宏基因組學(xué)揭示瘤胃微生物多樣性及功能

吳 鵬 陳忠法 王佳堃(.浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州3002；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波3500)

宏基因組學(xué)揭示瘤胃微生物多樣性及功能

吳 鵬1陳忠法2*王佳堃1
(1.浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州310012；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波315100)

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)棲息著龐大和復(fù)雜的微生物群體，這些微生物與宿主的消化吸收、營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫功能息息相關(guān)，宿主及其微生物共同組成了一個(gè)“超級(jí)生物體”。由于絕大部分瘤胃微生物不可培養(yǎng)，因此以厭氧培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)研究方法存在明顯的弊端。宏基因組學(xué)通過(guò)高通量的測(cè)序方法，能夠全面展示微生物多樣性，準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)新的功能基因。此外，宏基因組學(xué)揭示了宿主基因和微生物組之間的互作關(guān)系。隨著組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)在瘤胃微生物組研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

宏基因組學(xué)；瘤胃；微生物組

反芻動(dòng)物全球總量已超過(guò)44億頭，是重要的食品和經(jīng)濟(jì)來(lái)源[1]。瘤胃容量大，溫度適宜，為微生物提供了良好生長(zhǎng)條件。瘤胃內(nèi)微生物種類(lèi)多，數(shù)量大，共有超過(guò)3 000種微生物，既包括細(xì)菌、原蟲(chóng)、真菌和古細(xì)菌[2]，也有噬菌體和病毒[3]。研究表明，每毫升瘤胃液中約含1011個(gè)細(xì)菌、1010個(gè)噬菌體、109個(gè)古細(xì)菌、106個(gè)原蟲(chóng)和106個(gè)真菌孢子[4]。瘤胃微生物與宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫息息相關(guān)[5]。瘤胃微生物利用飼糧中纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，合成菌體蛋白，為宿主提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，甲烷菌利用二氧化碳和氫氣生成甲烷，影響全球氣候變化[6]。此外，瘤胃微生物通過(guò)降解飼糧中有毒有害物質(zhì)[7]，產(chǎn)生甘露寡糖等免疫保護(hù)物質(zhì)[8]，可維持機(jī)體健康。瘤胃微生物調(diào)控不當(dāng)，將影響動(dòng)物健康。如精料采食比例過(guò)高，乳酸菌急劇增長(zhǎng)，產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致革蘭氏陰性菌死亡，釋放細(xì)胞壁上的脂多糖，造成瘤胃酸中毒[9]。

宏基因組學(xué)由Handelsman等[10]于1998年提出，指對(duì)生境中所有微生物的基因組DNA進(jìn)行研究，從而打破傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限。Lederberg[11]用“超級(jí)生物體(superorganism)”來(lái)定義宿主與共生微生物的緊密關(guān)系，反芻動(dòng)物也擁有宿主本身和其共生微生物組2套遺傳物質(zhì)。隨著人類(lèi)腸道宏基因組計(jì)劃[12](metagenomics of the human intestinal tract,MetaHIT)的實(shí)施和完成，人們對(duì)宿主和微生物之間的關(guān)系有了更深的認(rèn)識(shí)。澳大利亞Rumen Pangenome、歐洲RuminOmics等幾個(gè)研究組也已利用宏基因組學(xué)方法開(kāi)展了關(guān)于反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落組成、系統(tǒng)發(fā)生、代謝功能的研究。如圖1所示，宏基因組學(xué)起步晚，但發(fā)展迅速，目前已成為全球的研究熱點(diǎn)。

1 宏基因組學(xué)方法操作流程

早期宏基因組學(xué)技術(shù)主要用于發(fā)掘不同生境下微生物編碼特殊生物分子的基因，其一般操作流程為：首先提取環(huán)境樣本中總DNA，然后將其轉(zhuǎn)入Fosmid、Cosmid和細(xì)菌人工染色體等表達(dá)載體中構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，最后將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入大腸桿菌等宿主菌中表達(dá)出活性產(chǎn)物。目前有基于序列、功能和底物誘導(dǎo)基因表達(dá)3種對(duì)宏基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選的方法。Ufarté等[13]對(duì)Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建方法和碳水化合物活性酶功能基因篩選方案做了較為詳細(xì)的描述。Daniel[14]也介紹了目前主要文庫(kù)構(gòu)建和功能篩選的方法。至今，已成功將宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于土壤、瘤胃等生境中的脂酶[15]和纖維素酶[16]的發(fā)掘。

