Cd 脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗DNA 損傷分析

宋婕，王鶴潼，崔偉娜，孫梨宗，曹霞，何蕾，姜麗思，成智博，惠秀娟，臺(tái)培東，楊悅鎖，劉宛*

（1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽 110036；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110016；3.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院，沈陽 110163；4.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418；5.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽 110866；6.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所，內(nèi)蒙古 通遼 028000；7.沈陽大學(xué)區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110044）

Cd 脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗DNA 損傷分析

宋婕1，2，王鶴潼3，崔偉娜2，4，孫梨宗2，曹霞5，6，何蕾2，姜麗思2，成智博2，惠秀娟1，臺(tái)培東2，楊悅鎖7，劉宛2*

（1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽 110036；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110016；3.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院，沈陽 110163；4.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418；5.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽 110866；6.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所，內(nèi)蒙古 通遼 028000；7.沈陽大學(xué)區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110044）

以擬南芥為供試植物，通過基于隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）法的DNA損傷分析，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法的DNA甲基化分析以及Real-time PCR的DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)分析，研究了Cd（0、0.125、0.25、1.0、2.5 mg·L-1）脅迫5 d的擬南芥幼苗DNA損傷、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)以及細(xì)胞周期對(duì)脅迫的響應(yīng)。結(jié)果顯示，隨Cd濃度的增加DNA損傷加劇，全基因組甲基化水平較對(duì)照組顯著增加（P＜0.01或P＜0.05），細(xì)胞周期調(diào)控基因PCNA1、PCNA2，錯(cuò)配修復(fù)（MMR）基因MLH1、MSH2、MSH6，非同源末端連接（NHEJ）標(biāo)志基因KU70、MRE11、GR1，同源重組（HR）標(biāo)志基因RAD51、BRCA1的表達(dá)均與Cd脅迫濃度呈明顯的倒U型劑量效應(yīng)關(guān)系，DNA修復(fù)系統(tǒng)對(duì)Cd脅迫的敏感性依次為MMR＞HR＞NHEJ。該結(jié)果表明：輕度Cd脅迫主要引起DNA錯(cuò)配損傷，并且該損傷易修復(fù)；隨著Cd脅迫的增強(qiáng)，會(huì)引起DNA斷裂與染色體損傷，損傷較難修復(fù)。另外，對(duì)Cd脅迫響應(yīng)最敏感的MSH6、MLH1基因可作為表征Cd脅迫對(duì)于擬南芥遺傳毒性效應(yīng)的有效生物標(biāo)記物。

Cd；DNA損傷修復(fù)；DNA修復(fù)；細(xì)胞周期

2014 年，環(huán)境保護(hù)部和國土資源部聯(lián)合發(fā)布《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，全國受重金屬污染的耕地面積超過2000萬hm2，其中我國耕地土壤鎘（Cd）污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7%[1]。Cd具有極強(qiáng)的毒性及蓄積性，土壤中的Cd會(huì)在農(nóng)作物中富集，通過生物放大和積累作用，對(duì)動(dòng)物和人的腎、肝、肺、骨、生殖和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一系列損傷[2]。近年來，Cd對(duì)于生物的毒性，特別是遺傳毒性[3-5]已在全球范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注。

目前，關(guān)于Cd的生態(tài)遺傳毒理研究已有很多報(bào)道，馬引力等[6]和張旭紅等[7]報(bào)道了Cd脅迫可對(duì)小麥和蠶豆造成不同類型的DNA損傷；Pierron等[8]發(fā)現(xiàn)，長期Cd脅迫會(huì)造成歐洲鱔魚的基因組甲基化水平升高，引起表觀遺傳損傷；本實(shí)驗(yàn)室近年來研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫會(huì)導(dǎo)致擬南芥幼苗基因組甲基化圖譜改變，引起表觀遺傳損傷[9-11]。雖有證據(jù)表明Cd脅迫會(huì)造成動(dòng)、植物遺傳損傷，然而對(duì)Cd脅迫誘導(dǎo)植物DNA損傷修復(fù)機(jī)制的研究比較少。

