羥基自由基氧化對蛋清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

牛思思,汪建明,賀雅欣,于景華

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

羥基自由基氧化對蛋清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

牛思思,汪建明*,賀雅欣,于景華

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

研究蛋清蛋白質(zhì)經(jīng)過FeCl3/抗壞血酸(Asc)/H2O2產(chǎn)生的羥基自由基氧化體系氧化后化學結(jié)構(gòu)的變化。用不同濃度的H2O2(0、1、5、10和20 mmol/L)對蛋清蛋白質(zhì)氧化3 h,研究氧化前后蛋清蛋白質(zhì)羰基、游離巰基、總巰基、游離氨基、粒徑分布及二級結(jié)構(gòu)的變化趨勢。結(jié)果表明:氧化可使蛋清蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高(p<0.05),游離巰基和總巰基含量顯著下降(p<0.05),游離氨基顯著下降(p<0.05),平均粒徑逐漸增大。當H2O2濃度為20 mmol/L時,與對照組相比羰基含量增加2.01倍,游離氨基降低了29.1%,平均粒徑增加到666 nm。在H2O2濃度低于5 mmol/L時,α-螺旋和β-折疊含量升高,β-轉(zhuǎn)角降低;H2O2濃度高于5 mmol/L時蛋清蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂,進一步導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。以上結(jié)果表明氧化能在一定程度上改變蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)特性。

蛋清蛋白,羥基自由基,蛋白質(zhì)氧化,結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的氧化行為是使食品品質(zhì)變差的重要原因,是導致蛋白質(zhì)營養(yǎng)流失、風味變差以及功能特性下降的重要原因[1]。蛋白質(zhì)在加工和貯藏階段引入的氧化劑、催化劑、金屬離子或不當?shù)募庸l件(如輻照)[2],都有可能引起蛋白質(zhì)的氧化。蛋白質(zhì)的氧化變性取決于其結(jié)構(gòu)特點和特定的促氧化劑所固有的氧化機制,也可能受到pH、溫度和系統(tǒng)組分的影響。氧化劑通過奪氫、加氧、斷裂、交聯(lián)等方式使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,失去生物活性,并引起其它不理想的變化[3]。

目前,在食品科學領域,對蛋白質(zhì)氧化機理的解釋大多集中于大豆分離蛋白、乳清分離蛋白以及肌肉纖維蛋白。研究表明,在模擬氧化體系中對蛋白質(zhì)進行氧化處理,導致蛋白質(zhì)的主鏈和氨基酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生變化,如肽鏈的斷裂、氨基酸殘基側(cè)鏈的氧化修飾以及蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)物的形成等,進而會使得其營養(yǎng)品質(zhì)及功能性質(zhì)的降低,蛋白制品的品質(zhì)及消費者的可接受性隨之下降[4]。Davies[5]發(fā)現(xiàn)活性氧自由基會攻擊幾乎所有類型氨基酸側(cè)鏈,而芳香族和含硫氨基酸酸側(cè)鏈特別容易受到氧化。Kong等[6]在室溫條件下將乳清分離蛋白暴露于H2O2/FeCl3羥基自由基體系中,研究不同氧化程度的乳清蛋白化學和結(jié)構(gòu)變化,主要表現(xiàn)為羰基氧化產(chǎn)物的生成,總巰基含量的降低及蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集等,并且蛋白質(zhì)在羥基自由基體系下更容易發(fā)生氧化。章銀良等[7]研究了羥基自由誘導牛血清蛋白的氧化發(fā)現(xiàn)總巰基及活性巰基的含量都有著不同程度的減少,隨著氧化劑濃度的增加和氧化時間的延長,表面疏水性和羰基含量均呈增加趨勢,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。但是目前的研究中并沒有涉及氧化對蛋清蛋白物理化學性質(zhì)方面的研究。對于蛋清蛋白的氧化修飾及其氧化后理化性質(zhì)的變化規(guī)律還需更多的實驗研究來揭示。