圖1 PubMed中搜索關(guān)鍵詞“Metagenomics”(A)和“Metagenomics and rumen”(B)論文數(shù)變化

隨著二代測(cè)序技術(shù)的興起，宏基因組學(xué)的內(nèi)容得到不斷豐富，擴(kuò)增子(amplicon)測(cè)序和全基因組測(cè)序成為宏基因組研究的2個(gè)主要方向。擴(kuò)增子測(cè)序可以展示微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度信息，而全基因組測(cè)序可以進(jìn)一步對(duì)微生物群落功能進(jìn)行分析。應(yīng)用Illumina和Roche 454 FLX等測(cè)序平臺(tái)對(duì)微生物宏基因組16/18S小亞基(small subunit,SSU)rRNA基因等其他系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因進(jìn)行測(cè)序，將讀長(zhǎng)(reads)序列除雜、去嵌合體后，用Mothur[17]或QIIME[18]生成可操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)，再分別從各個(gè)OTU中挑選1條代表序列與Greengenes[19]、SILVA[20]和RDP[21]等微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到物種分類(lèi)和豐度信息。Di Bella等[22]介紹了目前幾種常見(jiàn)的高通量測(cè)序平臺(tái)，并對(duì)各種測(cè)序平臺(tái)的應(yīng)用情況進(jìn)行了說(shuō)明。

此外，也有直接應(yīng)用16S rRNA基因進(jìn)行微生物組功能預(yù)測(cè)的報(bào)道[23]。當(dāng)然，也可對(duì)樣本中宏基因組DNA片段進(jìn)行測(cè)序，將原始reads組裝拼接形成包含更多堿基序列的重疊群(contigs)?？墒褂肕EGAN[24]等軟件將reads或contigs數(shù)據(jù)歸類(lèi)到對(duì)應(yīng)微生物基因組上，contigs再按照一定次序排列形成scaffolds，這些scaffolds可用于構(gòu)建微生物基因組草圖，scaffolds間存在一定的堿基序列間隔區(qū)。reads和contigs都可用MetaGeneMark[25]或FragGeneScan[26]等軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，并通過(guò)與COG[27]、PFAM[28]和KEGG[29]等蛋白質(zhì)、核酸及代謝相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)注釋?zhuān)沂疚⑸锶郝浣M成、功能和代謝特點(diǎn)。由于數(shù)據(jù)庫(kù)種類(lèi)多，操作繁瑣，因此開(kāi)發(fā)了MG-RAST[30]等專(zhuān)門(mén)用于宏基因組數(shù)據(jù)管理和分析的集成系統(tǒng)。Thomas等[31]針對(duì)宏基因組學(xué)研究，提供了從采樣到數(shù)據(jù)分析的全套方案和建議。

2 宏基因組學(xué)揭示瘤胃微生物多樣性

瘤胃微生物多樣性是指對(duì)瘤胃生境中微生物組成和種群結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，主要包括α多樣性和β多樣性2個(gè)空間尺度的測(cè)定。一般用多樣性指數(shù)(Chao1、ACE和Shannon指數(shù)等)作為反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，豐富度指微生物種類(lèi)的多少，而均勻度表示各類(lèi)微生物的占比情況。早期人們對(duì)瘤胃微生物的認(rèn)知主要依賴(lài)于顯微鏡觀察，因此僅局限于對(duì)一些體積較大的微生物進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。隨著研究的深入，人們很快意識(shí)到瘤胃中存在其他大量微生物，但由于培養(yǎng)技術(shù)所限，并不能對(duì)所有的瘤胃微生物進(jìn)行分離和鑒定[4]。

得益于分子技術(shù)，特別是指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展，研究者無(wú)需對(duì)瘤胃微生物進(jìn)行培養(yǎng)，而選擇直接對(duì)微生物DNA或RNA序列進(jìn)行分析，既減少了分析誤差，又大大提高了對(duì)瘤胃未培養(yǎng)微生物的認(rèn)識(shí)能力，如大型瘤胃細(xì)菌卵狀奎因氏菌(Quinellaovalis)從未培養(yǎng)成功，但經(jīng)過(guò)核糖體RNA的小亞基的基因序列分析而被確定分類(lèi)地位[32]。目前用于研究微生物多樣性的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)、核糖體基因間隔序列分析(ribosomal intergenic sequence analysis,RISA)和可變末端-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(terminal-restriction fragment length polymorphism，t-RFLP)[16]。這些技術(shù)在一定程度上能反映微生態(tài)群落組成結(jié)構(gòu)，但分辨度仍不夠高，展示的多樣性信息明顯低于實(shí)際值[33]。Bokulich等[34]對(duì)上述方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)比較，并依次例舉了各種方法的應(yīng)用情況。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)成本的降低，宏基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，未培養(yǎng)微生物也因此被大規(guī)模發(fā)現(xiàn)。高通量的測(cè)序技術(shù)相比于傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)是能夠直接獲取堿基序列信息，而不同種類(lèi)的微生物各自存在相對(duì)保守的堿基序列，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，微生物保守區(qū)堿基序列的差異越大。因此，可選擇這些保守區(qū)作為標(biāo)記基因，宏基因組學(xué)研究中分別將序列相似性在97%、95%和90%作為在種、屬和科分類(lèi)水平上OTU劃分的依據(jù)[2]。若無(wú)特殊說(shuō)明，以下均以97%的序列相似性作為種分類(lèi)水平上OTU聚類(lèi)的默認(rèn)閾值。

