銳孔法制備水牛乳活性肽微膠囊工藝優(yōu)化及體外釋放研究

袁靖琳,陳 燏,韋翠蘭,蘇海燕,梁曉琳,蔡 達(dá),李全陽,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.華南理工大不食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣西南寧 530004;3.廣西東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心,廣東廣州 510006)

銳孔法制備水牛乳活性肽微膠囊工藝優(yōu)化及體外釋放研究

袁靖琳1,陳 燏1,韋翠蘭2,蘇海燕3,梁曉琳1,蔡 達(dá)1,李全陽1,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;
2.華南理工大不食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣西南寧 530004;
3.廣西東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心,廣東廣州 510006)

為了減少胃腸道對(duì)抗氧化活性肽的分解并使其具有腸道緩釋效果,以海藻酸鈉、殼聚糖為壁材,用銳孔法制備水牛乳活性肽微膠囊。通過響應(yīng)面法優(yōu)化了海藻酸鈉溶液濃度、殼聚糖溶液濃度以及Ca2+濃度的工藝條件,并對(duì)制備的微膠囊進(jìn)行掃描電鏡觀察以及體外釋放檢測(cè)。結(jié)果表明:制備載水牛乳活性肽微膠囊的優(yōu)化工藝為：海藻酸鈉、殼聚糖和CaCl2溶液的濃度分別為1.28%、1.51%和2.20%(w/v),在此工藝條件下,活性肽的包埋率可達(dá)95.20%。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉-殼聚糖復(fù)合壁材載肽結(jié)構(gòu)完整緊實(shí)。體外緩釋實(shí)驗(yàn)表明,樣品在人工胃液(pH=2.0)中釋放量為7.98%,在人工腸液(pH=6.8)中作用12 h后的相對(duì)累計(jì)釋放量為89.41%,樣品表現(xiàn)出耐酸和良好的模擬腸道環(huán)境緩釋效果,制備的水牛乳活性肽微膠囊能夠較好的保護(hù)目標(biāo)肽、提高穩(wěn)定性、耐酸和緩釋效果。

水牛乳活性肽,銳孔法,微膠囊,體外釋放

黑白花奶牛的牛乳蛋白中包含許多具有生物學(xué)活性的肽段[1]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究的水牛乳蛋白水解物中也含有很多的活性肽,尤其是抗氧化活性肽。閉秋華用中性蛋白酶分別酶解水牛乳酪蛋白和乳清蛋白,超濾分離得到了多組具有抗氧化性的多肽[2];此外,Shanmugam[3]等人用胃蛋白酶酶解水牛乳酪蛋白,分離得到了11段具有抗氧活性的小肽;李玲[4]等人用堿性蛋白酶酶解酪蛋白得到一種肽粉,并用這種肽粉灌胃D-半乳糖致衰老小鼠,一定程度上提高了衰老小鼠的抗氧化能力。這些研究表明水牛乳乳源抗氧化肽具有良好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值,然而抗氧化肽不穩(wěn)定,易受環(huán)境影響而變質(zhì),口服時(shí)則易受消化道逆環(huán)境影響失去原有的功能性,這些因素在很大程度上阻礙了乳源抗氧化肽的市場(chǎng)推廣的進(jìn)程。因此,通過一定的工藝手段提高食源活性肽的穩(wěn)定性及其生物利用率則成了一個(gè)亟待解決的問題。

