分光光度法分析水果酵素中功效酶活性的研究

陳 爽,朱忠順,高妍妍,朱顯峰

(河南大學生命科學學院生物工程研究所,河南開封 475004)

分光光度法分析水果酵素中功效酶活性的研究

陳 爽,朱忠順,高妍妍,朱顯峰*

(河南大學生命科學學院生物工程研究所,河南開封 475004)

目的:利用分光光度法分別測定水果酵素中多種功效酶的活性。方法:借助分光光度計,采用3,5-二硝基水楊酸法、福林法、銅皂法和鄰苯三酚終止法分別對液狀水果酵素中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及超氧化物歧化酶的活力進行測定。結果:液狀水果酵素中淀粉酶活力為1.968 U/mL,蛋白酶活力為5.421 U/mL,脂肪酶活力為1.106 U/mL,超氧化物歧化酶活力為10.758 U/mL。結論:液狀水果酵素中SOD酶活性最高,蛋白酶次之,淀粉酶和脂肪酶活性較低;后續(xù)實驗中可優(yōu)化發(fā)酵條件來提高其中的淀粉酶與脂肪酶活力。

水果酵素，淀粉酶,蛋白酶,脂肪酶,超氧物歧化酶,酶活力

“諾貝爾化學獎得主波以爾教授說:如果人像燈泡,酵素就是電流,沒有電流(酵素)燈泡就不亮。沒有酵素就沒有生命”[1]。酵素有個正式的名字——酶,它的產(chǎn)生類似釀酒,由微生物以水果為底物發(fā)酵產(chǎn)生;并且在微生物代謝的過程中產(chǎn)生了多種活性物質,如各種有機酸、酚類、氨基酸、維生素、礦物質、酶等[2]。身體中酵素的多少及其活性高低和人體的衰老與疾病息息相關。隨著年齡的增加,人體內(nèi)的酵素數(shù)量與活力都在下降[3]。而液狀水果酵素的制作衛(wèi)生環(huán)保,因此,可通過食用酵素來調(diào)節(jié)體內(nèi)酶的含量,進而預防現(xiàn)代文明病、解酒護肝、美容[4]。另一方面,酵素在食品和醫(yī)藥等領域中具有很廣泛的應用,一些生物酵素產(chǎn)品開始應用于農(nóng)牧業(yè)中[5-7]。

功效酶是水果酵素中的主要活性物質之一,其中,蛋白酶可水解蛋白質肽鏈,食物攝取的蛋白質可以被體內(nèi)的蛋白酶分解為易于被人體吸收的氨基酸,增加體內(nèi)的營養(yǎng)吸收;在面包生產(chǎn)中能改變面筋性能[8]。其中胰蛋白酶可以使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散,胃蛋白酶能消化食物中的蛋白質,如向豆餅飼料中添加蛋白酶,可以增強保育豬對豆餅中氨基酸的消化[8]。淀粉酶通常能夠把糖類催化水解為易于人體吸收利用的小分子物質,對于動物包括人類有增強消化的功能。據(jù)孟慶紅報道,α-淀粉酶在面包生產(chǎn)工藝中有助于面包的起發(fā),在焙烤工藝中可增大面包體積、提高面包柔軟度、延緩面包老化速度[9]。有文獻指出一些耐熱性相對較低的細菌α-淀粉酶是有效的抗老化劑[10]。脂肪酶能夠逐步將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸,也可非專一降解殼聚糖以及水-有機界面間的不溶底物[11-12];超氧物歧化酶(SOD)是生物體系中抗氧化酶系的重要成員,專一催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應,有效防御生物體內(nèi)活性氧對機體的傷害,可作為食品抗氧化劑或蔬菜水果的保鮮劑,對自身免疫病、心腦血管疾病等都有顯著療效[13-14],還可延緩皮膚衰老、祛色斑[9]。