2.1 瘤胃微生物種群結(jié)構(gòu)

Kim等[2]對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中所有瘤胃來(lái)源的13 478條細(xì)菌和3 516條古菌16S rRNA基因序列進(jìn)行分析。在種的分類(lèi)水平上，共聚類(lèi)得到5 271個(gè)細(xì)菌OTU和943個(gè)古菌OTU。其中，絕大部分細(xì)菌OTU屬于厚壁菌門(mén)(2 958 OTU)、擬桿菌門(mén)(1 610 OTU)和變形菌門(mén)(226 OTU)，表明瘤胃中這三大門(mén)類(lèi)微生物可能占據(jù)主導(dǎo)地位。另外，幾乎所有瘤胃來(lái)源的古菌都屬于古生菌門(mén)(Euryarchaeota)，甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)是其中最主要的一類(lèi)產(chǎn)甲烷菌。Fouts等[35]采用同樣的策略，從NCBI、SILVA和RDP 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出所有瘤胃來(lái)源的細(xì)菌和古菌16S rRNA基因V1～V3區(qū)序列進(jìn)行分析，共獲得14 332條細(xì)菌序列和2 484條古菌序列，再分別聚類(lèi)得到4 670個(gè)細(xì)菌OTU和486個(gè)古菌OTU，略低于Kim等[2]的研究結(jié)果。另外，由于RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中不包含真核生物18S序列信息，F(xiàn)outs等[35]只分別從SILVA和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選出1 027和1 803條18S序列進(jìn)行真菌多樣性分析，結(jié)果得到168個(gè)真菌OTU。值得注意的是，由于數(shù)據(jù)庫(kù)中真菌信息并不完善，因此對(duì)于真菌比對(duì)后的分類(lèi)結(jié)果和豐度信息可信度并不高[36]。也有觀點(diǎn)認(rèn)為由于真菌18S rRNA序列具有高度保守性，無(wú)法利用該序列對(duì)其進(jìn)行鑒定或比較[37]，因此對(duì)瘤胃真菌還有待進(jìn)一步研究。

Fouts等[35]對(duì)飼喂苜蓿和干草的12頭奶牛瘤胃內(nèi)容物中的16/18S小亞基rRNA基因V1～V3區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分別聚類(lèi)得到4 370個(gè)細(xì)菌OTU、10個(gè)古菌OTU和52個(gè)真菌OTU。與數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的所有OTU相比，各界微生物所含的OTU數(shù)均不同程度的降低，其中古菌OTU數(shù)減少最顯著。在屬的分類(lèi)水平上，OTU數(shù)排名前5的細(xì)菌依次為普氏菌屬(Prevotella)、顫桿菌屬(Oscillibacter)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃菌科未分類(lèi)屬(unclassified Ruminococcaceae)和丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)，該5個(gè)屬占細(xì)菌總量的40%左右。瘤胃中一共存在46個(gè)真菌屬，而單個(gè)瘤胃中最多只檢測(cè)到40個(gè)OTU，可見(jiàn)瘤胃中真菌較少。在屬的分類(lèi)水平上，叢赤殼屬(Nectria)、Penicilliopsis、Cystofilobasidium和Delphinellan豐度較高，該4個(gè)屬占真菌總數(shù)的25%以上。另外，平均每頭奶牛瘤胃存在的細(xì)菌OTU數(shù)為2 122，而根據(jù)Chao1指數(shù)估算出每頭牛瘤胃中包含的細(xì)菌OTU數(shù)為3 116～5 439，將近1/2的OTU序列沒(méi)有檢測(cè)到，表明當(dāng)前測(cè)序深度(5 000條reads)并不能完全反映瘤胃細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。而對(duì)于真菌，1 000條reads即能滿(mǎn)足其測(cè)序要求，其覆蓋度(good’s coverage)可達(dá)到98.4%以上。

Jami等[36]為探究奶牛個(gè)體間瘤胃微生物的組成差異，對(duì)飼喂相同飼糧的16頭荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)容物中微生物的16S rRNA基因V2～V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，結(jié)果共得到4 986個(gè)OTU，平均每頭牛瘤胃包含1 800個(gè)OTU。所有牛瘤胃共有的OTU數(shù)為157個(gè)(占4%)，4頭以上牛瘤胃所共有的OTUs數(shù)只占1/2左右。用Bray-Curtis法計(jì)算出個(gè)體間相似度為51%，個(gè)體間存在一定變異，但都包含一個(gè)由32個(gè)屬組成的核心微生物組。此外，考慮到微生物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，應(yīng)用加權(quán)UniFrac法計(jì)算出樣本間的相似度可達(dá)82%，作者指出在相同飼喂條件下雖然個(gè)體間瘤胃微生物區(qū)系在分類(lèi)學(xué)上存在差異，但功能可能趨于一致。

2.2 瘤胃生境中微生物分布特點(diǎn)