張路[5]用銳孔法以海藻酸鈉、氯化鈣以及其他輔料制備了包埋率為61.35%的載玉米多肽微膠囊;張生生等[6]用銳孔凝固浴法制備以海藻酸鈉、氯化鈣制備了包埋率為87.6%的載抗菌脂肽微膠囊,該微膠囊具有較好的腸液緩釋效果。在這些研究的基礎(chǔ)上,本研究選擇了以天然、無毒、生物相容性較好并具有抗菌性的大分子材料殼聚糖,與海藻酸鈉共為復(fù)合壁材,氯化鈣為凝固劑,采用無需有機(jī)溶劑、無需高速攪拌、設(shè)備簡單易操作且對(duì)芯材影響較小的銳孔法[7-8]制備水牛乳抗氧化肽微膠囊。以這兩種材料為復(fù)合壁材包埋目標(biāo)物的相關(guān)研究主要集中于藥物控釋緩釋等領(lǐng)域,從而達(dá)到緩釋和提高生物利用率的目的,如制備具有緩釋作用的載胰島素微球[9-11]、載疫苗微球[12]以及抗癌藥物微球[13]等,但在食品工業(yè)領(lǐng)域相關(guān)研究較少，且鮮見以這種復(fù)合壁材包埋水牛乳多肽的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探索一種新的載水牛乳多肽微膠囊制備工藝條件,以期為制備具有緩釋作用的活性肽食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖、海藻酸鈉 上海源葉生物科技有限公司;氯化鈣 天津科密歐試劑有限公司;冰醋酸、乙醇、85%磷酸 成都科龍?jiān)噭┯邢薰?胃蛋白酶(Potency=1∶3000)、胰蛋白酶(Potency>1∶250)、中性蛋白酶(酶活不低于60000 活力單位/g) 南京都萊生物技術(shù)有限公司。

UV5200型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;HL-2D定時(shí)數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司;VORTEX-5漩渦震蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 上海皓莊儀器有限公司;Phenom臺(tái)式掃描電鏡 Phenom-World公司;SBC-12離子濺射儀 中科科儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水牛乳活性肽制備 參照參考文獻(xiàn)方法[2,14],使用中性蛋白酶酶解水牛乳全蛋白進(jìn)行制備,樣品經(jīng)冷凍干燥、真空封裝,于-20 ℃環(huán)境中存放。

1.2.2 水牛乳活性肽微膠囊制備

1.2.2.1 微膠囊制備工藝 配制海藻酸鈉溶液(壁材A)、1%醋酸-殼聚糖溶液(壁材B),過夜溶脹,靜置。凝固液為相應(yīng)濃度的CaCl2溶液(C液)。精稱1.00 g凍干多肽粉均勻分散于50 mL壁材A中,同時(shí)將50 mL壁材B與50 mL凝固液C混合均勻作為凝固浴液。多肽-壁材A混合物通過恒流泵勻速泵入凝固浴液中,出口段有銳孔(Φ=0.45 mm)固化造粒,期間不斷攪拌,直至顆粒完成固化，過濾獲得膠粒微球并保留濾液。蒸餾水清洗微球表面除去表面殘留的多肽,用濾紙吸干表面水分,即得載肽濕微球。-80 ℃預(yù)凍,經(jīng)真空冷凍干燥,獲得載肽干微球,用于電鏡掃描觀察。將壁材A直接滴入凝固浴中制備空白微球,其余步驟同上。

1.2.2.2 包埋率及載肽量計(jì)算 用考馬斯亮藍(lán)法。取1.2.2.1中制載肽濕微球?yàn)V液1 mL與5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液混合均勻,在5 min內(nèi)于595 nm處測(cè)定吸光值得Ai。同樣取制空白濕微球?yàn)V液1 mL進(jìn)行檢測(cè)得A0,1.000 g多肽與100 mL凝固浴液充分混勻,取1 mL混合液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)吸光值得Aj;同時(shí)測(cè)定空白凝固浴的吸光值得Ac。用相對(duì)載肽率表示包埋率，計(jì)算公式如下:

式(1)

式中:Ai-載肽微球制備殘液吸光值;A0-空白微球制備殘液吸光值;Aj-1 g多肽-凝固浴吸光值;Ac-凝固浴吸光值。

式(2)

1.2.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定海藻酸鈉、殼聚糖以及CaCl2溶液的濃度(w/v)為需優(yōu)化因素。造粒方法同上。分別考察:

當(dāng)殼聚糖溶液濃度為1.50%,CaCl2溶液的濃度為2.00%時(shí),海藻酸鈉添加量(0.50%、0.75%、1.0%、1.25%、1.50%)對(duì)包埋率的影響;

當(dāng)海藻酸鈉溶液濃度為1.25%,CaCl2溶液的濃度為2.00%時(shí)，殼聚糖添加量(0、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%)對(duì)包埋率的影響;

當(dāng)海藻酸鈉溶液濃度為1.25%,殼聚糖溶液的濃度為1.50%時(shí),CaCl2溶液的濃度(1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%)對(duì)包埋率的影響。