功效酶的活力是水果酵素的主要質量指標,目前對酵素中功效酶的活性檢測較少,其中有相關文獻報道了微生物酵素中3種功效酶的活力,然而其種類不夠全面[15]。本文系統(tǒng)的研究了水果酵素中主要功效酶的活力,完善了酶的測定種類及液狀水果酵素中酶活性與樣品濃度的關系。測定水果酵素功效酶的活性,可以更加有據(jù)的評價酵素的質量,提高人們對酵素的認可度,若能通過使用水果酵素來增加各種酶的功效,將對開發(fā)利用水果酵素保健食品、日化產(chǎn)品、化妝品、醫(yī)藥及環(huán)境治理的應用等有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國產(chǎn)紅提、紅富士蘋果、庫爾勒香梨、香橙、蜜柚、國產(chǎn)火龍果、香蕉、檸檬、獼猴桃、白砂糖 均為市售優(yōu)品;麥芽糖、可溶性淀粉、氫氧化鈉、硫酸銨、檸檬酸、檸檬酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鈉、Folin-酚、三氯乙酸、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、L-酪蛋白、L-酪氨酸、醋酸銅、吡啶、油酸、甲苯、鹽酸、Tris、鄰苯三酚、抗壞血酸 以上試劑均為分析純;金龍魚精煉一級大豆油 市售。

Eppendorf 5810R臺式高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司;INESA 752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;其他儀器 驗室常規(guī)儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 液狀水果酵素的制備 將水果洗凈、晾干后分別稱重,其中國產(chǎn)紅提300 g,紅富士蘋果600 g,庫爾勒香梨250 g,香橙250 g,蜜柚250 g,國產(chǎn)火龍果250 g,香蕉100 g,檸檬200 g,獼猴桃200 g。將白砂糖、水果和水按照1∶8∶10的比例放入發(fā)酵罐,把罐體密封好置于陰涼處(室溫25～30 ℃)發(fā)酵,每隔3 d于無菌操作臺中通氣一次,實驗過程中通過紫外照射操作臺避免染菌,罐體表面及取樣口用75%酒精消毒,靜置發(fā)酵30 d。對發(fā)酵完成的液狀水果酵素置于超凈工作臺中進行無菌取樣,以4000 r/min、6 ℃條件下離心10 min后取上清液,按7∶13(v∶v)加入飽和硫酸銨,4 ℃條件下鹽析2 h后的上清液即為粗酶液,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 淀粉酶活力的測定

1.2.2.1 標準曲線的制作 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麥芽糖,而麥芽糖與3,5-二硝基水楊酸反應生成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸,可在520 nm測定其吸光度,從而計算出發(fā)酵液中淀粉酶活力[15]。按照表1的操作,在波長520 nm處測定溶液的吸光度,以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

表1 淀粉酶標準曲線的制作Table 1 The standard curve making of amylase

1.2.2.2 活力的測定 分別將0.5 mL磷酸緩沖液、粗酶液于50 ℃水浴中預熱3 min后混勻，加入2 mL 1%的淀粉溶液，50 ℃水浴反5 min立即加入4 mL已在沸水浴中預熱的3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后于沸水浴中反應10 min；以1 mL蒸餾水代替麥芽糖標準液，作空白實驗。按標準曲線計算酶的濃度，然后以靳利娥[16]等的公式計算酶活力(U/mL)，如下：

X=c×V×n

式中，X為淀粉酶活力，U/mL；c為酶液中麥芽糖的濃度，μmol/mL；V消耗的粗酶液的體積，mL；n為酶液的稀釋倍數(shù)。

1.2.3 蛋白酶活力的測定

1.2.3.1 標準曲線的制作 參照GBT 23527-2009《蛋白酶制劑》[17],試劑的添加如表2所示，40 ℃水浴20 min,在波長680 nm處測得反應液的吸光度,以L-酪氨酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

表2 蛋白酶標準曲線的制作Table 2 The standard curve making of protease

1.2.3.2 活力的測定 分別取40 ℃預熱5 min的1%酪蛋白與經(jīng)同樣預熱的不同濃度粗酶液1 mL,于試管中40 ℃水浴反應10 min后,立即依次加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL,搖勻后靜置10 min,用慢速定性濾紙進行過濾,取濾液1 mL依次加入5 mL Na2CO3溶液與1 mL Folin-試劑,40 ℃水浴顯色20 min后,在680 nm處測定吸光度值。對照實驗測定方法同上,唯在反應之前要先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL,使酶失活。參照標準曲線,計算酵素中蛋白酶的活力[18]。

1.2.4 脂肪酶活力的測定

1.2.4.1 標曲的制作 脂肪酶活力采用銅皂法進行測定[19]。按照表3添加試劑混合攪拌3 min后，4000 r/min離心10 min,取上層有機相測710 nm處吸光度值,以吸光度對油酸濃度作圖得到脂肪酶的標準曲線。

