飼糧中谷氨酰胺添加水平對斷奶至3月齡獺兔毛皮品質(zhì)和腸道屏障的影響

劉洪麗 付朝輝 劉 磊 李福昌(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271018)

飼糧中谷氨酰胺添加水平對斷奶至3月齡獺兔毛皮品質(zhì)和腸道屏障的影響

劉洪麗 付朝輝 劉 磊*李福昌
(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271018)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧中谷氨酰胺添加水平對斷奶至3月齡獺兔毛皮品質(zhì)和腸道屏障的影響。選用體重相近的斷奶獺兔180只，隨機(jī)分為5組，每組36個重復(fù)，每個重復(fù)1只兔。各組分別飼喂谷氨酰胺添加水平為0(對照)、0.3%、0.6%、0.9%和1.2%的試驗(yàn)飼糧。預(yù)試期7 d，正試期56 d。結(jié)果表明：飼糧中谷氨酰胺添加水平對生長獺兔毛皮面積、毛皮重量、被毛長度和被毛厚度無顯著影響(P>0.05)。飼糧中谷氨酰胺添加水平對生長獺兔十二指腸絨毛高度/隱窩深度值有顯著影響(P<0.05)。與對照組相比，飼糧中添加0.9%谷氨酰胺顯著升高了空腸中閉合小環(huán)蛋白mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低了空腸中丙酮酸激酶mRNA的表達(dá)量(P<0.05)；此外，飼糧中添加0.9%谷氨酰胺顯著增加了十二指腸黏膜中分泌性免疫球蛋白A含量(P<0.05)。綜上所述，飼糧中谷氨酰胺添加水平?jīng)]有影響到生長獺兔的毛皮品質(zhì)，但改善了腸道機(jī)械屏障和免疫屏障功能。在本試驗(yàn)條件下，斷奶至3月齡獺兔飼糧中谷氨酰胺適宜的添加水平為0.9%。

谷氨酰胺；生長獺兔；腸道屏障；毛皮品質(zhì)

近年來，谷氨酰胺(Gln)的營養(yǎng)以及腸道屏障等方面的特殊功能逐漸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Gln提供腸道黏膜細(xì)胞的代謝需要，提供嘧啶、嘌呤核苷酸和氨基糖合成的前體物。許多研究發(fā)現(xiàn)，Gln在健康狀態(tài)下是一種非必需氨基酸，但在化療、饑餓、輻射療法等導(dǎo)致小腸的黏膜受損或者Gln耗竭的情況下Gln又是必需的，因此，Gln被稱為是一種條件性必需氨基酸。Windmueller[1]研究表明，Gln是腸道上皮細(xì)胞代謝的主要能源供體，也是腸上皮間淋巴組織增殖的必要營養(yǎng)物。秦環(huán)龍等[2]研究表明，Gln也是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的主要功能物質(zhì)之一，補(bǔ)充Gln可促進(jìn)分泌性免疫球蛋白A(sIgA)的分泌，降低腸細(xì)菌移位率，進(jìn)而保護(hù)腸屏障功能[3]。Hauf等[4]研究表明，在仔豬感染大腸桿菌的模式下，飼糧中添加Gln能夠緩解病情，降低病發(fā)腹瀉率。家兔的腸道壁薄，易受外界刺激，發(fā)生各類腸道疾病，特別是在斷奶階段，面臨著斷奶、更換飼料和環(huán)境變化的多重應(yīng)激，腸道負(fù)擔(dān)加重，易發(fā)生損傷。Gln是否也對家兔的腸道屏障功能有一定的改善作用目前尚未知曉。