1.2.2.4 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)后確定因素優(yōu)化水平范圍,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(見表1),并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels table of the experimental

1.2.3 水牛乳活性肽微膠囊特性表征

1.2.3.1 微膠囊掃描電鏡(SEM)分析 按優(yōu)化后的最佳工藝分別制備復(fù)合壁材載肽微球(Alg-CS-肽)和相應(yīng)空白微球。并按最佳工藝海藻酸鈉濃度制備海藻酸鈉單一壁材載肽微球(Alg-肽)和相應(yīng)空白微球。微球經(jīng)冷凍干燥,用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上,噴金后,用掃描電鏡進(jìn)行觀察。同時(shí)進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察,放大倍數(shù)為40倍。

1.2.3.2 微膠囊于人工胃腸液中緩釋情況分析 參照《中國藥典》(2010版)配制人工胃液及人工腸液[15]。

參照1.2.3.1的方法按最佳工藝制備空白微球(B-Alg-CS-MC)及載肽微球(B-Alg-CS-PP-MC)，并按最佳工藝海藻酸鈉濃度制備單一壁材空白微球(B-Alg-MC)及相應(yīng)載肽微球(B-Alg-PP-MC)。

模擬消化累計(jì)釋放曲線,參照張杰[16]的方法稍作修改:分別取1.00 g載肽微球(PP-MC)和相應(yīng)空白微球(MC),并按載肽量換算出相應(yīng)肽量(PP)。將PP-MC、MC及PP均置于100 mL人工胃液中消化。消化條件為:37 ℃,100 r/min。分別在0、0.5、1、2 h各取2 mL液體,4000 r/min,離心5 min,取1 mL上清液,按1.2.2.2方法測(cè)吸光值。每次取液后用空白人工胃液補(bǔ)足至100 mL。按式(3)計(jì)算相對(duì)釋放量。將經(jīng)過2 h模擬胃液消化的微球過濾,用蒸餾水洗凈附著的胃酶和肽并吸干水分,放入100 mL模擬腸液中。消化釋放量測(cè)定和計(jì)算同上。分別計(jì)算0、1、2、4、6、8、10、12 h的相對(duì)釋放量。

式(3)

式中:Ai-載肽微球相應(yīng)時(shí)間模擬胃/腸液上清液吸光值；Aj-空白微球相應(yīng)時(shí)間模擬胃/腸液上清液吸光值；At-對(duì)應(yīng)載肽量肽相應(yīng)時(shí)間模擬胃/腸液上清液吸光值；A0-相應(yīng)時(shí)間空白模擬胃/腸液上清液吸光值。

以消化時(shí)間為橫坐標(biāo),累計(jì)相對(duì)釋放量為縱坐標(biāo),制作載肽微球釋放曲線。所有測(cè)量平行三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別用SPSS 19.0和Design-Expert 8.0.6進(jìn)行相應(yīng)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 海藻酸鈉溶液濃度對(duì)包埋率的影響 海藻酸鈉溶液濃度對(duì)包埋率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 海藻酸鈉溶液濃度對(duì)包埋率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on peptides loading efficacy

由圖1可知,包埋率隨海藻酸鈉溶液濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。在0.50%～0.75%的范圍內(nèi)時(shí),微膠囊包埋率變化不大;在0.75%～1.25%的范圍內(nèi)時(shí),包埋率逐漸上升;在1.25%～1.50%的范圍內(nèi)時(shí),包埋率則逐漸下降,當(dāng)海藻酸鈉溶液濃度為1.25%時(shí)包埋率達(dá)到最大值。低濃度海藻酸鈉微球性狀不規(guī)則,過濾時(shí)容易破裂,降低了包埋率;而當(dāng)海藻酸鈉的濃度超過1.50%時(shí),肽粉只能均勻分散其中,但是高濃度的海藻酸鈉難以通過銳孔,形成的顆粒有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象,使得包埋率降低。因此,在本實(shí)驗(yàn)中,最適的海藻酸鈉溶液濃度在1.25%左右。

