蜜柚葉黃酮的提取及其抗氧化與降尿酸活性研究

鄭亞美,任嬌艷,史傳超

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

蜜柚葉黃酮的提取及其抗氧化與降尿酸活性研究

鄭亞美,任嬌艷*,史傳超

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

研究蜜柚葉總黃酮的提取工藝、抗氧化活性及其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性。采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)蜜柚葉黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,探究蜜柚葉黃酮的最佳提取工藝條件。并通過DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子清除實(shí)驗(yàn)探究蜜柚葉黃酮對(duì)自由基離子的清除活性;通過黃嘌呤氧化酶活性抑制實(shí)驗(yàn)初步判斷其降尿酸功效。結(jié)果表明:蜜柚葉黃酮的最佳提取條件為料液比1∶30(g/mL)、乙醇濃度80%、浸提時(shí)間6 h、浸提溫度80 ℃,黃酮得率為12.41 mg/g。蜜柚葉黃酮對(duì)DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除活性,IC50值分別為:1.47、1.04、1.49 mg/mL。同時(shí),蜜柚葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值為4.8 mg/mL。

蜜柚葉,黃酮,抗氧化,降尿酸活性

人體新陳代謝會(huì)產(chǎn)生大量的自由基,由自由基導(dǎo)致的氧化損傷與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展有密切的關(guān)系,如動(dòng)脈粥樣硬化、血栓的形成、糖尿病及致癌、促癌及癌的形成過程中均有自由基的產(chǎn)生與參與[1]。因此,易于人體吸收且能清除人體內(nèi)自由基的天然抗氧化劑-黃酮類化合物已成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。黃酮類化合物是廣泛存在于植物皮、根、葉、果實(shí)中的一類天然有機(jī)化合物,具有廣泛的生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗過敏、止血鎮(zhèn)痛等,已被列為保健食品的一類功能因子[2]。流行病學(xué)研究還表明,長(zhǎng)期攝入富含黃酮類化合物的食物能顯著地降低腫瘤、心腦血管疾病等慢性病的發(fā)生機(jī)率[3]。

我國(guó)柚子栽培面積大,種植歷史悠久。目前,人們對(duì)柚子的研究主要集中于柚子果皮及果肉的研究,對(duì)柚子葉的研究鮮有報(bào)道。柚子葉似柑、橘葉,呈橢圓形或長(zhǎng)卵圓形,翼葉為心臟型,是典型的單復(fù)葉。為探究柚子葉功能性成分,本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化柚子葉黃酮的提取工藝,并通過DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子清除活性實(shí)驗(yàn)探究柚子葉黃酮的抗氧化活性,通過測(cè)定柚子葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性初步評(píng)價(jià)其降尿酸功效,以期為柚子葉黃酮的綜合開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜜柚采摘之后成熟期蜜柚葉 廣東梅州;蘆丁 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;亞硝酸鈉(分析純)、無水乙醇 廣東光華科技股份有限公司;硝酸鋁、結(jié)晶氯化鋁、鹽酸 廣州化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉 天津啟輪化學(xué)科技有限公司;氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT),1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶 Sigma公司。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;UV754N紫外分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;Synergy NEO HTS多功能微孔板檢測(cè)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 將洗凈的蜜柚葉于太陽(yáng)下常溫曬干后置于80 ℃烘箱烘20 min徹底烘干,將烘干的蜜柚葉去梗、粉碎并過60目篩后裝入封口袋中備用。實(shí)驗(yàn)過程中,準(zhǔn)確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中,恒溫振蕩浸提一段時(shí)間后用三層紗布過濾,將濾液于4000×g條件下25 ℃高速離心20 min,收集并濃縮(45 ℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮)濾液至體積為50 mL。設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)研究料液比、乙醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)蜜柚葉黃酮提取效果(總黃酮得率)的影響 準(zhǔn)確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,分別按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的比例依次加入80%的乙醇溶液,在70 ℃的搖床中恒溫浸提6 h,探索料液比對(duì)蜜柚葉黃酮提取效果的影響。

1.2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 準(zhǔn)確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,各加入80%的乙醇溶液60 mL,并置于80 ℃ 的搖床中恒溫提取2、4、6、8、10 h,研究浸提時(shí)間對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.2.3 浸提溫度對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 準(zhǔn)確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,各加入80%的乙醇溶液60 mL,并分別置于40、50、60、70、80 ℃溫度下的搖床中恒溫浸提6 h,探索溫度對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 準(zhǔn)確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液60 mL,并置于80 ℃的搖床中恒溫浸提6 h,研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.3 提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,用Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),確定柚子葉黃酮提取的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度及浸提時(shí)間作為4個(gè)考察因素,選取3個(gè)水平,并設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。