獺兔是一種皮肉兼用兔，付朝暉等[5]研究了飼糧中不同水平的Gln對生長獺兔生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0～1.2%的Gln對生長獺兔的體增重和采食量均沒有顯著影響。但飼糧中添加Gln可促進(jìn)豬[6]和肉雞[7]的生長發(fā)育，這些結(jié)果說明物種間對Gln的需要量差異較大。獺兔的毛皮品質(zhì)決定了它的經(jīng)濟(jì)價值，毛皮品質(zhì)受到季節(jié)、年齡及營養(yǎng)水平的影響，目前已經(jīng)確定了飼糧中蛋白質(zhì)水平以及一些氨基酸(蛋氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和色氨酸)含量對獺兔毛皮品質(zhì)的影響。是否飼糧中添加Gln也能改善獺兔毛皮品質(zhì)有待于進(jìn)一步的確定。營養(yǎng)水平是影響獺兔毛皮品質(zhì)的重要因素，腸道是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位，因此，腸道健康狀況勢必要影響到獺兔的毛皮品質(zhì)，Gln也可能通過調(diào)節(jié)腸道健康來影響到獺兔的毛皮發(fā)育。因此，本試驗(yàn)在獺兔飼糧中添加不同水平的Gln，通過測定其毛皮品質(zhì)、腸道屏障指標(biāo)，旨在確定獺兔飼糧中Gln的適宜添加水平，為獺兔飼糧中Gln的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取體重[(1 050±30) g]相近的30日齡斷奶獺兔180只(公母各占1/2)，隨機(jī)分為5組，每組36個重復(fù)，每個重復(fù)1只兔。各組分別飼喂Gln添加水平為0(對照)、0.3%、0.6%、0.9%和1.2%的5種試驗(yàn)飼糧。Gln為來自北京嘉康源公司提供的L-Gln，產(chǎn)品純度為99%?；A(chǔ)飼糧參照De Blas等[8]家兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)兔采用常規(guī)飼養(yǎng)管理和免疫程序，自然采光、通風(fēng)，自由飲水，3～5 d消毒兔舍1次。預(yù)試期7 d，正試期56 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet：VA 13 500 IU，VE 15 mg，VK 1.5 mg，VB11.8 mg，VB26 mg，VB313.5 mg，VB524 mg，VB60.3 mg，VB120.024 mg，Cu 10 mg，F(xiàn)e 60 mg，Zn 70 mg，Mn 16 mg，Se 0.1 mg，生物素 biotin 0.09 mg，葉酸 folic acid 0.3 mg，地克珠利 diclazuril 5 mg。

2)營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 樣品采集和處理

試驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)抽取8只試驗(yàn)兔，立即心臟采血，37 ℃水浴40 min后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，并置于-20 ℃冷凍保存。采用頸椎錯位法致死后屠宰，分離十二指腸、空腸、回腸樣品各2份，一份用冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)清洗，放于10%新配制的冷卻后的甲醛溶液中保存，用于組織學(xué)檢測；另一份用PBS洗凈腸道內(nèi)容物后，用無菌的玻片小心刮取黏膜分裝到多個EP管內(nèi)，在液氮中速凍后，置于-80 ℃保存以待分析。

1.3 總RNA提取與實(shí)時熒光定量PCR檢測

Trizol法提取腸道組織中總RNA。將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所用的試劑盒均由TaKaRa(大連寶生物有限公司)提供。使用大連生物工程提供的試劑盒(DRR041A)，采用SYBR GreenⅠ染料法，在美國ABI7500熒光定量RCR儀上進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。引物序列見表2。數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法分析。目的基因的mRNA用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 sIgA含量檢測

用含有sIgA特異性抗體的經(jīng)過驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)檢測sIgA含量。sIgA各測定值間變異系數(shù)為2.7%。

1.5 組織學(xué)檢測

組織樣品經(jīng)過沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等處理后，以5 μm的厚度切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色。使用顯微鏡成像系統(tǒng)觀察小腸黏膜絨毛，每張切片選取5個視野，每個視野5條絨毛。用Image-Plus軟件測量絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。絨毛高度指從腸腺絨毛連接處到絨毛頂端的距離，隱窩深度指從腸腺絨毛連接處到腸腺基部的距離。