2.1.2 殼聚糖溶液濃度對(duì)包埋率的影響 殼聚糖溶液濃度對(duì)包埋率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 殼聚糖溶液濃度對(duì)包埋率的影響Fig.2 Effect of chitosan concentration on peptides loading efficacy

由圖2可知,微膠囊的包埋率隨殼聚糖溶液濃度增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)殼聚糖溶液濃度為1.50%時(shí),包埋率最大。殼聚糖濃度適當(dāng)增加可以提高包埋率,而濃度過高時(shí)使得微球軟塌易破裂,導(dǎo)致微膠囊包埋率降低。Anjani K等[17]報(bào)道,殼聚糖與海藻酸鈉的結(jié)合減少了正乙?；潭?可有效減小海藻酸鈉-鈣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的縫隙；張志辰等[18]則報(bào)道,殼聚糖濃度過高時(shí)會(huì)降低海藻酸鈣膜的機(jī)械強(qiáng)度,這一結(jié)果是在殼聚糖的伯胺基與海藻酸鹽分子鏈上的羧基結(jié)合完畢后,多余的帶電殼聚糖分子影響海藻酸鈣膜造成的。因而,在本實(shí)驗(yàn)中,最適的殼聚糖溶液濃度在1.50%左右。

2.1.3 CaCl2溶液濃度對(duì)包埋率的影響 CaCl2溶液濃度對(duì)包埋率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 CaCl2溶液濃度對(duì)包埋率的影響Fig.3 Effect of calcium chloride concentration on peptides loading efficacy

由圖3可知,微膠囊的包埋率隨著CaCl2溶液濃度增加呈先增大后減少的趨勢(shì)。當(dāng)CaCl2溶液濃度在1.00%～2.00%時(shí),包埋率隨著CaCl2溶液濃度的增加而增加;而當(dāng)CaCl2溶液濃度大于2.00%之后,包埋率隨CaCl2溶液濃度濃度增加而減小。當(dāng)CaCl2溶液濃度在2.00%時(shí),微膠囊的包埋率達(dá)到最大值。鈣離子的濃度較低時(shí)包埋率較低,此時(shí)海藻酸鈉除了交聯(lián)作用外,剩余的陰離子海藻酸多糖通過靜電作用與陽離子殼聚糖相互作用,此時(shí)形成的膜較薄,容易破裂;而當(dāng)鈣離子濃度高于最適濃度后包埋率呈降低趨勢(shì),海藻酸鈉進(jìn)入高度濃度鈣離子凝固浴迅速形成致密的凝膠膠束,這一結(jié)構(gòu)減少了殼聚糖與海藻酸鈉的結(jié)合,使得海藻酸-鈣膜的縫隙較多,也會(huì)降低包埋率,Gaserod等[19]早期也報(bào)道過鈣離子與殼聚糖競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合海藻酸鈉,以及過多的鈣離子會(huì)減少海藻酸鈉與殼聚糖的靜電結(jié)合作用。因此,在本實(shí)驗(yàn)中,最適CaCl2溶液濃度在2.0%左右。

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析Table 3 ANOVA for the response surface quadratic model

注:“*”表示顯著(p<0.05),“-”表示不顯著。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以包埋率為響應(yīng)值,對(duì)海藻酸鈉溶液濃度、殼聚糖溶液濃度以及CaCl2溶液濃度進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化,得到表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

對(duì)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸模型建立以及相關(guān)回歸方程方差分析,分析結(jié)果見表3。得到以響應(yīng)值Y包埋率(%),A:海藻酸鈉、B:殼聚糖、C:CaCl2建立的二次回歸方程:

Y=-160.382+298.805A-1.856B+59.0495C+44.26AB-13.8AC-5.97BC-130.712A2-14.348B2-7.378C2

從表3結(jié)果來看,一次項(xiàng)A(海藻酸鈉)、B(殼聚糖)及C(CaCl2)均對(duì)包埋率有顯著影響(p<0.05),其中A>C>B,A(海藻酸鈉)對(duì)包埋率影響顯著;二次交互項(xiàng)AB、AC、BC均對(duì)包埋率有顯著影響,且AB>AC>BC。