Larue等[37]最先利用DGGE和自動(dòng)核糖體基因間隔序列分析(automated ribosomal intergenic spacer analysis,ARISA)技術(shù)探究了羊瘤胃內(nèi)容物固相和液相中微生物區(qū)系的組成差異。近年來(lái)，許多研究者通過(guò)高通量測(cè)序的方法，進(jìn)一步證實(shí)了這種差異的存在。Mullins等[38]研究發(fā)現(xiàn)飼喂全混合日糧(TMR)的奶牛瘤胃內(nèi)容物中，液相存在更高比例的牛鏈球菌(Streptococcusbovis)、棲瘤胃普氏菌(Prevotellaruminicola)和溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)，而固相中主要以嚙齒真桿菌(Eubacteriumruminantium)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)和白色瘤胃球菌(Rumincoccusalbus)為主。

McCann等[39]利用焦磷酸測(cè)序法對(duì)飼喂劣質(zhì)粗飼料的肉牛瘤胃微生物展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)液相中Paludibacter和解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)比例較固相中高，而固相中普氏菌屬和螺旋體屬(Treponema)豐度較高。Pitta等[40]研究了當(dāng)肉牛飼糧由低蛋白質(zhì)、高纖維的狗牙根(bermudagrass)向高蛋白質(zhì)、高可溶性營(yíng)養(yǎng)物的冬小麥變化時(shí)對(duì)瘤胃內(nèi)容物及固相、液相微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明飼喂狗牙根草組的瘤胃內(nèi)容物液相中包含的微生物種類(lèi)最多，共發(fā)現(xiàn)149個(gè)屬，而飼喂冬小麥的瘤胃內(nèi)容物液相中只有118個(gè)屬；普氏菌屬均是存在于2種飼糧中豐度最高的微生物，且在液相分布較多，這與McCann等[39]的結(jié)果不符，可能原因在于普氏菌屬存在多種代謝類(lèi)型菌株，能利用不同底物生長(zhǎng)。另外，存在于瘤胃內(nèi)容物固體顆粒上的微生物可能在纖維分解方面發(fā)揮重要功能。

瘤胃上皮黏附微生物由于結(jié)構(gòu)上與宿主的緊密聯(lián)系，因此在功能上可能參與反芻動(dòng)物瘤胃上皮VFA吸收等其他重要生理過(guò)程。Petri等[41]結(jié)合DGGE、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting system,qPCR)和焦磷酸測(cè)序3種技術(shù)研究了瘤胃上皮微生物在飼喂粗料和高精料時(shí)的變化規(guī)律。DGGE圖譜顯示飼喂粗料和混合粗料的瘤胃上皮微生物區(qū)系間相似性高于高精料組；qPCR結(jié)果表明產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的種群數(shù)量顯著受到粗料的影響；焦磷酸測(cè)序結(jié)果分析得到149個(gè)OTU，厚壁菌門(mén)是存在于瘤胃上皮中的優(yōu)勢(shì)菌；埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)、牛鏈球菌和普氏菌的qPCR定量結(jié)果與焦磷酸測(cè)序法得到的菌株豐度信息基本一致；隨著飼糧的變化，瘤胃上皮微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)相較于瘤胃固相和液相更穩(wěn)定[41]。

3 宏基因組學(xué)與瘤胃微生物功能

瘤胃微生物是一個(gè)極其龐大而復(fù)雜的系統(tǒng)，微生物間存在共生、寄生、競(jìng)爭(zhēng)、捕食的關(guān)系。宿主健康和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收都依賴(lài)于瘤胃微生物正常功能的發(fā)揮。瘤胃微生物是一座巨大的生物資源庫(kù)，蘊(yùn)藏著許多有待挖掘的基因。目前，借助于宏基因組學(xué)研究手段，許多研究者對(duì)瘤胃微生物功能進(jìn)行了積極探索，嘗試挖掘一些重要營(yíng)養(yǎng)生理功能密切相關(guān)的瘤胃微生物功能基因。

3.1 纖維分解

瘤胃微生物具有很強(qiáng)的纖維素降解能力，產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸等可為機(jī)體提供能量。瘤胃內(nèi)的纖維降解體系非常復(fù)雜，半纖維素酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶、淀粉酶、酚酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶等一系列酶參與到這一反應(yīng)過(guò)程中[42]，且瘤胃微生物進(jìn)化出了幾種特殊纖維分解機(jī)制。纖維小體是厭氧生物存在的一種纖維素酶系，由多種纖維素酶、半纖維素酶依靠錨定、黏附機(jī)制形成的一種多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)，通過(guò)細(xì)胞黏附蛋白附著在細(xì)菌細(xì)胞壁上，能高效徹底地降解天然纖維素材料[43]。