研究表明，Cd對(duì)基因組穩(wěn)定性的損傷多為非直接的，而是通過引起氧化損傷以及對(duì)DNA修復(fù)系統(tǒng)酶系的抑制[12-13]，使大量未修復(fù)的DNA在細(xì)胞中積累并隨細(xì)胞周期大量復(fù)制，引起基因突變率和基因組不穩(wěn)定性升高[14]，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。植物針對(duì)不同類型的DNA損傷有多種修復(fù)途徑，如修復(fù)單核苷酸損傷的堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)途徑、錯(cuò)配修復(fù)以及對(duì)雙鏈斷裂進(jìn)行修復(fù)的非同源末端連接（Nonhomologousendjoining，NHEJ）和同源重組（Homologous recombination，HR）[15-16]。Jia等[17]報(bào)道了乙基甲磺酸誘導(dǎo)擬南芥jhs1幼苗中DNA損傷明顯，DNA修復(fù)相關(guān)的BRCA1、RAD51、GR1、KU70、MRE11基因表達(dá)明顯上調(diào)。但是，目前關(guān)于Cd脅迫對(duì)擬南芥HR和NHEJ系統(tǒng)基因表達(dá)的影響，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本文使用RAPD方法對(duì)Cd脅迫5 d的擬南芥幼苗DNA損傷情況進(jìn)行了檢測。同時(shí)采用ELISA方法，探究了不同濃度Cd處理對(duì)擬南芥幼苗全基因組DNA甲基化的影響，并分析了多個(gè)DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，首次在脅迫損傷、損傷后修復(fù)及細(xì)胞周期響應(yīng)三個(gè)層面研究了Cd脅迫造成的擬南芥幼苗DNA損傷及其修復(fù)機(jī)制，并尋找對(duì)Cd脅迫敏感的生物標(biāo)記物。

1 材料方法

1.1 供試材料的培養(yǎng)與處理

實(shí)驗(yàn)選用擬南芥（Arabidopsis thaliana，哥倫比亞生態(tài)型）為材料。種子經(jīng)10%次氯酸鈉及70%乙醇溶液消毒、滅菌，水中4℃春化24～48 h后，用含CdCl2（以Cd2+計(jì)）0、0.125、0.25、1.0、2.5 mg·L-1的0.5×M&S培養(yǎng)基（Caisson，美國，0.5%蔗糖）于21℃培養(yǎng)5 d，光暗周期為12 h/12 h，光強(qiáng)為3000 lx。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 核酸的提取

將相同處理長勢良好的整株幼苗進(jìn)行混合后提取核酸[18-19]，使用北京康維世紀(jì)生物科技有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531）提取幼苗全基因組DNA；使用EZ-10 DNAaway RNA Miniprep Kit（生工，上海）提取全基因組RNA。所得DNA及RNA用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀對(duì)其純度及含量進(jìn)行檢測，用1%瓊脂糖凝膠電泳及Takara DL2000 DNA Marker進(jìn)行含量校準(zhǔn)。

1.3 RAPD分析

RAPD分析參照Liu等[9，20]的方法進(jìn)行，對(duì)PCR條件略加優(yōu)化，引物選用Primer 3：5′-CTGCGCTGGA-3′；Primer 5：5′-CTGGGGCTGA-3′；Primer 9：5′-AAAGTGC GGC-3′；Primer11：5′-AGACCCAGAG-3′。

隨機(jī)引物擴(kuò)增使用的PCR體系如下：80 ng DNA模板，0.5 μmol·L-1引物，0.2 mmol·L-1dNTP Mixture，1×PCR Buffer以及1 U LA Taq DNA聚合酶（寶生物，大連），并用ddH2O補(bǔ)足體系體積至25 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃60 s，38℃60 s，72℃90 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用5%聚丙烯酰氨凝膠電泳（50%尿素）進(jìn)行分離，經(jīng)銀染后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，并使用Image Lab（Bio-Rad）軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。處理組與對(duì)照組比較，增加或缺失條帶記為1個(gè)多態(tài)性條帶，條帶亮度增加或減少一半以上，記為0.5個(gè)多態(tài)性條帶。同一個(gè)多態(tài)性條帶在3次重復(fù)中出現(xiàn)2次及以上記為有效多態(tài)性條帶。