進(jìn)一步分析交互作用,由響應(yīng)曲面圖及等高線可知,AB、AC及BC的等高線均呈橢圓形,表明該三項(xiàng)因素兩兩交互作用明顯。其中AB的變化較另外兩項(xiàng)快,進(jìn)一步說明AB項(xiàng)對(duì)包埋率的影響較其它兩項(xiàng)更為明顯。

圖4 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)因素交互作用Fig.4 Interaction of experimental factors conditions on peptides loading efficacy

對(duì)所求的二次方程求導(dǎo),得到A=1.28%、B=1.51%、C=2.20%。即最優(yōu)工藝組合為:海藻酸鈉溶液濃度為1.28%,殼聚糖溶液濃度為1.51%,CaCl2溶液濃度為2.20%。對(duì)該工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到包埋率為95.20%±0.13%,在誤差允許范圍內(nèi)略高于預(yù)測(cè)值93.50%(RSD=1.27%),表明該模型準(zhǔn)確可信。同時(shí)還以最佳工藝制備了單一海藻酸鈉-CaCl2載肽微膠囊,測(cè)得其包埋率為85.32%±0.50%,比復(fù)合壁材的包埋率低10%左右。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合,亦說明復(fù)合壁材的選擇是合理且有意義的。

2.3 電鏡掃描

為了直觀反映微膠囊制備效果,分別采用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察,具體見圖5、圖6。

圖5 兩種微膠囊光學(xué)顯微鏡觀察圖(40×)Fig.5 Optical microscopy images of Alg microcapsules and Alg/CS microcapsules(40×)注:a:單一壁材海藻酸鈉空白微膠囊; b:復(fù)合壁材海藻酸鈉-殼聚糖空白微膠囊; c:單一壁材海藻酸鈉載肽微膠囊; d:復(fù)合壁材海藻酸-殼聚糖載肽微膠囊;圖6同。

圖6 兩種微膠囊掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy images of Alg microcapsules and Alg/CS microcapsules注：a:265×,b:245×,c:265×,d:290×。

經(jīng)冷凍干燥后,整體觀察對(duì)比觀察。由圖5可知單一壁材海藻酸鈉制備的微球表面凹凸粗糙,結(jié)構(gòu)松散,孔隙較大,而復(fù)合壁材海藻酸鈉-殼聚糖制備的微球表面平滑,結(jié)構(gòu)密實(shí)均一;由圖6可知,復(fù)合壁材海藻酸鈉-殼聚糖制備的微球幾乎無空隙,且微囊壁較厚無裂紋。殼聚糖的?；鶊F(tuán)修飾作用使得復(fù)合壁材微膠囊囊壁光滑,同時(shí)這種作用力使得鈣離子和海藻酸鈉羧酸根粒子基團(tuán)之間形成空間位阻,增加了疏水性,在這兩種作用力的共同作用下,復(fù)合壁材微膠囊的結(jié)構(gòu)致密均勻。Estevinho等[20]也報(bào)道,在制備VB12和VC微膠囊時(shí),海藻酸鈉的存在使得以殼聚糖為壁材的微球形態(tài)規(guī)則且表面更為光滑,內(nèi)容物更穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,由復(fù)合壁材組成的微囊結(jié)構(gòu)比單一壁材的結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定,能夠更好地保護(hù)目標(biāo)抗氧化肽。

2.4 體外釋放實(shí)驗(yàn)

單一壁材海藻酸鈉-CaCl2載肽微膠囊和復(fù)合壁材海藻酸鈉-殼聚糖-CaCl2載肽微膠囊在人工胃腸液中連續(xù)釋放情況的檢測(cè)結(jié)果見圖7。

圖7 載肽微膠囊在模擬胃腸液中連續(xù)釋放曲線Fig.7 Release profile of peptide microcapsules in SGF and SIF

