基于不同發(fā)酵方法制作的曲拉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

郭 婷,張 健,楊貞耐

(北京工商大學(xué)，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

基于不同發(fā)酵方法制作的曲拉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

郭 婷,張 健,楊貞耐*

(北京工商大學(xué)，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

采用頂空-固相微萃取(HS-SPME)方法對傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉與商品發(fā)酵劑制作的曲拉樣品進(jìn)行預(yù)處理,利用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)檢測樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分。經(jīng)NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合文獻(xiàn)對照,從傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉中檢出29種揮發(fā)性風(fēng)味成分,商品發(fā)酵劑制作的曲拉中檢出53種,這些揮發(fā)性成分中主要包括酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、烴類、芳香類。不同發(fā)酵方法制作的曲拉中風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量都存在一定的差異性,這也是使用相同原料不同發(fā)酵方法制作的曲拉產(chǎn)生特別的風(fēng)味的主要原因。

曲拉,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS),固相微萃取(SPME),揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

曲拉是一種藏族群眾喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,是牦牛乳經(jīng)過脫脂、發(fā)酵、加熱、瀝水、晾曬而生產(chǎn)出的傳統(tǒng)奶酪產(chǎn)品。與牦牛鮮乳相比,曲拉具有容易貯藏、方便運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn),曲拉中蛋白質(zhì)含量高達(dá)75.0%以上,脂肪含量為4.0%～7.0%,營養(yǎng)價(jià)值極高[1-2],且具有可以調(diào)節(jié)人體腸道微生物,改善腸道菌群的作用[3]。千百年以來,曲拉作為藏族地區(qū)人民的傳統(tǒng)食品,與牧民的生產(chǎn)生活密切相關(guān)。然而,到目前為止,牧區(qū)主要還是沿用酸引子作為曲拉發(fā)酵劑,酸引子中微生物群系非常復(fù)雜,而且發(fā)酵的溫度無法有效控制,適宜多種微生物生長繁殖,除進(jìn)行乳酸發(fā)酵外,還有其他微生物作用[4],因而導(dǎo)致發(fā)酵緩慢,脂肪易氧化酸敗,酪蛋白沉淀不完全等問題[5-6]。

風(fēng)味是評價(jià)發(fā)酵乳制品的重要指標(biāo),是影響多數(shù)消費(fèi)者選擇功能性食品的首要因素[7]。發(fā)酵方法的選擇往往決定產(chǎn)品的風(fēng)味特性,因此不同發(fā)酵方法制作的曲拉風(fēng)味特性和風(fēng)味形成機(jī)理一直是乳制品研究的熱點(diǎn)之一[8]。本實(shí)驗(yàn)通過對兩種發(fā)酵方法制作的曲拉揮發(fā)性成分的對比分析,找出乳酸乳球菌發(fā)酵劑發(fā)酵制作的曲拉不同于傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉的揮發(fā)性成分,并通過比較差異揮發(fā)性成分,初步說明不同發(fā)酵方法對曲拉風(fēng)味的影響,為生產(chǎn)高品質(zhì)曲拉提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳 采集于青海牧區(qū);商品發(fā)酵劑 乳酸乳球菌乳酸亞種和乳脂亞種,科漢森公司。

PL203電子天平 梅特利-托利多(上海)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海-恒科技有限公司;固相微萃取手動進(jìn)樣手柄、DVB-CAR-PDMS(2 cm,50/30 μm)纖維頭 美國Supelco公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent公司。

表1 氣質(zhì)聯(lián)用分析揮發(fā)性成分Table 1 GC-MS analysis of volatile compounds

續(xù)表

注:-:表示未檢出。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 曲拉樣品制作方法 傳統(tǒng)自然發(fā)酵曲拉工藝:原料乳過濾(60～80目濾網(wǎng),或3～4層紗布)→脫脂(4500～5000 r/min,5 min,奶油分離機(jī))→殺菌→酸引子發(fā)酵(15～25 ℃,15～28 h)→熱凝(63 ℃,30 min)→脫水(重力擠壓脫水)→干燥→包裝貯藏[4]。