表2 引物序列

1.6 毛皮品質(zhì)的測定

毛皮重量(g)：獺兔宰殺后，取完整皮毛，大體過程為在其頸部、前肢彎關(guān)節(jié)處和后肢彎關(guān)節(jié)處用將皮環(huán)割，自陰部上側(cè)沿兩后肢內(nèi)側(cè)把皮割開，然后自下向上剝開翻轉(zhuǎn)，以退套的方式將皮剝下。將剝?nèi)〉墨H兔皮放在精確度比較靈敏的天平上稱重，即毛皮重量。

毛皮面積(cm2)：將剝?nèi)〉墨H兔皮沿中分線直線剪開，平鋪于托盤內(nèi)，使其呈自然伸張狀態(tài)，測量長度時計(jì)量方法為量取頸部至尾根處，寬度測量方法是量取腰部中間位置，一般取比較寬的部位。測量得到的長度和寬度相乘即為兔皮面積。

被毛長度(cm)：將直尺插于被毛內(nèi)，被毛長度測量從被毛根部至被毛尖部的距離，每只都應(yīng)分別測量肩部、股部及背部的被毛長度，并且都要固定同一位置，然后取3處被毛長度的平均值。

被毛厚度(cm)：用游標(biāo)卡尺測量每只試驗(yàn)兔肩部、股部及背部的皮張厚度，注意固定同一位置，然后取其平均值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，如果組間效應(yīng)差異顯著，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值與均方根誤差的形式表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有顯著趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔毛皮品質(zhì)的影響

由表3可知，飼糧中Gln添加水平對生長獺兔毛皮面積、毛皮重量、被毛長度和被毛厚度無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔毛皮品質(zhì)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道機(jī)械屏障的影響

由表4可知，飼糧中Gln添加水平對生長獺兔十二指腸絨毛高度/隱窩深度值有顯著影響(P<0.05)，而對十二指腸的絨毛高度﹑隱窩深度均無顯著影響(P>0.05)；飼糧中Gln添加水平對生長獺兔空腸和回腸的各項(xiàng)指標(biāo)(絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度值)均無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道閉合小環(huán)蛋白(ZO1)和丙酮酸激酶(PK)mRNA的表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)。與對照組相比，飼糧中添加0.9% Gln顯著增加了腸道中ZO1 mRNA的表達(dá)量，卻顯著降低了腸道中PKmRNA的表達(dá)量(P<0.05)。此外，飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA的表達(dá)量并沒有顯著影響(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Value columns with the same small letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05).

圖1 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道黏膜屏障相關(guān)蛋白和因子mRNA的表達(dá)量的影響

Fig.1 Effects of dietary Gln supplemental level on the mRNA expression of relative proteins and factors of intestinal mucosal barrier of growing Rex rabbits (n=8)

2.3 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道黏膜sIgA含量的影響

飼糧中Gln添加水平對生長獺兔回腸的sIgA含量沒有顯著影響(P>0.05)，但對十二指腸sIgA含量有顯著影響(P<0.05)。當(dāng)飼糧中Gln添加水平為0.9%時，十二指腸sIgA含量達(dá)到最大值，顯著高于其他4組(P<0.05)。飼糧中Gln添加水平對生長獺兔空腸的sIgA含量有升高趨勢的影響(0.05≤P<0.10)，當(dāng)飼糧中Gln添加水平為0.9%時達(dá)到最大值。