表1 蜜柚葉黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4 測(cè)定方法

1.2.4.1 總黃酮含量的測(cè)定 測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[4]。取6個(gè)10 mL試管,向其中加入0、0.6、1.2、1.8、2.4、3 mL濃度為0.2 g/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液,然后加去離子水至體積為3 mL,混勻后加入150 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液,振蕩混勻,靜置6 min后加入300 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的AlCl3·6H2O溶液,振蕩混勻,靜置5 min后加入1.0 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,最后加入550 μL去離子水至反應(yīng)液總體積為5.0 mL,振蕩均勻,并于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。線性回歸方程為y=0.0011x-0.0002(R2=0.9999),式中，x為蘆丁溶液質(zhì)量濃度(mg/mL),y為A510 nm。吸取蜜柚葉浸提液10 μL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)吸光度,并將結(jié)果按x=(y+0.0002)/0.0011計(jì)算得浸提液中黃酮濃度。

提取得率(mg/g)=測(cè)定濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積/提取所用粉末質(zhì)量

1.2.4.2 蜜柚葉黃酮抗氧化活性測(cè)定 將蜜柚葉浸提液配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL五個(gè)濃度梯度溶液備用。

a. DPPH·的清除活性 測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[5]。用無水乙醇將DPPH·試劑溶解定容,配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH·儲(chǔ)備液,置于冰箱中冷藏備用。精密量取蜜柚葉黃酮溶液1 mL及DPPH·醇溶液2 mL混勻,室溫下反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度。DPPH·清除率(%)=[1-(As-Ac0)/Ac1]×100，式中As代表樣品吸光度,Ac0代表樣品溶液空白對(duì)照吸光度,Ac1代表DPPH·醇溶液吸光度。

b.對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6]采用鄰二氮菲法測(cè)定羥自由基清除能力。樣品管:將1.2 mL濃度為5 mmol/L的鄰二氮菲與0.8 mL pH=7.4的PBS充分混勻后,加入1.2 mL一定濃度梯度的蜜柚葉黃酮溶液,混勻之后分別加入1.2 mL濃度為15 mmol/L的EDTA、1.2 mL濃度為15 mmol/L的FeSO4及1.6 mL體積濃度為0.1%的H2O2,37 ℃保溫1 h后在536 nm處測(cè)定混合溶液的吸光值記為A樣品。

損傷管:以1.2 mL的PBS溶液代替樣品溶液,其他均與樣品管相同,536 nm處測(cè)定混合溶液的吸光值記為A損傷。

未損傷管:以1.6 mL的PBS溶液代替H2O2溶液,其他均與樣品管相同,536 nm處測(cè)定混合溶液的吸光值記為A未損傷。

羥自由基清除率(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100

c.對(duì)超氧陰離子清除活性的測(cè)定 測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[7]。于96孔板微孔中分別加入20 μL 3 mmol/L的黃嘌呤溶液后再加入0.6 mmol/L NBT溶液180 μL,振蕩搖勻后加入20 μL蜜柚葉浸提液,搖勻后于37 ℃反應(yīng)5 min,然后向混合溶液中加入20 μL濃度為0.1 u/mL的黃嘌呤氧化酶溶液,將96孔板于37 ℃恒溫保溫30 min后于560 nm處測(cè)定吸光值,記為Asample。

以磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液作為空白對(duì)照,560 nm處測(cè)定吸光值,記為Acontrol。

清除率(%)=(Acontrol-Asample)/Acontrol×100

為綜合評(píng)價(jià)蜜柚葉黃酮對(duì)自由基離子的清除活性,實(shí)驗(yàn)以不同濃度的VC及沒食子酸溶液為對(duì)照品,并以同樣的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其對(duì)各自由基離子的清除活性。

1.2.4.3 蜜柚葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性測(cè)定 測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[8]。于96孔板中每孔加入50 μL待測(cè)樣品液及50 μL 濃度為0.005 μ/mL的黃嘌呤氧化酶液(XO),于酶標(biāo)儀中振蕩30 s后,25 ℃保溫5 min。然后加入150 μL 濃度為0.4276 mmol/L的黃嘌呤溶液(Xanthine),振蕩30 s后,25 ℃保溫25 min,在290 nm波長(zhǎng)處檢測(cè),空白實(shí)驗(yàn)以pH=7.4的PBS溶液代替樣品液,每個(gè)樣品扣除顏色實(shí)驗(yàn)是以pbs代替黃嘌呤氧化酶溶液。每組樣品設(shè)置三個(gè)平行。以不同濃度的別嘌呤醇做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示。使用Origin 8.5軟件和SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA),并利用 Origin 8.5 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 各單因素對(duì)蜜柚葉總黃酮浸提效果的影響