表3 脂肪酶標準曲線的制作Table 3 The standard curve making of lipase

1.2.4.2 活力的測定 根據(jù)脂肪酶分解大豆油產(chǎn)生的油酸分子與醋酸銅中的Cu2+生成綠色的絡合物,以4000 r/min轉速離心10 min后取上層有機相在710 nm處測定吸光度。分別取37 ℃水浴預熱5 min的3 mL磷酸鹽緩沖液與1 mL大豆油,混合磁力攪拌10 min,立即加入0.1 mL粗酶液,攪拌2 min后加8 mL甲苯,終止反應,同時萃取生成的脂肪酸。將反應液4000 r/min離心10 min,取上層有機相4 mL加入1 mL 5%醋酸銅顯色劑,磁力攪拌3 min,同條件離心10 min,取上層有機相,在波長710 nm處測其吸光度。以不含脂肪酶的空白溶液作參比,對照脂肪酸吸光度標準曲線,即可求得脂肪酸的濃度。

將一定條件下,每分鐘釋放出1 μmol脂肪酸的酶量定義為1個脂肪酶活力單位(U)。脂肪酶活力的計算參照江慧芳[19]的方法進行,如下公式:

X=(cV1)/(tV2)

式中,X為脂肪酶活力,U/mL;c為脂肪酸的濃度,μmol/mL;V1為脂肪酸溶液的體積,mL;t為作用時間,min;V2為消耗的粗酶液的體積,mL。

1.2.5 超氧物歧化酶(SOD)的活力測定 采用鄰苯三酚終止法[20-21],當鄰苯三酚自氧化反應后,于25 ℃水浴中迅速加入5%維生素C溶液,立即混勻、靜置,以終止自氧化反應,然后再測定反應液在325 nm處的吸光度。其中鄰苯三酚自氧化速率與SOD活性的測定依表4進行;SOD活力的計算參照許雅娟[21]的方法,如下公式:

X=(A0-Ai)/A0×18/V×N

式中,X為SOD活力,U/mL;A0為鄰苯三酚的自氧化率;Ai為反應液的吸光度;V為消耗的粗酶液的體積,mL;N為粗酶液的稀釋倍數(shù)。

表4 鄰苯三酚自氧化速率的測定Table 4 The detection of pyrogallol oxidation rate

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測得的各實驗數(shù)據(jù),由酶活力公式計算出各種酶的活力,經(jīng)Origin軟件進行數(shù)據(jù)分析,并選擇一組線性相關較高的數(shù)據(jù),即r在0.885～0.999范圍內(nèi)的一組數(shù)據(jù)繪制酶活力隨粗酶液濃度的變化曲線。

2 結果與分析

2.1 淀粉酶活力測定

2.1.1 標準曲線的制作 在波長520 nm處測得反應液的吸光度,以加入麥芽糖的質量含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線y=0.41167x-0.02252,R2=0.99724,見圖1。

圖1 麥芽糖標準曲線Fig.1 The standard curve of maltose

2.1.2 淀粉酶活力測定 以可溶性淀粉為底物,利用分光光度法測得淀粉酶活性,繪得各組酶活力測定曲線,由圖2可知,淀粉酶活性隨樣品濃度的增長而快速增長,當酶液濃度為10%左右時,淀粉酶活性最高,為1.968 U/mL。之后酶活性趨于穩(wěn)定,可能是底物濃度太低,添加的酶量已將其完全催化所致,有待以后研究。

圖2 淀粉酶活性測定曲線Fig.2 The activity curve of amylase

2.2 蛋白酶活力測定

2.2.1 標準曲線的制作 借助分光光度計測得680 nm處的標準酪氨酸吸光度值,繪制酪氨酸標準曲線y=0.01061x+0.00595,其中R2=0.99928,說明酪氨酸與產(chǎn)物——藍色鉬藍和鎢藍的混合物呈現(xiàn)很好的線性關系,可以用此方法進行蛋白酶活力的測定,見圖3。

圖3 酪氨酸標準曲線Fig.3 The standard curve of tyrosine

2.2.2 蛋白酶活力測定 以L-酪蛋白為底物,采用分光光度法測得蛋白酶活性測定曲線,由圖4可知,隨酶液濃度的增加,蛋白酶活性基本呈線性、穩(wěn)定增長,當粗酶液濃度為12%時,蛋白酶活力達到5.421 U/mL;因此可通過改變酵素液濃度的方式來改變其中的蛋白酶活力,進而可選擇不同濃度來應用于食品、化妝品及其他領域。由此也證明用酪氨酸做底物、以福林法測定水果酵素中蛋白酶的活力方法簡便,不易使液體狀態(tài)中的酶失活,結果可信度高。