由圖7可知,單一壁材載肽微膠囊經(jīng)模擬胃液(pH=2.0)消化作用2 h后,累計(jì)釋放了57.08%的多肽,且這一過程相當(dāng)快,而復(fù)合壁材微膠囊經(jīng)2 h的模擬胃液消化后,僅釋放了7.89%,緩慢釋放;進(jìn)入模擬腸液(pH=6.8)后,單一壁材載肽微膠囊釋放速率減緩,4 h后釋放趨于平穩(wěn),經(jīng)12 h的模擬腸液消化后,累計(jì)釋放量為86.96%。與單一壁材不同的是,復(fù)合壁材載肽微膠囊進(jìn)入模擬腸液后,1 h時(shí)累計(jì)釋放量為32.05%,迅速釋放,是2 h模擬胃液累積釋放量的4倍,10 h后,釋放趨于平穩(wěn),經(jīng)模擬腸液消化作用12 h后,累積釋放量達(dá)到89.41%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以海藻酸鈉和殼聚糖為復(fù)合壁材包埋水牛乳抗氧化肽可以較好地抵抗模擬胃液的消化,而在較為溫和的模擬腸液中則能緩慢釋放。Mukhopadhyay P等[9]報(bào)道經(jīng)殼聚糖-海藻酸鈉包埋的胰島素對(duì)環(huán)境pH敏感,在酸性條件下幾乎不釋放,在中性環(huán)境中可以緩慢釋放,經(jīng)過復(fù)合壁材包埋的胰島素經(jīng)口服可以有效延長胰島素在糖尿病模型小鼠體內(nèi)降血糖的時(shí)間;李瑞偉等[12]用海藻酸鈉-殼聚糖制備的草魚出血病細(xì)胞疫苗在pH2.3的鹽酸溶液處理3 h累計(jì)釋放量僅為15.57%,而在pH7.4的PBS中3 h釋放量為30%,且在14 d后才基本釋放完全,較好地達(dá)到了讓疫苗緩慢釋放的用藥需求。綜合分析可知，以殼聚糖-海藻酸鈉為復(fù)合壁材制備的載水牛乳活性肽微膠囊也具備在體內(nèi)緩釋從而提高該活性肽生物利用率的潛能。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到銳孔法制備載水牛乳多肽微膠囊最佳工藝組合:海藻酸鈉溶液濃度1.28%,殼聚糖溶液濃度1.51%,CaCl2溶液濃度2.20%，包埋率為95.20%。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)這種復(fù)合壁材載肽微膠囊結(jié)構(gòu)緊密均勻。在模擬體外消化實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)人工胃液消化2 h,累計(jì)釋放量僅為7.89%,經(jīng)腸液消化12 h后,釋放量為89.41%,表現(xiàn)出耐酸和緩釋功能,對(duì)比分析認(rèn)為該技術(shù)較好地達(dá)到了讓抗氧化活性肽在腸道環(huán)境內(nèi)緩釋并發(fā)揮作用的目的，所需壁材配制的濃度相對(duì)較低,有利于工業(yè)化推廣。該項(xiàng)技術(shù)為生產(chǎn)高利用價(jià)值的水牛乳活性肽產(chǎn)品提供了一種新方法,也將為相關(guān)食品功能性成分的產(chǎn)業(yè)化提供了一項(xiàng)新的技術(shù)手段。

[1]梁曉琳,譚凱燕,蘇海雁,等. 乳源抗氧化活性肽的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014(9):2776-2782.

[2]閉秋華.水牛乳抗氧化活性多肽的研究[D]. 南寧:廣西大學(xué),2012.

[3]Shanmugam V P,Kapila S,Sonfack T K,et al. Antioxidative peptide derived from enzymatic digestion of buffalo casein[J]. International Dairy Journal,2015,42:1-5.

[4]李玲,唐艷,農(nóng)皓如,等. 水牛乳多肽對(duì)衰老模型小鼠機(jī)體抗氧化作用的研究[J]. 食品科技,2012(9):62-65.

[5]張路.銳孔法和復(fù)合凝聚法制備玉米肽微膠囊[D]. 長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[6]張生生,閆靜芳,陸兆新,等. 銳孔凝固浴法制備表面活性肽微膠囊[J]. 食品工業(yè)科技,2015(12):221-225.

[7]王勇,解玉冰,馬小軍. 殼聚糖/海藻酸鈉生物微膠囊的研究進(jìn)展[J]. 生物工程進(jìn)展,1999(2):14-17.

[8]劉欣,郭星堯,韓亞,等. 海藻酸鈉為囊材銳孔法制備鐵葉綠酸鈉微囊[J]. 現(xiàn)代食品科技,2009(9):1043-1045.