對(duì)高活性纖維分解基因的篩選一直是研究者致力于瘤胃微生物功能研究的主要方向。Ferrer等[44]首先在奶牛瘤胃宏基因組文庫(kù)中新發(fā)現(xiàn)了9個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶基因。Dai等[45]為探究微生物纖維分解相關(guān)的功能基因，研究了牦牛瘤胃微生物組，試驗(yàn)共篩選得到223個(gè)具有纖維分解能力的細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)克隆，預(yù)測(cè)出10 070個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORFs)。其中，150個(gè)ORFs屬于糖苷水解酶(GH)基因，且絕大多數(shù)來(lái)自GH5、GH9和GH10家族，卻缺少多數(shù)微生物纖維素酶系中重要組成成分GH48。對(duì)長(zhǎng)度超過(guò)10 kb的水解纖維素contigs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中25個(gè)來(lái)自于擬桿菌門(mén)，4個(gè)來(lái)自于厚壁菌門(mén)，且常與SusC/SusD型外膜蛋白基因連鎖。Hess等[46]在瘤胃中發(fā)現(xiàn)27 755個(gè)碳水化合物活性基因，隨機(jī)選擇90個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)，57%的基因能編碼具有纖維素分解活性的酶。Brulc等[47]在3頭飼喂相同飼糧的肉牛瘤胃中共發(fā)現(xiàn)35個(gè)糖苷水解酶家族基因，然而只發(fā)現(xiàn)3個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊家族基因和3個(gè)錨定模塊。這說(shuō)明纖維降解過(guò)程中，微生物并不首先水解主鏈上的纖維素和半纖維素，而是先打開(kāi)側(cè)鏈基團(tuán)，完成定植過(guò)程。

Butyrivibrioproteoclasticus是一種產(chǎn)丁酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，可利用菊糖、果膠和木聚糖等作為發(fā)酵底物，其廣泛存在于瘤胃中[33]。Kelly等[48]對(duì)ButyrivibrioproteoclasticusB316全基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其共編碼3種類(lèi)型的碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)，分別是CBM2a、CBM6和CBM13。此外，還編碼GH2、GH3、GH13等多種糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶。

3.2 甲烷發(fā)生

Denman等[49]研究了甲烷抑制劑——溴氯甲烷(BCM-CD)對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響。BCM-CD顯著增加了瘤胃氫的濃度，同時(shí)也顯著提高了普氏菌和月形單胞菌等耗氫菌的豐度，從而發(fā)酵產(chǎn)生更多丙酸。Ross等[50]研究表明奶牛飼糧中添加葡萄酒渣和單寧與脂類(lèi)物質(zhì)的混合物都可減少甲烷排放，并且雖然添加劑類(lèi)型不一樣，但瘤胃微生物組變化特點(diǎn)具有相似性，2種添加劑均顯著影響與甲烷生成有關(guān)的微生物，使微生物組朝著低甲烷排放的方向發(fā)展。

甲烷產(chǎn)量不僅與瘤胃內(nèi)的甲烷菌數(shù)量相關(guān)，還受到瘤胃內(nèi)其他微生物的影響。瘤胃內(nèi)氫濃度和甲烷菌與產(chǎn)氫菌、耗氫菌的互作也是影響甲烷產(chǎn)量的重要因素[51]。Kittelmann等[52]研究發(fā)現(xiàn)瘤胃甲烷短桿菌和纖維桿菌科微生物菌群數(shù)量變化具有強(qiáng)正相關(guān)性，說(shuō)明其在功能上存在某種聯(lián)系。Ng等[53]證實(shí)瘤胃甲烷短桿菌和Butyrivibrioproteoclasticus在功能上存在一定聯(lián)系。Butyrivibrioproteoclasticus可為甲烷菌甲烷發(fā)生提供甲酸、氫和二氧化碳等底物，而甲烷菌為其提供谷氨酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。乙酸菌可以利用二氧化碳和氫生成乙酸。氫是甲烷菌生成甲烷的底物，也是其重要的能量物質(zhì)[54]。乙酸菌可以與甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)性利用氫，從而減少甲烷的產(chǎn)生。但是選擇合適的乙酸菌，是有效競(jìng)爭(zhēng)氫的前提條件。Kelly等[55]通過(guò)對(duì)1株黏液細(xì)菌SA11的全基因組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)SA11不僅可以利用二氧化碳/氫進(jìn)行自養(yǎng)型生長(zhǎng)，還能利用葡萄糖和甲醇進(jìn)行異養(yǎng)型生長(zhǎng)。但是SA11代謝類(lèi)型多樣，提示將其作為與甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)氫的候選菌可能并不合適。

為完善數(shù)據(jù)庫(kù)中甲烷菌基因信息，從更深層次揭示甲烷的生成機(jī)制，目前已對(duì)包括瘤胃甲烷短桿菌M1在內(nèi)的幾株甲烷菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，如表2所示。甲烷菌基因組大小不同，甲烷生成途徑也各異。除二氧化碳/氫途徑外，還可利用甲酸和乙酸生成甲烷。甲烷菌可能分布于瘤胃內(nèi)特定的小環(huán)境，甲烷產(chǎn)量取決于甲烷菌對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。理解甲烷菌與周?chē)⑸锏墓采?、互作關(guān)系，將有利于制訂更加高效的甲烷減排策略。