2.1.1 料液比對(duì)蜜柚葉總黃酮提取效果的影響 如圖1所示,料液比對(duì)總黃酮提取效率影響顯著,當(dāng)液料比小于1∶40時(shí),隨著液料比的增加,總黃酮得率顯著增加,這可能是因?yàn)槿軇┝康脑黾犹岣吡髓肿尤~與溶劑間黃酮類化合物的濃度差,從而減少了柚子葉中黃酮類物質(zhì)的殘留量[9]。當(dāng)液料比大于1∶40時(shí),增加料液比,總黃酮得率變化不明顯,這一結(jié)果說明當(dāng)料液比為1∶40時(shí),柚子葉原料中的總黃酮已基本完全溶出。所以選擇料液比為1∶20、1∶30及1∶40為正交實(shí)驗(yàn)研究水平。

圖1 料液比對(duì)蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to solvent on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

圖2 浸提時(shí)間對(duì)蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 如圖2所示,隨著浸提時(shí)間的增加蜜柚葉總黃酮的提取率呈先增加后基本不變的趨勢(shì),這一結(jié)果說明,當(dāng)恒溫浸提時(shí)間達(dá)到6 h左右,柚子葉原料中的黃酮類物質(zhì)已基本完全溶出,此時(shí)蜜柚葉黃酮的提取得率為11.67 mg/g,繼續(xù)增加浸提時(shí)間,黃酮類化合物的得率不再增加[10]。所以選擇浸提時(shí)間為4、6及8 h為正交實(shí)驗(yàn)研究水平。

2.1.3 浸提溫度對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 浸提溫度對(duì)蜜柚葉總黃酮提取效果的影響結(jié)果如圖3所示,隨著浸提溫度的增加,總黃酮得率總體呈上升趨勢(shì),這是因?yàn)闇囟壬?溶劑粘度減小,浸提液及溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)增大,分子運(yùn)動(dòng)更加激烈,從而使得有效成分的溶解和滲透速度加快,黃酮的溶出速度隨之增大,得率提高[11-12]。但由圖可知,當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí),總黃酮得率增加不明顯,且有下降趨勢(shì),這可能是因?yàn)闇囟冗^高,導(dǎo)致部分黃酮類物質(zhì)分解的結(jié)果[13]。所以選擇浸提溫度為60、70及80 ℃為正交實(shí)驗(yàn)研究水平。

圖3 浸提溫度對(duì)蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜜柚葉總黃酮提取效果的影響結(jié)果如圖4所示,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,總黃酮得率呈現(xiàn)出顯著的先增加后降低的趨勢(shì),且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%左右時(shí),總得率達(dá)到最佳。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)在醇類溶劑中的溶解度大于在水中的溶解度[14]。當(dāng)浸提體系為乙醇-水體系時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)越大,黃酮類物質(zhì)的浸出率就越大[15]。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值,繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù),其他醇溶性雜質(zhì)的浸出效率也隨之增加,此時(shí),雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)力增大,從而使黃酮類物質(zhì)的提取率下降[16-17]。所以選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%及80%為正交實(shí)驗(yàn)研究水平。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)探究 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取料液比(A)、浸提時(shí)間(B)、浸提溫度(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)四個(gè)因素按照L9(34)正交表對(duì)蜜柚葉黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,四個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)蜜柚葉總黃酮提取得率的影響依次為:浸提溫度(C)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)>浸提時(shí)間(B)>料液比(A)。蜜柚葉黃酮提取最佳工藝條件為:A2B2C3D3，即料液比為 1∶30、浸提時(shí)間 6 h、浸提溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù) 80%。在以上優(yōu)化后工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),蜜柚葉黃酮得率為12.41 mg/g。

2.2 蜜柚葉黃酮的抗氧化活性及其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性

2.2.1 蜜柚葉黃酮對(duì)DPPH·、羥自由基及超氧陰離子的清除活性 DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,其分子中3個(gè)苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間障礙使位于分子中間的氮原子上不成對(duì)的電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對(duì)作用,從而能夠捕獲(清除)其他自由基[18]。DPPH·的清除反應(yīng)是一類基于電子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)。圖5表示蜜柚葉黃酮對(duì)DPPH·的清除活性,VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對(duì)DPPH·的清除活性均隨濃度的增加而升高。其中,在相同濃度下,VC對(duì)DPPH自由基的清除活性均高于沒食子酸,當(dāng)蜜柚葉黃酮濃度為2.5 mg/mL時(shí),其對(duì)DPPH自由基的清除率為57%。VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對(duì)DPPH·清除活性的IC50值分別為47.94 μg/mL、77.71 μg/mL、1.47 mg/mL。