[9]Mukhopadhyay P,Chakraborty S,Bhattacharya S,et al. pH-sensitive chitosan/alginate core-shell nanoparticles for efficient and safe oral insulin delivery[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,72:640-648.

[10]楊利芳.胰島素的海藻酸鹽-殼聚糖微球載體制備和口服給藥研究[D]. 西安:西北大學(xué),2007.

[11]Tahtat D,Mahlous M,Benamer S,et al. Oral delivery of insulin from alginate/chitosan crosslinked by glutaraldehyde[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,58:160-168.

[12]李瑞偉,曾令兵,張輝,等. 草魚出血病細(xì)胞疫苗微囊制備與體外釋放研究[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2013(2):212-218.

[13]王曉琴.小球藻抗腫瘤多肽的分離及其微囊化研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué),2012.

[14]鐘興業(yè).水牛乳乳清蛋白抗氧化肽的分離純化及產(chǎn)品開發(fā)[D]. 南寧:廣西大學(xué),2014.

[15]黃財(cái)順,李寶才,向誠. 人工胃腸液模型在藥物穩(wěn)定性研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015(10):1836-1841.

[16]張杰.蛋白類藥物海藻酸鹽微膠囊的制備及體外釋放行為的研究[D].大連:大連理工大學(xué),2007.

[17]Anjani K,Kailasapathy K,Phillips M. Microencapsulation of enzymes for potential application in acceleration of cheese ripening[J]. International Dairy Journal,2007,17(1):79-86.

[18]張志辰,王英,董明盛,等. 殼聚糖-海藻酸鈉液芯微膠囊機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)化研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(1):268-269.

[19]Gaserod O,Smidsrod O,Skjak-Braek G. Microcapsules of alginate-chitosan--I. A quantitative study of the interaction between alginate and chitosan[J]. Biomaterials,1998,19(20):1815-1825.

[20]Estevinho B N,Carlan I,Blaga A,et al. Soluble vitamins(vitamin B12and vitamin C)microencapsulated with different biopolymers by a spray drying process[J]. Powder Technology,2016,289:71-78.

Optimization of preparation process of buffalo milk active peptides microspheres by piercing method andinvitroreleasing behavior of the microcapsules

YUAN Jing-lin1,CHEN Yu1,WEI Cui-lan2,SU Hai-yan3,LIANG Xiao-lin1,CAI Da1,LI Quan-yang1,*

(1.College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China; 2.Guangxi ASEAN Food and Drug Safety Inspection and Testing Center,Nanning 530004,China; 3.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

In order to reduce the decomposition of the antioxidant peptide in the gastrointestinal tract and to have a sustained release behavior,encapsulated buffalo milk antioxidant peptides were prepared by piercing method using sodium alginate and chitosan as the shell. Based on peptides loading efficacy,and determined by one-factor experimental results,operating parameters as sodium alginate concentration,chitosan concentration and calcium chloride concentration were optimized by response surface methodology. The prepared microspheres were subjected by scanning electron microscopy and researched on itsinvitroreleasing behavior. The results showed that the optimal operating parameters were 1.28%,1.51%,and 2.20%(w/v)for sodium alginate concentration,chitosan concentration and calcium chloride,respectively. Upon the optimal conditions,the experiment led to an encapsulated efficacy of 95.20%. Scanning electron microscopy showed that the alginate-chitosan microcapsules had compact structure. Theinvitrorelease studies showed that the release rate was only 7.98% in the simulated gastric buffer(pH=2.0),and 89.41% in simulated intestinal buffer(pH=6.8). It showed that the sample had an acid-resistant and good slow-release behavior in simulated intestinal buffer. These results conclusively suggested that encapsulated buffalo mike antioxidant peptides by this process can protect the peptides,and improve its stability,acid resistance and sustained release behavior.

buffalo milk antioxidant peptides;piercing method;microcapsules;invitrorelease

2016-10-11

袁靖琳(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：功能性食品加工原理與工藝，E-mai:c535317194@163.com。

*通訊作者:李全陽(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)與健康長壽，E-mail:liquanyang@gxu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助(31371762)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)08-0227-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.036