表2 瘤胃甲烷菌全基因組測(cè)序項(xiàng)目

4 小結(jié)及展望

宏基因組學(xué)技術(shù)拓寬了我們對(duì)瘤胃微生態(tài)的認(rèn)識(shí)，反芻動(dòng)物和瘤胃微生物之間是緊密相連的整體。一個(gè)穩(wěn)定、高效、平衡的微生物生態(tài)群落是瘤胃正常發(fā)揮功能的必要條件，也是決定反芻動(dòng)物生產(chǎn)效率的重要因素。近10年來(lái)，通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)瘤胃微生態(tài)的研究，我們對(duì)反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)機(jī)制有了大致地了解，尤其對(duì)粗飼料的消化。但相對(duì)而言，反芻動(dòng)物口腔和腸道微生態(tài)的研究較少，也許這些部位微生物與瘤胃微生物之間可能存在一定的聯(lián)系。

宏基因組學(xué)研究的核心是通過(guò)與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而了解系統(tǒng)發(fā)育和群落結(jié)構(gòu)和功能信息。因此，需從完善數(shù)據(jù)庫(kù)、增加測(cè)序讀長(zhǎng)、加強(qiáng)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的構(gòu)建等方面進(jìn)一步提高宏基因組學(xué)的應(yīng)用價(jià)值。但也不能徹底拋棄傳統(tǒng)微生物研究的分離培養(yǎng)方法，分離培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)將大大增加瘤胃可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)，對(duì)純菌生理特性和基因組信息的研究有利于對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)組學(xué)數(shù)據(jù)的理解和解釋微生物現(xiàn)象。Hungate 1000計(jì)劃(www.hungate1000.org.nz)和FibeRumBa(http://www.jcvi.org/rumenomics)將幫助我們認(rèn)識(shí)更多未培養(yǎng)微生物的功能及遺傳機(jī)制，從而完善數(shù)據(jù)庫(kù)信息。

當(dāng)然，宏基因組學(xué)分析也存在一定弊端，如DNA序列只能反映微生物的代謝潛能，而不能實(shí)時(shí)反映基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況，因此未來(lái)宏基因組學(xué)將聯(lián)合宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，在DNA、RNA和蛋白質(zhì)3個(gè)層面上揭示微生物群落的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)生、代謝功能、調(diào)控規(guī)律等。相信這些技術(shù)將會(huì)在多種生態(tài)領(lǐng)域得到快速的發(fā)展和應(yīng)用，可以使人們從系統(tǒng)角度全面認(rèn)識(shí)微生物群落與其功能，利用其規(guī)律挖掘新的微生物菌種及其酶資源等。隨著測(cè)序成本的降低和準(zhǔn)確性的提高，宏基因組學(xué)技術(shù)將會(huì)像PCR技術(shù)一樣，成為未來(lái)微生物研究的主流方法。

[1] Food and Agriculture Organization of the United Nations.FAOSTAT[EB/OL].[2016-10-01].http://faostat3.fao.org/faostat-gateway/go/to/download/Q/QC/S.

[2] KIM M,MORRISON M,YU Z T.Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes[J].FEMS Microbiology Ecology,2011,76(1):49-63.

[3] ROSS E M,PETROVSKI S,MOATE P J,et al.Metagenomics of rumen bacteriophage from thirteen lactating dairy cattle[J].BMC Microbiology,2013,13(1):242.

[4] KLIEVE A V,SWAIN R A.Estimation of ruminal bacteriophage numbers by pulsed-field gel electrophoresis and laser densitometry[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(7):2299-2303.

[6] KUMAR S,CHOUDHURY P K,CARRO M D,et al.New aspects and strategies for methane mitigation from ruminants[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(1):31-44.

[7] JONES R J.Does ruminal metabolism of mimosine explain the absence of leucaena toxicity in Hawaii?[J].Australian Veterinary Journal,1981,57(1):55-56.

[8] 戈婷婷.不同組合的功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃體外發(fā)酵的影響[D].碩士學(xué)位論文.南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[9] MALEKKHAHI M,TAHMASBI A M,NASERIAN A A,et al.Effects of supplementation of active dried yeast and malate during sub-acute ruminal acidosis on rumen fermentation,microbial population,selected blood metabolites,and milk production in dairy cows[J].Animal Feed Science and Technology,2016,213:29-43.

[10] HANDELSMAN J,RONDON M R,BRADY S F,et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes:a new frontier for natural products[J].Chemistry & Biology,1998,5(10):R245-R249.

[11] LEDERBERG J.Infectious history[J].Science,2000,288(5464):287-293.

[12] EHRLICH S D,CONSORTIUM T M.MetaHIT:the European union project on metagenomics of the human intestinal tract[M]//NELSON K E.Metagenomics of the human body.New York:Springer,2011.

[13] UFARTé L,BOZONNET S,LAVILLE E,et al.Functional metagenomics:construction and high-throughput screening of fosmid libraries for discovery of novel carbohydrate-active enzymes[M]//MARTIN F,UROZ S.Microbial environmental genomics (MEG).New York:Springer,2016,1399:257.