本研究以蛋清蛋白為研究對象,采用羥自由基氧化體系(FeCl3/Asc/H2O2,pH6.0)對其進行氧化修飾,通過對羰基含量、游離巰基、總巰基及二級結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)指標的探討,根據(jù)它們的變化規(guī)律及相互關系揭示羥基自由基對蛋清蛋白結(jié)構(gòu)的氧化修飾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋清粉 鄭州頂嘉食品科技有限公司;牛血清蛋白 美國Sigma公司;考馬斯亮藍 北京Solarbio科技有限公司;巰基乙醇 北京索萊寶科技有限公司;氯化鐵(FeCl3)、過氧化氫(H2O2)、抗壞血酸(Asc)、乙二胺四乙酸(EDTA) 均為分析純。

HH-S4型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;H05-1型恒溫磁力攪拌器 天津東南儀誠科技有限公司;AB204-N型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FD-1型系列冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;TDZ5-WS型低速離心機 湘儀離心機有限公司;756PC型紫外可見分光光度計 天津普瑞斯有限公司;BT-90型納米粒度儀 丹東市百特儀器有限公司;IS50型傅里葉紅外光譜儀 美國尼高利。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋清蛋白的氧化 采用羥基自由基氧化體系主要由FeCl3、Asc和H2O2通過鐵的氧化還原反應產(chǎn)生自由基[8]。FeCl3、Asc濃度均為0.1 mmol/L,H2O2濃度分別為0、1、5、10、20 mmol/L,反應體系均在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中,在上述氧化體系中加入蛋清粉,使得蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度為20 mg/mL,80 ℃水浴3 h,研究不同氧化程度對蛋清蛋白結(jié)構(gòu)及其功能特性的影響。氧化結(jié)束后,加入EDTA(終濃度為1 mmol/L)終止反應。為了減少氧化試劑對測定指標的影響,氧化產(chǎn)物要經(jīng)過pH6.0磷酸鹽緩沖溶液洗滌和離心處理去掉上清液,冷凍干燥得到氧化蛋白,用于測定氧化蛋白的羰基含量、巰基含量、二硫鍵含量、游離氨基含量、粒徑、二級結(jié)構(gòu)。

1.2.2 氧化蛋清蛋白羰基含量的測定 蛋白質(zhì)羰基含量的測定參考文獻[9]。將制備的氧化蛋清蛋白分散于去離子水中,磁力攪拌2 h,4000 r/min離心30 min。采用考馬斯亮藍法以牛血清白蛋白為標準品測定上清液中蛋白質(zhì)量濃度。將10 mL上清液與2 mL含有10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(DNPH)的2 mol/L HCl混合,另取10 mL上清液與2 mL不含有2,4-二基苯肼的2 mol/L HCl混合作為對照,常溫反應2 h。然后在每個離心管中加入40%的三氯乙酸0.50 mL,劇烈振搖均勻后靜置20 min。4000 r/min 離心20 min后棄去上清液。用乙醇-乙酸乙酯混合溶液(體積比為1∶1)2.0 mL洗滌沉淀,4000 r/min離心10 min棄去上清液,重復洗滌3次。加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(含6 mol/L鹽酸胍,pH7.0)2.0 mL,37 ℃水浴20 min,每5 min劇烈振搖1次。以空白對照在370 nm處作校正,以 22000 cm-1消光系數(shù)計算每毫克蛋白質(zhì)羰基衍生物的物質(zhì)的量。

式中,A370:370 nm出的吸光值;D:為稀釋倍數(shù);C:為蛋白樣品濃度,mg/mL。

1.2.3 氧化蛋清蛋白巰基與總巰基的測定 采用5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB)比色法[9]測定蛋白質(zhì)的巰基含量(包括游離的和埋藏在蛋白質(zhì)疏水基團內(nèi)部的巰基)和總巰基基團(包括巰基和還原的二硫鍵)含量。

