。在觀察的同時，可在實驗報告單上繪制草圖，標出DNA藍色條帶的數(shù)目和位置。

圖3 染液沒過凝膠5 mm染色結果照片

圖4 染液覆蓋凝膠染色結果照片

圖5 實驗結果局部照片及黑白鏡像

3 獲得理想的實驗效果

高中生物學實驗強調(diào)引導學生體驗知識形成的過程，重視學生的科學思維訓練，培養(yǎng)嚴謹和實事求是的科學態(tài)度。實踐表明，只有實驗進展順利并獲得理想的實驗效果，才能為學生的科學思維訓練提供必要條件。本實驗中染色凝膠板上呈現(xiàn)的清晰藍色條帶（如圖3和圖5），即為DNA所在位置。PCR產(chǎn)物的長度介于800～1 000 bp之間，20 μL的 PCR產(chǎn)物樣品混合液的條帶比 10 μL的條帶深且寬，陰性對照組則無PCR產(chǎn)物條帶。

在實驗教學活動中，引導學生通過分析實驗數(shù)據(jù)得出結論，是進行科學思維訓練的最好方式。但在以往教學過程中，僅提示學生通過對比Marker條帶估計PCR產(chǎn)物的大致長度，卻忽略了3個問題：①PCR產(chǎn)物條帶位于2條Marker條帶之間，應該如何科學地估值？②估測PCR產(chǎn)物長度只用到了Marker的1個或2個條帶，丟棄了Marker其他條帶中所蘊含的寶貴信息，應如何充分地分析實驗數(shù)據(jù)？③DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈負相關，應如何處理與對數(shù)相關的實驗數(shù)據(jù)？在學科教研活動中教師普遍認為，這節(jié)實驗課獲得的數(shù)據(jù)是培養(yǎng)學生理性思維的極好素材。理性思維是基于論證及邏輯推理的思維過程和方式，引導學生解決以上問題的過程就是對學生進行邏輯思維訓練的過程，因此筆者在本實驗活動中又進行了如下嘗試：

1）用直尺測量凝膠電泳后不同DNA片段遷移距離（圖6），即凝膠板上每條DNA條帶與加樣孔之間的距離，記錄于表3。

圖6 測量DNA條帶的遷移距離照片

表3 DNA片段長度與遷移距離記錄表

2）借助半對數(shù)坐標紙分析對數(shù)數(shù)據(jù)。如圖7A所示，遷移距離所在的X軸是分度均勻的普通坐標軸；DNA片段長度所在的Y軸是分度不均勻的對數(shù)坐標軸，在此軸上某點與0點的實際距離為該點對應數(shù)（即DNA片段長度）的對數(shù)值，但是在該點標出的值是DNA片段長度原數(shù)值。實際應用時，往往根據(jù)需要使用半對數(shù)坐標紙的一部分，如圖7A縱軸的起點就是100而不是0。將Marker 2000清晰的4個條帶的數(shù)據(jù)標到圖上，可見所有的點在一條直線上。從而推斷“DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈負相關”，繪制趨勢線（直線）作為標準曲線。據(jù)此標準曲線和PCR產(chǎn)物條帶的遷移距離，可推斷出PCR產(chǎn)物的大小約為840 bp。本次估值建立在Marker全部條帶信息的基礎上，更加科學。半對數(shù)曲線圖的繪制易于教師展開教學；學生也習得了處理對數(shù)的簡便方法，繪圖和分析圖表的能力得到了提升；數(shù)據(jù)的獲取和分析更為深入。

3）使用條帶更多的Marker 5 000驗證上述實驗結果的正確性。將Marker 5 000的8個條帶的數(shù)據(jù)標記在半對數(shù)坐標紙上，8個點也位于一條直線上，其趨勢線與Marker 2 000很接近，且基本平行。根據(jù)Marker 5 000實驗結果中PCR產(chǎn)物的遷移距離和趨勢線，推斷PCR產(chǎn)物大小也約為840 bp，從而證明之前實驗分析方法和結論的正確性。為了更好地比較2條趨勢線，本文中使用Marker 2 000的凝膠實際電泳時間為23.5 min，比另一組短1.5 min，從而避免2條線過于重合導致繪圖、分析的困難。在實際教學過程中，教師可利用等待電泳和染色的時間引導學生分析課前準備的已染色凝膠，將學生分為2組，分別分析使用不同Marker的2塊凝膠，然后互為驗證，學生再運用課上學得的分析方法分析自己的實驗結果。

4）運用Excel繪制半對數(shù)曲線圖精確計算PCR產(chǎn)物大小。如果想獲得精確的實驗結果，學有余力的學生可以課下嘗試用Excel處理數(shù)據(jù)，或由教師匯總全班數(shù)據(jù)：將表3中Marker條帶的信息輸入到Excel中，選擇繪制“散點圖”，將縱坐標軸設置成 “對數(shù)坐標”。添加趨勢線時選擇 “指數(shù)”類型，并顯示公式及R2值，從而獲得半對數(shù)曲線圖，如圖7B?？梢?條直線接近且基本平行，0.99的R2值說明趨勢線與數(shù)據(jù)的擬合度很好，證明了DNA條帶的遷移距離與片段長度的對數(shù)呈負相關。將PCR產(chǎn)物2次實驗的遷移距離分別帶入公式，計算出其長度約為846 bp及841 bp，與實際長度841 bp很接近。運用軟件分析實驗結果是信息技術與現(xiàn)代生物技術的結合，不僅實驗結果分析更為精確，也激發(fā)了學生的學習興趣，使學生的理性思維水平得以提高。

圖7 DNA片段長度與遷移距離曲線圖

4 達到預期的教學效果

本實驗原本是驗證性實驗，半對數(shù)曲線圖的引入，使之轉(zhuǎn)變?yōu)樘骄啃詫嶒灐Ｏ韧ㄟ^Marker條帶在圖上對應的點尋找規(guī)律，當推斷出“DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈負相關”，繪制標準曲線后，又利用這個規(guī)律估測PCR產(chǎn)物大小，解決實際問題。然后，用條帶更多的Marker進行平行實驗，進一步驗證上述實驗結果的真實性，最終得出令人信服的實驗結論。此外，測量DNA條帶的遷移距離時容易產(chǎn)生誤差，可采取多次測量、全班匯總等方法減小誤差。學有余力的學生可使用Excel匯總數(shù)據(jù)，繪制半對數(shù)曲線圖，精確計算PCR產(chǎn)物的大小，通過R2值驗證“Marker的DNA條帶的遷移距離與片段長度的對數(shù)呈負相關”的正確性。由此可見，引導學生用數(shù)學模型法分析實驗數(shù)據(jù)，其論證過程嚴謹，邏輯推理結論可信，從而將發(fā)展學生的生物科學素養(yǎng)落到實處。

主要參考文獻

［1］The College Entrance Examination Board.AP biology lab manual for students.New York:The College Board,2001:74.

［2］Cavalieri D,Mcgovern P E,Hartl D L,et al.Evidence forS.cerevisiaefermentation in Ancient Wine.Journal of Molecular Evolution,2003,57(1):S226.