1.4 全基因組甲基化率的測定

參照Keller等[21]的方法，使用5-mC DNA ELISA Ki（tZYMO，美國）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)各組幼苗全基因組DNA進(jìn)行全基因組甲基化率分析。

1.5 Real-time PCR分析

使用PrimeScript R1st Strand cDNA Synthesis Kit（寶生物，大連）對(duì)所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個(gè)處理組取3 μg RNA合成相應(yīng)的cDNA，用于后續(xù)的Real-time PCR反應(yīng)，合成的cDNA于-20℃保存。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件和Microsoft Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對(duì)擬南芥幼苗根系生長的影響

如表2所示，對(duì)照組與處理組幼苗葉片數(shù)均為2。0.125 mg·L-1Cd對(duì)擬南芥幼苗根系生長有顯著的促進(jìn)作用，根長誘導(dǎo)率為16.85%（P＜0.05）。0.25 mg· L-1Cd脅迫對(duì)幼苗根系的影響表現(xiàn)為促進(jìn)生長，但與對(duì)照組并沒有顯著差異。高濃度處理組（1.0、2.5 mg· L-1Cd）對(duì)根系的生長表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)，根系抑制率分別為52.56%（P＜0.05）和65.17%（P＜0.01）。

2.2 Cd脅迫導(dǎo)致擬南芥幼苗DNA損傷情況

圖1為Cd脅迫5 d的擬南芥幼苗基因組DNA使用隨機(jī)引物Primer 3、11擴(kuò)增后的RAPD圖譜，在200～2000 bp范圍內(nèi)，每條泳道均有10條以上條帶，適于進(jìn)行RAPD分析。對(duì)4條隨機(jī)引物擴(kuò)增圖譜中多態(tài)性條帶數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。Cd脅迫處理5 d后，與對(duì)照組相比，0.125 mg·L-1Cd脅迫幼苗中可檢測出3條多態(tài)性條帶。隨著Cd脅迫濃度的增加，處理組中檢測到的多態(tài)性條帶數(shù)量有所增加，0.25、1.0、2.5 mg·L-1Cd處理組多態(tài)性條帶數(shù)量分別為10、12、17。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers used in experiment

2.3 Cd脅迫對(duì)擬南芥幼苗全基因組甲基化的影響

如圖3所示，隨著Cd處理濃度的增加，擬南芥幼苗全基因組甲基化率有所增加，兩者呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。Cd脅迫5 d后，對(duì)照組全基因組甲基化率為20.19%；0.125 mg·L-1Cd處理組的全基因組甲基化率略高于對(duì)照組，但并無顯著差異；0.25 mg·L-1處理組全基因組甲基化率為25.94%，與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）；1.0、2.5 mg·L-1Cd處理后擬南芥幼苗全基因組甲基化率分別為30.25%、32.30%，與對(duì)照組有極顯著差異（P＜0.01）。

表2 Cd處理對(duì)擬南芥幼苗葉片數(shù)、根長的影響Table 2 Effects of Cd on leaf numbers and root length of Arabidopsis seedlings

圖1 Cd脅迫5 d后擬南芥幼苗RAPD圖譜Figure 1 RAPD fingerprints of Arabidopsis seedlings exposed to 0～2.5 mg·L-1Cd for 5 d

圖2 Cd脅迫5 d后擬南芥幼苗DNA隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性Figure 2 Polymorphism variations detected by RAPD from Arabidopsis seedlings exposed to 0～2.5 mg·L-1Cd for 5 d

圖3 Cd脅迫5 d后擬南芥幼苗全基因組甲基化率Figure 3 Global methylation levels of Cd-induced Arabidopsis seedlings for 5 d