圖4 蛋白酶活性測定曲線Fig.4 The activity curve of protease

2.3 脂肪酶活力測定

2.3.1 標準曲線的制作 實驗中分別以75%酒精、無水乙醇及正己烷來作為油酸溶液的溶劑,其中只有后者可以很好的相容,另兩者均出現(xiàn)不同程度的分層,不利于實驗的進行,因此選用正己烷作溶劑來進行實驗。通過測定油酸-正己烷溶液與醋酸銅的反應液在710 nm處的標準油酸吸光度值,得到油酸的標準曲線y=0.0653x+0.2728,其中R2=0.98461,線性良好,可以由此來測定脂肪酶的活力,如圖5。

圖5 脂肪酶標準曲線Fig.5 The standard curve of oleic acid

2.3.2 脂肪酶活力測定 以市售大豆油為底物,采用分光光度法測得脂肪酶活力的變化曲線,由圖6可知,雖然脂肪酶活力隨酶液濃度的升高而遞增,但是水果酵素中脂肪酶活力依然很低,當粗酶液濃度為12%時,脂肪酶活力僅能達到1.106 U/mL,因此可對酵素液進行濃縮,來增加脂肪酶的活力,或者以后優(yōu)化實驗條件來提高水果酵素中脂肪酶的活力,進而擴大其在化妝品、保健產(chǎn)品、環(huán)境治理等方面的應用性。

圖6 脂肪酶活性測定曲線Fig.6 The activity curve of lipase

2.4 SOD活力測定

以5%的VC為底物,在325 nm處用鄰苯三酚終止法得SOD酶活性測定曲線,酶活力變化由圖7可知,隨著樣品濃度的增加,SOD酶活性基本呈線性增長(r=0.99);水果酵素濃度越高,其中的SOD活力越大;當粗酶液濃度為12%時,液狀水果酵素SOD活力達到10.758 U/mL,即對超氧陰離子的清除能力很強,證明液狀水果酵素的抗氧化能力較好。本研究可為大力開發(fā)微生物蛋白酶與SOD這一條很有前景的產(chǎn)業(yè)方向做好鋪墊。

圖7 SOD酶活性測定曲線Fig.7 The activity curve of SOD

3 結論

本實驗通過對液狀水果酵素中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、SOD酶活力的測定,發(fā)現(xiàn)水果酵素中淀粉酶活力為1.968 U/mL,蛋白酶活力為5.421 U/mL,脂肪酶活力為1.106 U/mL,SOD酶活力為10.758 U/mL。其中SOD活性較高,蛋白酶次之,淀粉酶和脂肪酶活性較低;水果酵素中脂肪酶活力雖然較低,但可對酵素液進行濃縮,來線性增加脂肪酶的活力,提高其在去污、降脂等方面的應用性。直接測定液體酵素中功效酶的活力,避免了對產(chǎn)品加工過程中可能造成的酶活性改變,使實驗結果準確度更高,能為酵素的應用奠定更科學的理論基礎。

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Detection of efficacy enzyme activity in ferments of fruits by spectrophotometric method

CHEN Shuang,ZHU Zhong-shun,GAO Yan-yan,ZHU Xian-feng*

(College of Life Sciences Institute of Biological Engineering,Henan University,Kaifeng 475004,China)

Abjective:The efficacy enzyme activity in ferments of fruits was detected by spectro-photometric. Methods:In this study,by means of 3,5-dinitrosalicylic acid,folin method,copper soap method and pyrogallol autoxidation method,the activies of amylase,protease,lipase,and superoxide dismutase of fruit enzymes was performed respectively by a spectrophotometer. Results:The activities of amylase,protease,lipase and superoxide dismutase was 1.968 ,5.421,1.106,10.758 U/mL of fruit enzymes,respectively. Conclusion:The activities of superoxide dismutase was highest,then was protease activities,the activities of amylase and lipase in fruit-ferments was lower than them. The results obtained in this study should be helpful for optimum fermentation condition in order to receive a high activity in further research.

ferments of fruits;amylase;protease;lipase;superoxide dismutase;enzyme activity

2016-08-29

陳爽(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：生物物質分離，E-mail：chans_9009@163.com。

*通訊作者:朱顯峰(1973-)，男，教授，主要從事微生物與生化藥學方面的研究，E-mail：zhuxf73@163.com。

教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目(20124103120002)；河南省科技攻關計劃項目(132102310421)；河南大學研究生優(yōu)秀學位論文培育計劃(理學碩士)(Y1425010)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0218-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.034