商品發(fā)酵劑制作曲拉工藝:原料乳過濾(60～80目濾網(wǎng),或3～4層紗布)→脫脂(4500～5000 r/min,5 min,奶油分離機(jī))→殺菌→商品發(fā)酵劑發(fā)酵(15～25 ℃,15～28 h)→熱凝(63 ℃,30 min)→脫水(重力擠壓脫水)→干燥→包裝貯藏[4]。

1.2.2 頂空-固相微萃取操作方法 準(zhǔn)確稱取5 g曲拉樣品,加入1 μL 9 μg/mL的二甲基戊酸作內(nèi)標(biāo)于40 mL氣相頂空樣品瓶中,將恒溫水浴調(diào)至80 ℃,待溫度穩(wěn)定后,將樣品瓶放于恒溫水浴,預(yù)熱平衡30 min,將已老化好的SPME針頭穿過樣品瓶密封瓶墊,于樣品瓶頂空部分伸出固相萃取頭,靜置萃取30 min,收回固相萃取頭,取出萃取裝置,待氣相色譜儀處于準(zhǔn)備狀態(tài)后,將SPME針頭插入進(jìn)樣口,伸出固相萃取頭,于250 ℃條件下解吸5 min。

1.2.3 GC-MS分析 色譜柱:DB-WAX 毛細(xì)管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;

升溫程序:初始溫度,40 ℃,保持2.5 min,以5 ℃/min升溫到200 ℃,再以10 ℃/min升溫到230 ℃,保持5 min。載氣(He),恒定流速為3 mL/min,進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(electron impact,EI)離子源,電子能量70 eV,傳輸線溫度280 ℃,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,質(zhì)量掃描范圍35～400 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)分析

揮發(fā)性成分分析:運(yùn)用NIST14譜庫檢索,保留匹配度大于或等于800的成分;通過計(jì)算保留指數(shù)結(jié)合文獻(xiàn)保留指數(shù)進(jìn)一步對化合物進(jìn)行定性?；衔锒?采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,通過峰面積比值計(jì)算各組分含量。

數(shù)據(jù)分析:每個(gè)樣品均設(shè)3次重復(fù),數(shù)據(jù)以均值±方差表示,采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行方差分析,p>0.05表示差異不顯著,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方法制作的曲拉揮發(fā)性成分GC-MS檢測結(jié)果

傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉1、2、3,與商品發(fā)酵劑制作的曲拉4、5、6在相同的取樣條件和分析條件下進(jìn)行比較,GC-MS分離鑒定各曲拉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及含量分別見表1。

由表1可以看出,兩種曲拉樣品的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量及含量都存在一定差異,說明兩種發(fā)酵方法制作的曲拉其揮發(fā)性風(fēng)味成分各有特點(diǎn)。從表1的分析結(jié)果可以看出,利用GC-MS從傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉樣品中鑒定出29種揮發(fā)性風(fēng)味成分,包括酸類5種、醇類1種、醛類6種、酯類3種、烴類7種及芳香類7種;從商品發(fā)酵劑制作的曲拉樣品中鑒定出53種揮發(fā)性風(fēng)味成分,包括酸類12種、醇類4種、酮類4種、醛類8種、酯類10種、烴類8種及芳香類7種。

經(jīng)不同發(fā)酵方法制作的曲拉揮發(fā)性風(fēng)味成分主要包含有酸類、醇類、醛類、酯類、烴類、芳香類化合物,牛乳中的脂肪經(jīng)發(fā)酵劑中微生物代謝會產(chǎn)生醇類化合物,含羰基化合物(如醛、酮、酯等)則主要來源于高級醇氧化、氨基酸的Strecker降解或醛醇縮合反應(yīng)[9]。