巰基含量的測定:取3 mL蛋白溶液,加入0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(1 mmol/L EDTA和1% SDS,pH8.0)3 mL、DNTB 0.1 mL,振蕩均勻后在常溫反應1 h。4000 r/min離心10 min。以不加DNTB為對照,取上清液在412 nm下測定吸光度,以13600 cm-1消光系數(shù)計算巰基含量。

總巰基基團含量的測定:取1 mL蛋白溶液,加入 0.05 mLβ-巰基乙醇和0.1 mol/L尿素-鹽酸胍磷酸鹽緩沖液(6 mol/L尿素和4 mol/L鹽酸胍,pH8.0)4 mL,反應1 h后再加入12%三氯乙酸10 mL,反應1 h后,4000 r/min離心10 min。沉淀分散在20 mL 12%的三氯乙酸中,離心除去β-巰基乙醇,如此重復2次。最后將沉淀溶解于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(1 mmol/L EDTA和1% SDS,pH8.0)10 mL,再加入0.08 mL DNTB,劇烈振蕩后反應1 h,4000 r/min離心 30 min。以不加 DNTB 為對照,取上清液在 412 nm 下測定吸光度,以13600 cm-1消光系數(shù)計算巰基含量。

式中,A412:412 nm出的吸光值;D:為稀釋倍數(shù);C:為蛋白樣品濃度,mg/mL。

1.2.4 氧化蛋清蛋白游離氨基的測定 采用三硝基苯磺酸(TNBS)比色法[10]測定蛋清蛋白游離氨基含量。將一定量氧化后的蛋清蛋白分散于0.1 mol/L的四硼酸鈉緩沖溶液(1% SDS,pH9.3)中,磁力攪拌2 h后,4000 r/min離心30 min,以牛血清白蛋白為標準蛋白,采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質(zhì)量濃度,最后通過稀釋使得上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達到0.1 mg/mL。取1 mL蛋白液與50 μL 0.03 mol/L TNBS混勻,37 ℃水浴1 h,加入0.24 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至 3.5～4.0,在 335 nm下測定吸光度。以亮氨酸為標準做標準曲線,計算游離氨基的含量(標準曲線方程y=0.0527x+0.0075,R2=0.9986)。

1.2.5 氧化蛋清蛋白粒徑的測定 將氧化后的蛋清蛋白分散在0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中,磁力攪拌 2 h,采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,通過稀釋使得上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL,使用納米粒度儀測定樣品粒度分布。

1.2.6 氧化蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定 將真空冷凍干燥后的蛋白粉末2～6 mg與0.2 g溴化鉀混合研磨均勻,用紅外專用壓片機進行壓片,在恒溫箱里平衡5 min,以空氣為掃描背景,運用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測定。

掃描參數(shù):光譜范圍4000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描累加64次,重復3次。選取1600～1700 cm-1波數(shù)的譜圖,利用OMNIC 8.2數(shù)據(jù)處理軟件進行分析處理。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有實驗均進行3次重復實驗,數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示,采用Origin 8.0對數(shù)據(jù)進行分析處理。不同字母表示組間差異顯著(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 羰基含量的變化

圖1 不同氧化程度的蛋清蛋白羰基含量的變化Fig.1 Changes in carbonyl content of different degree of oxidation egg white protein

2.2 游離巰基和總巰基的變化

巰基和二硫鍵是蛋白質(zhì)中具有最高反應活性的基團,蛋白質(zhì)發(fā)生氧化可使巰基(-SH)形成二硫鍵(-S-S-),因此在研究蛋白質(zhì)氧化時,巰基和二硫鍵含量的測定是重要的測定指標。