2.4 Cd脅迫對(duì)擬南芥幼苗基因表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以UBQ10為看家基因，檢測擬南芥幼苗基因在不同濃度Cd脅迫5 d后的相對(duì)表達(dá)情況（以對(duì)照組各基因的表達(dá)量為100%）。如圖4A所示，在0.125 mg·L-1Cd脅迫下，PCNA1、PCNA2基因的表達(dá)量均顯著增加1.5倍左右；在Cd脅迫濃度為0.25 mg·L-1時(shí)，PCNA1基因表達(dá)量仍然顯著增加，而PCNA2基因與對(duì)照組相比并無顯著差異。1.0 mg·L-1Cd脅迫下，PCNA1、PCNA2基因的表達(dá)與對(duì)照組相比均無顯著性差異。Cd脅迫濃度增至2.5 mg·L-1時(shí)，兩個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)均受到明顯抑制，表達(dá)量僅為對(duì)照組的52.7%和66.6%。

擬南芥幼苗錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6在Cd脅迫5 d后表達(dá)情況如圖4B所示。Cd脅迫濃度為0.125 mg·L-1時(shí)，MLH1、MSH6的表達(dá)均增加至原來的1.5倍以上，MSH2的表達(dá)與對(duì)照組相比無顯著差異；0.25 mg·L-1Cd脅迫下，MLH1的表達(dá)與對(duì)照組并無顯著差異，MSH2、MSH6基因的表達(dá)與對(duì)照組相比仍然顯著增加；1.0、2.5 mg·L-1Cd脅迫下，3個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因的表達(dá)均受到明顯抑制。總體上，隨Cd脅迫濃度的增加，錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6的表達(dá)均呈明顯的倒U型。

Cd脅迫5 d對(duì)擬南芥幼苗DNA損傷修復(fù)標(biāo)志基因表達(dá)的影響如圖4C所示。5個(gè)基因的表達(dá)隨Cd脅迫濃度的增加均呈現(xiàn)倒U型劑量效應(yīng)關(guān)系。RAD51、MRE11、KU70、BRCA1的表達(dá)最大值分別出現(xiàn)在0.125、0.25、0.25、1.0 mg·L-1，最大表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.44、1.69、1.72、1.71倍。Cd脅迫濃度增至2.5 mg·L-1時(shí)，這4個(gè)基因仍然未表現(xiàn)出顯著的表達(dá)抑制，且BRCA1和KU70基因的表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組。GR1雖也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，但在0.25、1.0 mg·L-1Cd脅迫下表達(dá)量的變化與對(duì)照組相比并無顯著差異，在2.5 mg·L-1Cd脅迫下表現(xiàn)出明顯的表達(dá)抑制，表達(dá)量降至對(duì)照組的51.4%。

圖4 Cd脅迫5 d后擬南芥幼苗細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)標(biāo)志基因的表達(dá)情況Figure 4 Expression levels of marker genes from Cd-induced Arabidopsis seedlings for 5 d

3 討論

3.1 Cd脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗DNA損傷

0.125～2.5 mg·L-1Cd處理組均檢測到多態(tài)性條帶（圖2），且隨著脅迫程度的增加，RAPD多態(tài)性條帶明顯增加，DNA損傷加重，二者呈劑量效應(yīng)關(guān)系。這與Wang等[10]的結(jié)果雖略有不同，但趨勢一致。Cd脅迫15 d時(shí)，Wang等在0.25 mg·L-1及以下濃度Cd處理組未檢測到多態(tài)性，其可能原因一是本研究選用了擴(kuò)增能力極強(qiáng)的LA Taq DNA聚合酶，使得RAPD圖譜中，同等處理?xiàng)l件下條帶更多且長片段居多，敏感性得以增強(qiáng)，更易檢測出DNA損傷。二是脅迫時(shí)間不同造成的差異：在低濃度Cd脅迫下，脅迫5 d后的幼苗中DNA損傷可能由于時(shí)間較短不能及時(shí)修復(fù)，而脅迫15 d后，由于錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)增強(qiáng)，錯(cuò)配等輕損傷已經(jīng)得到修復(fù)，導(dǎo)致5 d Cd脅迫損傷大于15 d；在高濃度Cd脅迫下，損傷涉及染色體損傷與分裂異常重組，較難恢復(fù)，而且修復(fù)系統(tǒng)同樣會(huì)受到抑制，還可激活跨損傷DNA合成機(jī)制[28]，導(dǎo)致15 d Cd脅迫擬南芥幼苗的DNA損傷顯著高于5 d Cd脅迫。