酸類化合物:揮發(fā)性有機(jī)酸主要由乳中脂肪在脂肪酶的作用下水解形成[10],有顯著的特征氣味,是乳制品清爽口感和乳香味的主要來源。脂肪酸類物質(zhì)對于干酪的風(fēng)味具有重要的影響,不僅因?yàn)槠浔旧砭哂袚]發(fā)性風(fēng)味而且它們還是其他風(fēng)味物質(zhì)(如:甲基酮、醇、酯等)的前體物質(zhì)[11]。低碳數(shù)脂肪酸,其較低的閾值保證了干酪的典型發(fā)酵風(fēng)味[12]。如丁酸、己酸、辛酸、癸酸這4 種中短鏈脂肪酸,它們具有較為強(qiáng)烈的酸腐味、奶香味,對干酪的特征風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[13]。本實(shí)驗(yàn)檢測的傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉中酸類化合物含量為1.1531～1.4120 μg/g,在商品發(fā)酵劑制作的曲拉中的含量為16.6937～16.7297 μg/g。并且商品發(fā)酵劑制作的曲拉比傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉的酸類化合物種類更多,其中乙酸賦予曲拉淡淡的酸味;丁酸具有多汁味、奶油味;己酸具有油脂味;棕櫚酸有輕微脂肪香味[10];辛酸具有清香和微弱的水果酸氣味,淡酸味[14]。另外,這些脂肪酸還具有抗病毒、抗腫瘤、降膽固醇等生物活性[15]。

醇類化合物:本研究檢測出傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉和商品發(fā)酵劑制作的曲拉中都含有乙醇,乙醇由酵母的無氧代謝產(chǎn)生,其它高分子醇類大部分來自脂肪氧化,由脂肪酶降解乳中的脂肪酸產(chǎn)生[16]。乙醇具有特殊的、令人愉快的酒香味,是一些硬質(zhì)干酪中主要的風(fēng)味物質(zhì)[17]。盡管乙醇可以通過乙醛還原,但大部分干酪中發(fā)現(xiàn)的乙醇通常來自于乳酸菌發(fā)酵乳糖[18]。大分子醇類通常具有芳香、植物香、酸敗和土氣味,但閾值較高,對發(fā)酵乳整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[19]。

酮類化合物:酮類化合物由不飽和脂肪酸的β-氧化降解或熱降解以及氨基酸降解或者微生物代謝產(chǎn)生[20],該類化合物閾值低,可以賦予乳制品典型的風(fēng)味[21],同時(shí)也是干酪中不可或缺的風(fēng)味組分[22]。本實(shí)驗(yàn)中傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉沒有檢出酮類風(fēng)味物質(zhì),而商品發(fā)酵劑制作的曲拉檢出了四種酮類化合物,其中3-羥基-2-丁酮的生成來源于2,3-丁二酮,因?yàn)?,3-丁二酮很不穩(wěn)定,極易被還原為3-羥基-2-丁酮,這兩個(gè)化合物都與檸檬酸的代謝有關(guān)[18]。3-羥基-2-丁酮具有強(qiáng)烈的黃油、脂肪氣味[23];2-壬酮呈果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味[10]。

醛類化合物:乳制品中醛類大多由脂肪酸和游離脂肪酸發(fā)生自動氧化而生成,具有強(qiáng)烈刺鼻氣味,隨分子量增大,刺激性逐漸減小,并呈現(xiàn)愉快香氣,通常表現(xiàn)出青透氣息[24],如3-糠醛和苯甲醛都提供苦杏仁味香氣[10]。醛類化合物的化學(xué)性質(zhì)比較活潑,屬于不穩(wěn)定的中間體化合物,在一定條件下易被還原成相應(yīng)的醇,因此通常而言這類化合物在乳制品中的含量都不高。盡管如此,由于這類化合物風(fēng)味閾值較低,對香氣的貢獻(xiàn)較大,因而仍是乳制品風(fēng)味中不可缺少的部分。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉和商品發(fā)酵劑制作的曲拉中檢出共同含有的醛類化合物有五種,即乙醛、庚醛、辛醛、壬醛和苯甲醛。乙醛呈清爽的芳香味,是干酪中典型的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),在發(fā)酵過程中主要由乳酸菌通過乳糖代謝和分解作用生成以及蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶催化作用下降解生成[18]。辛醛有很強(qiáng)烈的水果香味;壬醛具有板油氣息[25];苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅(jiān)果香氣[10]。