[14] DANIEL R.The metagenomics of soil[J].Nature Reviews Microbiology,2005,3(6):470-478.

[15] DE SANTI C,ALTERMARK B,PIERECHOD M M,et al.Characterization of a cold-active and salt tolerant esterase identified by functional screening of Arctic metagenomic libraries[J].BMC Biochemistry,2016,17(1):1.

[16] PANDEY S,GULATI S,GOYAL E,et al.Construction and screening of metagenomic library derived from soil for β-1,4-endoglucanase gene[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology,2016,5:186-192.

[17] SCHLOSS P D,WESTCOTT S L,RYABIN T,et al.Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial communities[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(23):7537-7541.

[18] CAPORASO J G,KUCZYNSKI J,STOMBAUGH J,et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nature Methods,2010,7(5):335-336.

[19] DESANTIS T Z,HUGENHOLTZ P,LARSEN N,et al.Greengenes,a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(7):5069-5072.

[20] PRUESSE E,QUAST C,KNITTEL K,et al.SILVA:a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB[J].Nucleic Acids Research,2007,35(21):7188-7196.

[21] COLE J R,CHAI B,MARSH T L,et al.The Ribosomal Database Project (RDP-Ⅱ):previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new prokaryotic taxonomy[J].Nucleic Acids Research,2003,31(1):442-443.

[22] DI BELLA J M,BAO Y G,GLOOR G B,et al.High throughput sequencing methods and analysis for microbiome research[J].Journal of Microbiological Methods,2013,95(3):401-414.

[23] ABHAUER K P,WEMHEUER B,DANIEL R,et al.Tax4Fun:predicting functional profiles from metagenomic 16S rRNA data[J].Bioinformatics,2015,31(17):2882-2884.

[24] HUSON D H,AUCH A F,QI J,et al.MEGAN analysis of metagenomic data[J].Genome Research,2007,17(3):377-386.

[25] TANG S,BORODOVSKY M.Ab initio gene identification in metagenomic sequences[M]//NELSON K E.Encyclopedia of metagenomics.New York:Springer,2014.

[26] RHO M,TANG H X,YE Y Z.FragGeneScan:predicting genes in short and error-prone reads[J].Nucleic Acids Research,2010,38(20):e191.

[27] TATUSOV R L,FEDOROVA N D,JACKSON J D,et al.The COG database:an updated version includes eukaryotes[J].BMC Bioinformatics,2003,4(1):41.

[28] FINN R D,ALEX B,JODY C.PFAM:the protein families database[J].Nucleic Acids Research,2014,42(D1):D222-D230.

[29] KANEHISA M,GOTO S,KAWASHIMA S,et al.The KEGG resource for deciphering the genome[J].Nucleic Acids Research,2004,32(Suppl.1):277D-280D.

[30] GLASS E M,WILKENING J,WILKE A,et al.Using the metagenomics RAST server (MG-RAST) for analyzing shotgun metagenomes[J].Cold Spring Harbor Protocols,2010,doi:10.1101/pdb.prot5368.

[31] THOMAS T,GILBERT J,MEYER F.Metagenomics—a guide from sampling to data analysis[J].Microbial Informatics and Experimentation,2012,2(1):3.

[32] KRUMHOLZ L R,BRYANT M P,BRULLA W J,et al.Proposal ofQuinellaovalisgen. nov.,sp. nov.,based on phylogenetic analysis[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1993,43(2):293-296.

[33] PAILLARD D,MCKAIN N,RINCON M T,et al.Quantification of ruminalClostridiumproteoclasticumby real-time PCR using a molecular beacon approach[J].Journal of Applied Microbiology,2007,103(4):1251-1261.

[34] BOKULICH N A,MILLS D A.Next-generation approaches to the microbial ecology of food fermentations[J].BMB Reports,2012,45(7):377-389.

[35] FOUTS D E,SZPAKOWSKI S,PURUSHE J,et al.Next generation sequencing to define prokaryotic and fungal diversity in the bovine rumen[J].PLoS One,2012,7(11):e48289.

[36] JAMI E,ISRAEL A,KOTSER A,et al.Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood[J].The ISME Journal,2013,7(6):1069-1079.

[37] LARUE R,YU Z T,PARISI V A,et al.Novel microbial diversity adherent to plant biomass in the herbivore gastrointestinal tract,as revealed by ribosomal intergenic spacer analysis andrrsgene sequencing[J].Environmental Microbiology,2005,7(4):530-543.

[38] MULLINS C R,MAMEDOVA L K,CARPENTER A J,et al.Analysis of rumen microbial populations in lactating dairy cattle fed diets varying in carbohydrate profiles andSaccharomycescerevisiaefermentation product[J].Journal of Dairy Science,2013,96(9):5872-5881.