不同氧化程度的蛋清蛋白游離巰基和總巰基含量的變化見表1。由表1可知,羥基自由基氧化體系對游離巰基和總巰基含量的影響同羰基變化趨勢恰好相反。隨著氧化劑濃度的增大,蛋清蛋白的游離巰基的含量顯著下降。游離巰基含量的下降表明了氧化使得蛋白質(zhì)發(fā)生了變性,或者形成了分子間二硫鍵[14]。

表1 不同氧化程度的蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)游離巰基和總巰基的變化Table 1 Changes in free sulphydryl and total sulfhydryl(SH) content of different degree of oxidation egg white protein

注:不同字母表示組間差異顯著p<0.05。

由表1同樣可以發(fā)現(xiàn),隨著氧化劑濃度的增大,蛋清蛋白的總巰基含量也是顯著下降的,總巰基含量與對照相比分別減少了1.5%、7.9%、17.8%、33.5%和35.7%。

游離巰基和總巰基含量會隨著氧化程度的增加而呈現(xiàn)不同程度的損失。蛋清蛋白總巰基下降的絕對值大于游離巰基下降的絕對值,表明蛋白質(zhì)氧化使得蛋清蛋白二硫鍵含量下降。蛋白質(zhì)巰基可被氧化成多種狀態(tài),包括可逆氧化形式,主要形成蛋白質(zhì)二硫鍵和次磺酸;與不可逆氧化形式,主要形成亞磺酸和磺酸[14]。而實驗結(jié)果為二硫鍵含量下降,說明蛋清蛋白巰基被氧化成為不可逆氧化狀態(tài),形成了非二硫鍵的含硫化合物。

2.3 游離氨基酸含量的變化

圖2 不同氧化程度的蛋清蛋白游離氨基酸的變化Fig.2 Changes in free amine content of different degree of oxidation egg white protein

2.4 蛋清蛋白粒徑的變化

激光納米粒度測定儀是對可溶性蛋白質(zhì)的粒度分布進行測定,一定程度上可以解釋氧化蛋清蛋白的聚集程度。在羥基自由基氧化體系中蛋清蛋白的粒徑分布情況如圖3所示,與對照樣相比,當H2O2濃度為0和1 mmol/L時,蛋清蛋白的粒徑分布偏向粒徑小的方向;H2O2濃度達到5 mmol/L以上時,蛋清蛋白的粒徑分布偏向于粒徑大的反向。實驗結(jié)果表明氧化使得蛋清蛋白的粒徑發(fā)生變化,分為大粒度(約1000 nm)和小粒度(約100 nm)兩個部分。蛋清蛋白的平均粒徑隨著氧化劑濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,氧化劑濃度達到20 mmol/L時平均粒徑達到666 nm,比表面積達到最低,對照組的蛋清蛋白PDI(polydiseperse index,PDI)值最低,為0.139,粒度分布的均勻性較高,氧化劑濃度為20 mmol/L時,PDI值最大,說明粒度差異最大。

表4 氧化對蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 4 Changes in secondary structural comparative content of different degree of oxidation egg white protein

圖3 氧化對蛋清蛋白粒徑的影響Fig.3 Influence of egg white protein particle diameter on oxidation

這說明羥自由基氧化使得蛋清蛋白發(fā)生變性和聚集,使得蛋白質(zhì)粒徑增大,從而導致蛋白質(zhì)功能性質(zhì)改變。吳偉[4]在對大豆蛋白進行氧化的研究中也發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的聚集,與本實驗結(jié)果相符。黃友如等[16]研究報道蛋白質(zhì)氧化引起蛋白質(zhì)分子或亞基間共價的交聯(lián)和疏水基團的暴露,反應后的蛋白質(zhì)通過范德華力、氫鍵、疏水相互作用和靜電作用等分子間作用力重新折疊與組裝,從而形成較大的蛋白質(zhì)聚集體。

表2 蛋清蛋白粒徑分布的測定結(jié)果Table 2 Results of particle size distribution of egg white protein