表5 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道黏膜sIgA含量的影響

3 討 論

3.1 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔毛皮品質(zhì)的影響

獺兔皮的面積大小可以直接決定使用價值，兔皮的絨毛品質(zhì)、板質(zhì)優(yōu)劣及面積大小是評價獺兔皮質(zhì)量優(yōu)劣的主要指標(biāo)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，毛囊細(xì)胞可以直接利用Gln和葡糖糖氧化供能[9]，因此，Gln能促進(jìn)毛囊發(fā)育，在生活中也有直接服用Gln來治療脫發(fā)的病例。但在目前的研究中，飼糧中添加Gln并沒有顯著改善獺兔的毛皮品質(zhì)，我們推測是Gln添加水平較低的原因，在斷奶后獺兔應(yīng)激反應(yīng)劇烈，此時機(jī)體對Gln的需求量增加，而我們目前的添加水平只能滿足腸道細(xì)胞的發(fā)育和恢復(fù)，對毛囊細(xì)胞的影響作用甚微。

3.2 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道機(jī)械屏障的影響

腸道機(jī)械屏障作為腸道黏膜屏障功能的重要組成部分，是腸道防御系統(tǒng)中最重要的一道屏障。腸道機(jī)械屏障由腸道黏膜上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接黏膜下固有層與菌膜三者構(gòu)成[10]。研究表明，Gln對腸道黏膜發(fā)育有一定影響，一定水平的Gln可誘導(dǎo)大鼠、仔豬腸黏膜生長，腸道小腸絨毛高度增高，隱窩深度增深[11]。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加0.3%～1.2% Gln顯著增加了斷奶至3月齡獺兔十二指腸絨毛高度/隱窩深度值，說明補(bǔ)充Gln可促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)家兔腸上皮細(xì)胞修復(fù)，防止絨毛萎縮，減輕腸黏膜損傷，進(jìn)而維持小腸黏膜的正常形態(tài)[12]。

此外，能量供應(yīng)是保證腸道細(xì)胞功能發(fā)揮的基礎(chǔ)，PK是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的重要調(diào)節(jié)酶，飼糧中添加0.9% Gln使空腸PKmRNA的表達(dá)量降低，反映了Gln對腸道的能量代謝有一定的影響。其可能的原因是腸道細(xì)胞等快速分裂的細(xì)胞也可利用Gln供能，飼糧中提供了充足的Gln，葡萄糖代謝路徑雖受到一定的抑制，但腸道細(xì)胞也可利用Gln作為能量，從而保證了腸道正常的生理功能[13]。

mTOR是另一個能量感受器，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氨基酸和能量代謝。Nicklin等[14]報道，細(xì)胞中Gln的攝取與其他必需氨基酸的相互作用是激活mTOR系統(tǒng)的限制性步驟，飼糧中Gln水平升高為必需氨基酸的攝取提供開關(guān)。但在本試驗(yàn)中，飼糧中Gln添加水平并沒有顯著影響到家兔腸道中mTORmRNA的表達(dá)量。這一發(fā)現(xiàn)與豬上的研究不一致，肖英平等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加Gln可顯著提高斷奶仔豬空腸mTORmRNA的表達(dá)量。這些結(jié)果揭示，Gln對腸道中mTOR的影響具有物種差異性。

腸黏膜對大分子物質(zhì)的通透性是評價小腸黏膜屏障功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Gln缺乏可引起大鼠腸道上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞。崔巍等[15]在對人的結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2試驗(yàn)中進(jìn)一步表明，Gln缺乏能夠增加腸道上皮細(xì)胞屏障通透性，而補(bǔ)充Gln能夠阻斷這些改變。ZO1是腸黏膜緊密連接支持結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，主要作用為連接跨膜蛋白與細(xì)胞骨架及傳遞信號分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持上皮的極性等[16]。飼糧中添加Gln能增加生長獺兔腸道中ZO1的基因表達(dá)，這一結(jié)果與斷奶仔豬上的研究結(jié)果[17]相一致。因此，Gln通過上調(diào)腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO1的表達(dá)而降低腸道上皮的通透性被認(rèn)為是其發(fā)揮腸道屏障功能的一個可能機(jī)制。