酯類化合物:酯類化合物具有較低的閾值,通常提供甜味和水果味[11],可以緩解短鏈酸類化合物帶來的尖刺感,使干酪的整體風(fēng)味更加柔和,然而過多的酯類化合物則容易引起干酪偏水果味的缺陷[26]。短鏈的酯類化合物不僅在常溫條件下?lián)]發(fā)性較強(qiáng),還具有極低的閾值(10-9級),因而中、短碳鏈的脂肪酸乙酯具有較大的風(fēng)味貢獻(xiàn)潛力,例如:己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯等,這類酯類物質(zhì)的混合物被稱為黃油酯[10],是乳制品中的特征風(fēng)味組分,因而對于干酪香氣輪廓的形成具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)檢出6種乙酯類化合物,它們是由乙醇和牛乳中的脂肪酸反應(yīng)產(chǎn)生。己酸乙酯具有強(qiáng)烈的甜的果香、菠蘿、香蕉香氣,有花香底調(diào),擴(kuò)散力強(qiáng),香力持久性一般;葵酸乙酯具有近似于葡萄的香氣;辛酸乙酯具有果香似杏、奶油香、牛奶香、甜的酒香;月桂酸乙酯具有花果香、奶油香、甜香[10];丁酸芐酯具有菠蘿、草莓、漿果、杏仁、蘋果氣味[10]。

烯烴類化合物及芳香類化合物:烴類化合物普遍存在于干酪成分中,但由于烴類物質(zhì)具有較高的芳香閾值,因此對于干酪的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[27]。但由苯環(huán)、萘環(huán)組成的芳香烴具有較強(qiáng)的芳香風(fēng)味[25]。從表1可以看出,傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉和商品發(fā)酵劑制作的曲拉中烯烴及芳香類化合物種類相差不大,傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉含有7種烯烴類化合物,7種芳香類化合物;商品發(fā)酵劑制作的曲拉含有8種烯烴類化合物,7種芳香類化合物。這類化合物會令奶酪風(fēng)味更加飽滿。例如甲苯具有堅(jiān)果味、杏仁味和苦澀味[28]。

2.2 曲拉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

不同發(fā)酵方法制作的曲拉的風(fēng)味物質(zhì)種類含量上均有較大差異。傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類檢出有29種,商品發(fā)酵劑制作的曲拉有53種。含量差異最大的酸類化合物在傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉和商品發(fā)酵劑制作的曲拉中平均檢出量分別為1.2943 μg/g和16.7137 μg/g。這使得不同發(fā)酵方法制作的曲拉表現(xiàn)出不同的風(fēng)味趨向。為明確不同種類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對曲拉風(fēng)味的影響,利用主成分分析法考察了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與樣品間的分布關(guān)系。結(jié)果如圖1所示,F1和F2主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.62%。風(fēng)味物質(zhì)中酸和酯對F1貢獻(xiàn)率分別為24.24%和19.70%,醛類、醇類和酮類對F1貢獻(xiàn)率分別為12.34%、8.14%和8.05%,烯烴類和芳香類風(fēng)味物質(zhì)對F2貢獻(xiàn)率分別為41.19%和40.79%。具體如圖1所示,傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉1、2和3沿第一主成分(F1)負(fù)向(<0)分布,在主成分F2方向投影較短。結(jié)合表1,在曲拉1(Ob1)、曲拉2(Ob2)和曲拉3(Ob3)射線附近分布的十六酸甲酯(32)、二苯基甲烷(44)、柑橘檸烯(41)、1,7-二甲基萘(53)在傳統(tǒng)曲拉中的檢出量均高于商品發(fā)酵劑制作的曲拉,十四醛(26)、γ-油松烯(48)、1,4-二甲基萘(55)均在商品發(fā)酵劑制作的曲拉中未檢出。商品發(fā)酵劑制作的曲拉4、5和6分布在F1正向(>0),這表明酸、酯類揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量占有較大的比重,可能會對風(fēng)味產(chǎn)生明顯影響。由圖1可以看出,酸類、醇類、酮類及大部分醛類、酯類、芳香和烯烴類都分布在F1正向曲拉4(Ob4)、曲拉5(Ob5)和曲拉6(Ob6)射線附近。結(jié)合表1可知,商品發(fā)酵劑制作的曲拉中酸類、醇類、酮類和酯類化合物的種類和含量均多于傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉,而醛類和烯烴類成分在傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉和商品發(fā)酵劑制作的曲拉中的種類差別不大,但是商品發(fā)酵劑制作的曲拉中含量卻高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉。因此,這些揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量間的差異造成了本實(shí)驗(yàn)曲拉樣品風(fēng)味的不同。