2.5 蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化

紅外光譜圖中的酰胺I帶(1600～1700 cm-1)對蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)變化非常敏感,常用來測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化[17]。根據(jù)表3去卷積酰胺I帶各個波數(shù)及結(jié)構(gòu)指認表[18],計算出蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量。

表3 去卷積酰胺I帶各個波數(shù)及其結(jié)構(gòu)指認Table 3 Deconvoluted amide I band frequencies and assignments to secondary structure for protein

表4所示是羥基自由基氧化的蛋清蛋白發(fā)生不同程度氧化的二級結(jié)構(gòu)相對含量,發(fā)現(xiàn)氧化對蛋清蛋白α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的相對含量有不同程度的影響。隨著氧化劑濃度的增加,α-螺旋的相對含量先升高到5 mmol/L時達到最大,隨后呈現(xiàn)降低趨勢。無規(guī)則卷曲不明顯。β-轉(zhuǎn)角先下降后升高,而β-折疊的相對含量的變化是低濃度時升高,表明氧化可使蛋清蛋白形成聚集體,而當濃度達到10、20 mmol/L時,相對含量降低,可能是高濃度條件下,蛋清蛋白的肽鏈發(fā)生斷裂,進一步導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。吳偉[4]和Lund等[19]認為高氧化條件會致使蛋白質(zhì)肽鏈斷裂。

3 結(jié)論

通過FeCl3/Asc/H2O2產(chǎn)生的羥基自由基氧化體系對蛋清蛋白進行氧化,能夠顯著改變其結(jié)構(gòu)特性,隨著H2O2的濃度逐漸增加,蛋清蛋白的羰基含量顯著增加,游離巰基和總巰基含量顯著降低,二硫鍵含量降低,蛋白質(zhì)巰基發(fā)生不可逆氧化,形成了非二硫鍵的含硫化合物。隨著氧化程度的加深,蛋清蛋白的游離氨基含量逐漸降低,平均粒徑呈現(xiàn)增大趨勢,在氧化濃度低于5 mmol/L時,α-螺旋和β-折疊含量升高,伴隨著β-轉(zhuǎn)角降低,而氧化濃度高于5 mmol/L時蛋清蛋白的多肽鏈發(fā)生斷裂,從而導致了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。氧化還會導致蛋白質(zhì)其他結(jié)構(gòu)特性的改變,進一步影響蛋白質(zhì)宏觀上的功能特性,這些內(nèi)容會在今后的研究中進行探索。

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Effect of hydroxyl radical oxidation system on structure of egg white protein

NIU Si-si,WANG Jian-ming*,HE Ya-xin,YU Jing-hua

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

The objective of this study was to determine structural changes,including carbonyls,sulfhydryls,free amino,particle size distribution,secondary structure in egg white protein exposed to FeCl3/Asc/H2O2hydroxyl radical-generating systems. Protein carbonyl content in EWP increased(p<0.05)with increasing concentrations of H2O2,free SH,total SH groups and free amino decreased(p<0.05)in a similar fashion. EWP average particle size increased. When the H2O2concentration was increased to 20 mmol/L,there was 2.01-fold increase in carbonyl group,29.1% decrease in free amino acid,compared with control group. The average particle size reached 666 nm. The results showed that there were increases inα-helix andβ-fold of relative content,decrease inβ-turn of relative content with the increase of oxidizing agent(H2O2<5 mmol/L). Higher level oxidation(H2O2>5 mmol/L)would induce fragmentation through direct breakage of peptide bonds,resulted in changes in the secondary structures. These oxidation-induced changed demonstrate high susceptibility of EWP to oxidative stress.

egg white protein;hydroxyl radical;protein oxidation;structure

2016-08-16

牛思思(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)，E-mail：nss_bae@163.com。

*通訊作者:汪建明(1972-)，女，教授，研究方向：動物資源開發(fā)與功能食品，E-mail：wangjianming@tust.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目(31271904)。

TS253.1

A

1002-0306(2017)08-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.014