3.3 飼糧中Gln添加水平對生長獺兔腸道免疫屏障的影響

腸道作為動物體中最大的免疫器官，承擔(dān)著耐受飼糧抗原和免疫防御的雙重任務(wù)。腸道免疫應(yīng)答系統(tǒng)中的主要效應(yīng)因子是由漿母細(xì)胞分泌的sIgA，sIgA可強(qiáng)有力地與抗原結(jié)合，阻止病毒、細(xì)菌等有害抗原在腸道上皮上的黏附，并繼而促發(fā)腸道的體液和細(xì)胞免疫，最終有效免疫排斥或清除有害抗原。與仔豬上研究結(jié)果[17]相似，飼糧中添加0.9% Gln顯著提高了十二指腸和空腸黏膜中sIgA含量，但對生長獺兔回腸黏膜sIgA含量影響不顯著，說明家兔的小腸前端(十二指腸和空腸)對Gln的感應(yīng)較為敏感。此外，Gln可作為腸黏膜固有層中免疫細(xì)胞的能量來源和代謝前體，維持了淋巴細(xì)胞正常的增殖和分化，以及輔助T細(xì)胞和抑制T細(xì)胞的比例，因?yàn)橛醒芯勘砻鳎贐細(xì)胞分化為可分泌sIgA的漿細(xì)胞的過程中是受到輔助T細(xì)胞和抑制T細(xì)胞以及它們所產(chǎn)生的細(xì)胞因子影響的[18]。

4 結(jié) 論

飼糧中Gln添加水平?jīng)]有影響到生長獺兔的毛皮品質(zhì)，改善了腸道中機(jī)械屏障和免疫屏障功能，在本試驗(yàn)條件下，斷奶至3月齡獺兔飼糧中Gln適宜的添加水平為0.9%。

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*Corresponding author, lecturer, E-mail: liusanshi1985@126.com

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Dietary Glutamine Supplemental Level on Fur Quality and Intestinal Barrier of Rex Rabbits during Weaner to 3 Months of Age

LIU Hongli FU Chaohui LIU Lei*LI Fuchang
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China)

The experiment was conducted to study the effects of dietary glutamine supplemental level on fur quality and intestinal barrier of Rex rabbits during weaner to 3 months of age. One hundred and eighty weaned Rex rabbits with similar body weight were randomly assigned to 5 groups with 36 replicates in each group and 1 rabbit in each replicate. Rabbits in 5 groups were fed diets supplemented with 0 (control), 0.3%, 0.6%, 0.9% and 1.2% glutamine, respectively. The pre-test period lasted for 7 days, and the experimental period lasted for 53 days. The results showed that dietary glutamine supplemental level did not significantly affect the fur area, fur weight, hair length and hair thickness of growing Rex rabbits (P>0.05). Dietary glutamine supplemental level significantly affected the villus height to crypt depth in duodenum of growing Rex rabbits (P<0.05). Compared with the control group, dietary supplemental with 0.9% glutamine significantly increased the mRNA expression of zonula occludens in jejunum (P<0.05), but significantly reduced the mRNA expression of pyruvate kinase in jejunum (P<0.05); in addition, dietary supplemented with 0.9% glutamine significantly increased the content of secretory immunoglobulin A in duodenal mucosa (P<0.05). In conclusion, although dietary glutamine supplemental level does not affect the fur quality of growing Rex rabbits, improve the intestinal mechanical barrier and immune barrier function. Under this experimental condition, the appropriate glutamine supplemental level in the diet is 0.9% for Rex rabbits during weaner to 3 months of age.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1803-1809]

glutamine; growing Rex rabbits; intestinal barrier; fur quality

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.041

2016-11-11

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-44-B-1)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015M580601)；山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后基金(2015—1017)；山東農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金(2015—2016)

劉洪麗(1992—)，女，山東濰坊人，碩士研究生，從事家兔營養(yǎng)與代謝研究。E-mail: 1057752559@qq.com

*通信作者：劉 磊，講師，E-mail: liusanshi1985@126.com

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