圖1 六種曲拉和56種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在第一和第二主成分上的分布散點(diǎn)圖Fig.1 PCA biplot for 6 Qula samples and 56 volatile flavor components

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)使用兩種不同的發(fā)酵方法對同一批次牦牛乳進(jìn)行發(fā)酵,制作曲拉,采用固相微萃取、GC-MS和主成分分析法,對兩種曲拉樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析。利用GC-MS從傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉樣品中鑒定出29種揮發(fā)性風(fēng)味成分,商品發(fā)酵劑制作的曲拉樣品中為53種,確定了主要的揮發(fā)性組分為酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、烯烴類和芳香類。從揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類上分析,商品發(fā)酵劑制作的曲拉產(chǎn)生的揮發(fā)性成分較傳統(tǒng)自然發(fā)酵曲拉的多;從風(fēng)味物質(zhì)的含量上分析,商品發(fā)酵劑制作的曲拉中酸類含量最高16.7297 μg/g,而傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉中酸類最低含量為1.1531 μg/g,其他各類成分也是商品發(fā)酵劑制作的曲拉含量高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵的曲拉。結(jié)果說明發(fā)酵方法對揮發(fā)性風(fēng)味成分起重要作用。由于兩種發(fā)酵方法制作的曲拉中風(fēng)味性成分的種類和含量存在一定差異,而樣品的風(fēng)味特色是由一系列的成分組合而形成的,因此并不能單從檢測出的化合物數(shù)量或某種單一成分來判斷所用發(fā)酵方法的優(yōu)劣,但是若想要獲得特殊風(fēng)味的曲拉需要對發(fā)酵方法進(jìn)行優(yōu)化。

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Analysis of volatile flavor compounds in Qula samples fermented with different method

GUO Ting,ZHANG Jian,YANG Zhen-nai*

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business Univisty,Beijing 100048,China)

In this work,the composition of volatile flavor components in Chinese Qula fermented with traditional method and Qula fermented with commercial culture was determined by headspace-solid phase microextraction(HS-SPME)coupled with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). According to the NIST 14 MS spectral library and reference data,29 and 53 volatile compounds in Chinese Qula fermented with traditional method and Qula fermented with commercial culture were identified,respectively. These volatile components included acids,alcohols,ketones,aldehydes,esters,hydrocarbons and aromatics.The results showed Qula fermentation with the commercial culture could result in the production of more volatile flavor components than the Chinese Qula fermented with traditional method. This might be the main reason why Chinese Qula fermented with traditional method and Qula fermented with commercial culture had distinct volatile flavor components.

Qula;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);solid phase microextraction(SPME);volatile flavor components

2016-09-22

郭婷(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)乳制品方向,E-mail:1605595746@qq.com。

*通訊作者:楊貞耐(1965-)，男，博士，教授，研究方向：乳品科學(xué)及加工技術(shù)，E-mail:yangzhennai@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31371804)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303058)。

TS252.1

A

1002-0306(2017)08-0209-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.032