圖5 蜜柚葉黃酮對(duì)DPPH·的清除作用Fig.5 DPPH· radical scavenging activities of flavonoids from Honey pomelo leaves

羥自由基是人體內(nèi)最活潑的自由基,它能夠殺死紅細(xì)胞,使DNA、多糖及細(xì)胞膜等物質(zhì)降解,但當(dāng)加入自由基清除劑以后,由它所致的有害效應(yīng)會(huì)明顯降低[19]。蜜柚葉黃酮對(duì)·OH的清除活性結(jié)果如圖6所示,VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對(duì)·OH的清除活性均呈一定的計(jì)量效應(yīng)關(guān)系,濃度越高,對(duì)·OH的清除活性越強(qiáng)。當(dāng)蜜柚葉黃酮的濃度為2.5 mg/mL時(shí),其對(duì)·OH的清除率為97%。VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對(duì)·OH清除活性的IC50值分別為0.36、0.54、1.04 mg/mL。

圖6 蜜柚葉黃酮對(duì)羥自由基的清除作用Fig.6 ·OH radical scavenging activities of flavonoids from Honey pomelo leaves

超氧陰離子與人體內(nèi)-OH結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA的損傷,從而破壞人體機(jī)能[20]。蜜柚葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除活性結(jié)果如圖7所示,相同濃度下,沒食子酸對(duì)超氧陰離子的清除活性高于VC。當(dāng)沒食子酸濃度為0.8 mg/mL時(shí)其對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)到99%。當(dāng)VC濃度為1.0 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)到97%。蜜柚葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除活性隨濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)蜜柚葉黃酮濃度為2.5 mg/mL時(shí)其對(duì)超氧陰離子的清除活性為79%。沒食子酸、VC及蜜柚葉黃酮對(duì)超氧陰離子清除活性的IC50值分別為:0.43、0.57、1.49 mg/mL。

圖7 蜜柚黃酮對(duì)超氧陰離子的清除活性flavonoids from Honey pomelo leaves

2.2.2 蜜柚葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性 蜜柚葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性結(jié)果如圖7所示,總體上,蜜柚葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性與別嘌呤醇抑制黃嘌呤氧化酶活性趨勢(shì)一致,均呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,即隨著濃度的增加,抑制活性增強(qiáng)。別嘌呤醇及蜜柚葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值分別為8.7 μg/mL、4.8 mg/mL。張雪等[21]研究了大血藤、鎖陽(yáng)、吳茱萸、木瓜、老鶴草五種中草藥水提及醇提物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用,除老鶴草水提及醇提物對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值小于4.8 mg/mL以外,其余4種中草藥的水提及醇提物抑制黃嘌呤氧化酶的IC50值均大于4.8 mg/mL,說明蜜柚葉黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性較一般中草藥都要強(qiáng)。

圖8 蜜柚黃酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性Fig.8 Effect of xanthine oxidase activity of flavonoids from sweet pomelo leaves

3 結(jié)論

通過工藝優(yōu)化,確定提取蜜柚葉黃酮的最佳工藝條件為:料液比為 1∶30、浸提時(shí)間 6 h、浸提溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。此條件下,黃酮得率可以達(dá)到12.41 mg/g。同時(shí)蜜柚葉黃酮對(duì)DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子清除活性的IC50值分別為1.47、1.04、1.49 mg/mL。與大血藤、鎖陽(yáng)、吳茱萸、木瓜等中草藥相比,蜜柚葉黃酮表現(xiàn)出較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制活性。蜜柚葉黃酮的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制機(jī)理還有待進(jìn)一步研究,本實(shí)驗(yàn)首次研究蜜柚葉黃酮的抗氧化活性及其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性,旨在為蜜柚葉的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

[1]李富華,劉冬,明建. 苦蕎麩皮黃酮抗氧化及抗腫瘤活性[J]. 食品科學(xué),2014,35(7):58-63.

[2]張德權(quán),臺(tái)建祥. 生物類黃酮的研究及應(yīng)用概況[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),1999(6):52-57.

[3]Kong S,Lee J. Antioxidants in milling fractions of black rice cultivars[J]. Food chemistry,2010,120(1):278-281.

[4]Dewanto V,Wu X,Adom K K,et al. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity[J]. Journal of agricultural and food chemistry,2002,50(10):3010-3014.

[5]周桂芬,呂圭源. 鐵皮石斛不同部位黃酮碳苷類成分及清除 DPPH 自由基能力比較研究[J]. 中國(guó)中藥雜志,2012 (11):1536-1540.