[39] MCCANN J C,DREWERY M L,SAWYER J E,et al.Effect of postextraction algal residue supplementation on the ruminal microbiome of steers consuming low-quality forage[J].Journal of Animal Science,2014,92(11):5063-5075.

[40] PITTA D W,PINCHAK W E,DOWD S E,et al.Rumen bacterial diversity dynamics associated with changing from bermudagrass hay to grazed winter wheat diets[J].Microbial Ecology,2010,59(3):511-522.

[41] PETRI R M,SCHWAIGER T,PENNER G B,et al.Changes in the rumen epimural bacterial diversity of beef cattle as affected by diet and induced ruminal acidosis[J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79(12):3744-3755.

[42] XUE G P,GOBIUS K S,ORPIN C G.A novel polysaccharide hydrolase cDNA (celD) fromNeocallimastixpatriciarumencoding three multi-functional catalytic domains with high endoglucanase,cellobiohydrolase and xylanase activities[J].Microbiology,1992,138(11):2397-2403.

[43] HAMMEL M,FIEROBE H P,CZJZEK M,et al.Structural basis of cellulosome efficiency explored by small angle X-ray scattering[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280(46):38562-38568.

[44] FERRER M,GOLYSHINA O V,CHERNIKOVA T N,et al.Novel hydrolase diversity retrieved from a metagenome library of bovine rumen microflora[J].Environmental Microbiology,2005,7(12):1996-2010.

[45] DAI X,ZHU Y X,LUO Y F,et al.Metagenomic insights into the fibrolytic microbiome in yak rumen[J].PLoS One,2012,7(7):e40430.

[46] HESS M,SCZYRBA A,EGAN R,et al.Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen[J].Science,2011,331(6016):463-467.

[47] BRULC J M,ANTONOPOULOS D A,MILLER M E B,et al.Gene-centric metagenomics of the fiber-adherent bovine rumen microbiome reveals forage specific glycoside hydrolases[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(6):1948-1953.

[48] KELLY W J,LEAHY S C,ALTERMANN E,et al.The glycobiome of the rumen bacteriumButyrivibrioproteoclasticusB316Thighlights adaptation to a polysaccharide-rich environment[J].PLoS One,2010,5(8):e11942.

[49] DENMAN S E,FERNANDEZ G M,SHINKAI T,et al.Metagenomic analysis of the rumen microbial community following inhibition of methane formation by a halogenated methane analog[J].Frontiers in Microbiology,2015,6:1087.

[50] ROSS E M,MOATE P J,MARETT L,et al.Investigating the effect of two methane-mitigating diets on the rumen microbiome using massively parallel sequencing[J].Journal of Dairy Science,2013,96(9):6030-6046.

[51] MORGAVI D P,FORANO E,MARTIN C,et al.Microbial ecosystem and methanogenesis in ruminants[J].Animal,2010,4(7):1024-1036.

[52] KITTELMANN S,SEEDORF H,WALTERS W A,et al.Simultaneous amplicon sequencing to explore co-occurrence patterns of bacterial,archaeal and eukaryotic microorganisms in rumen microbial communities[J].PLoS One,2013,8(2):e47879.

[53] NG F,KITTELMANN S,PATCHETT M L,et al.An adhesin from hydrogen-utilizing rumen methanogenMethanobrevibacterruminantiumM1 binds a broad range of hydrogen-producing microorganisms[J].Environmental Microbiology,2016,18(9):3010-3021.

[54] WEIMER P J.Redundancy,resilience,and host specificity of the ruminal microbiota:implications for engineering improved ruminal fermentations[J].Frontiers in Microbiology,2015,6:296.

[55] KELLY W J,HENDERSON G,PACHECO D M,et al.The complete genome sequence ofEubacteriumlimosumSA11,a metabolically versatile rumen acetogen[J].Standards in Genomic Sciences,2016,11(1):26.

*Corresponding author, associate professor, E-mail: 572680715@qq.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Metagenomics Reveals Rumen Microbial Diversity and Functions

WU Peng1CHEN Zhongfa2*WANG Jiakun1
(1.InstituteofDairyScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310012,China; 2.DepartmentofBioscience,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100,China)

There are a large number of microorganisms that inhabit the rumen of ruminant animals, which are closely related to host digestion, absorption and immunization. The host and symbiotic microorganisms together constitute a “superorganisms”. Because most of microorganisms in the rumen cannot be cultivated, traditional culture-dependent methods have obvious drawbacks. Metagenomics is a high throughput method that characterizes the rumen microbial community structure and identifies novel functional genes. Moreover, the interactions between microbiome and host genetics are also determined through the use of metagenomics. With advances in omic technologies, metagenomics can be a powerful tool in studying the rumen microbiome with encouraging prospects.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1506-1514]

metagenomics; rumen; microbiome

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.008

2016-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372337)

吳 鵬(1992—)，男，湖南邵陽(yáng)人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail： wp357@foxmail.com

*通信作者:陳忠法，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： 572680715@qq.com

Q78;S852.65

A

1006-267X(2017)05-1506-09