[6]張強(qiáng),辛秀蘭,楊富民,等. 紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能的變化[J]. 食品科學(xué),2016,37(3):6-11.

[7]Ren J,Zhao M,Shi J,et al. Purification and identification of antioxidant peptides from grass carp muscle hydrolysates by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2008,108(2):727-736.

[8]王曉. 核桃殼中黃嘌呤氧化酶抑制活性物質(zhì)的分離鑒定及構(gòu)效關(guān)系的研究[D]. 華南理工大學(xué),2015.

[9]許暉,孫蘭萍,張斌,等. 花生殼總黃酮乙醇提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(8):135-139.

[10]Chen L,Ding L,Yu A,et al. Continuous determination of total flavonoids in Platycladus orientalis(L.)Franco by dynamic microwave-assisted extraction coupled with on-line derivatization and ultraviolet-visible detection[J]. Analytica chimica acta,2007,596(1):164-170.

[11]唐津忠,魯曉翔,陳瑞芳. 金蓮花中黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué),2003,24(6):88-91.

[12]范菁華,徐懷德,李鈺金,等. 超聲波輔助提取花椒葉總黃酮及其體外抗氧化性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2010(6):22-28.

[13]蔣瓊鳳,溫?fù)碥?袁志輝. 半邊蓮總黃酮提取工藝及抑菌活性的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015(27):865-869.

[14]鄭曉濤. 菊芋葉總黃酮含量變化及其提取,純化,抗氧化性研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[15]武興菲. 肉桂總黃酮提取分離分析及抗氧化活性探討[J]. 醫(yī)藥衛(wèi)生,2015(11):37-41.

[16]陽(yáng)梅芳. 柚子黃酮類物質(zhì)提取,分離及生物特性研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué),2013.

[17]李全國(guó). 樂陵棗葉總黃酮的提取,分離純化,鑒定及其抗氧化活性研究[D]. 齊魯工業(yè)大學(xué),2014.

[18]Huang D,Ou B,Prior R L. The chemistry behind antioxidant capacity assays[J]. Journal of agricultural and food chemistry,2005,53(6):1841-1856.

[19]蔡仲軍,陳仕江,尹定華,等. 不同產(chǎn)地冬蟲夏草清除羥自由基作用的研究[J]. 中草藥,2004,35(1):57-59.

[20]趙靜,李玉琴,王芳喬,等. 6 種黃酮類化合物清除超氧陰離子自由基能力及其構(gòu)效關(guān)系[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2014,11(29):7-10.

[21]張雪,周英,管靜,等. 5 種中藥材提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2015(4):51-54.

Extraction of flavonoids fromHoneypomeloleaves and study on its antioxidant and uric acid reduction activities

ZHENG Ya-mei,REN Jiao-yan*,SHI Chuan-chao

(School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

In order to investigate the extraction processes of flavonoids fromHoneypomeloleaves and its antioxidant and uric acid reduction activities,the extraction conditions of flavonoids were optimized primarily by orthogonal array design. In addition,the DPPH·,hydroxyl free radical and superoxide anion free radical scavenging activities were determined to evaluate the antioxidant activity of the flavonoids and the inhibition of xanthine oxidase activity was determined to preliminary judging its uric acid reduction activity. Results indicated that optimal extraction processing parameters were the ratio of material to solvent of 1∶30(g/mL),ethanol concentration of 80%,extraction temperature of 80 ℃,extraction time of 6 h,the extraction efficiency of flavonoids fromHoneypomeloleaves was 12.41 mg/g. Meanwhile,in DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide anion scavenging assays,the IC50of the scavenging activities of flavonoids fromHoneypomeloleaves were 1.47,1.04 mg/mL and 1.49 mg/mL. The inhibition of xanthine oxidase assay illustrated that the flavonoids showed a certain degree of suppression effect of xanthine oxidase(IC50:4.8 mg/mL).

Honeypomeloleaves;flavonoids;antioxidant activity;uric acid reduction activity

2016-10-04

鄭亞美 (1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物化學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)與健康,E-mail:zheng386007@163.com。

*通訊作者:任嬌艷(1980-)，女，教授，研究方向：食品生物化學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)與健康，E-mail:jyren@scut.edu.cn。

廣東省自然科學(xué)杰出青年基金項(xiàng)目(S2013050013954)；“廣東特支計(jì)劃”科技青年拔尖人才項(xiàng)目(2014TQ01N645)；2016年廣東省攀登計(jì)劃項(xiàng)目(pdjh2016b0049)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)08-0262-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.042