3.2 Cd脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗全基因組超甲基化

植物全基因組甲基化水平是反映植物脅迫響應(yīng)、基因組不穩(wěn)定性以及遺傳損傷的重要指標(biāo)[29-30]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脅迫引起的全基因組甲基化改變既可以呈現(xiàn)超甲基化又可以表現(xiàn)為低甲基化[13]。在本研究中，隨著Cd脅迫濃度的增加，擬南芥幼苗全基因組甲基化率增加（超甲基化），且兩者呈明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。目前研究認(rèn)為，全基因組超甲基化一般為低劑量毒害導(dǎo)致的生物脅迫響應(yīng)。Pierron等[8]和Jiang等[31]報(bào)道了低劑量Cd能誘導(dǎo)歐洲鱔魚、人胚胎肺纖維組織母細(xì)胞全基因組甲基化水平升高。而全基因組低甲基化一般是遺傳嚴(yán)重?fù)p傷的表現(xiàn)，難于恢復(fù)或逆轉(zhuǎn)，并可激活跨損傷復(fù)制[32]，將損傷傳遞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡或癌變。如Pogribny等[33]研究發(fā)現(xiàn)，輻射誘導(dǎo)的小鼠基因組低甲基化與DNA損傷修復(fù)有關(guān)；Silva等[34]研究表明，全基因組低甲基化與結(jié)腸直腸癌有關(guān)。然而，無論基因組呈現(xiàn)超甲基化或是低甲基化，都會(huì)增加基因組的不穩(wěn)定性，因?yàn)槊{迫引起的改變本身比改變方向更為重要[35]。在本研究中，Cd脅迫幼苗雖都呈現(xiàn)超甲基化，但其劑量效應(yīng)變化趨勢卻與RAPD結(jié)果一致，說明隨Cd脅迫的增強(qiáng)，遺傳損傷與基因組不穩(wěn)定性增加（圖2、圖3）。類似的結(jié)果在Cd脅迫誘導(dǎo)的蘿卜[36]中也有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用簡便、高效的ELISA試劑盒對(duì)全基因組甲基化率進(jìn)行測定，與傳統(tǒng)的HPLC法、MSAP法以及本實(shí)驗(yàn)室之前發(fā)展的MSAP-PCR方法[37]相比，更加快速、簡單，無需設(shè)計(jì)、篩選引物等。然而，缺點(diǎn)在于無法檢測出具體超甲基化及去甲基化的細(xì)節(jié)，只可檢測整體水平基因組甲基化情況，比較適合甲基化的快速檢測。

3.3 Cd脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗DNA修復(fù)機(jī)制及細(xì)胞周期響應(yīng)

增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating cell nuclear anti gen，PCNA），是存在于所有真核生物細(xì)胞核中的一種蛋白復(fù)合物，是誘導(dǎo)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變的標(biāo)志基因之一[38]，在DNA合成與修復(fù)中也被作為常用的增殖標(biāo)志物，檢測PCNA是研究細(xì)胞增殖活性與細(xì)胞周期的可靠方法[39]。在擬南芥中，PCNA的同源基因?yàn)镻CNA1和PCNA2，二者均參與DNA修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控過程。本研究中，在Cd脅迫濃度為0.125 mg·L-1時(shí)，這2個(gè)基因的表達(dá)均明顯增加（圖4A），隨后開始下降，到2.5 mg·L-1時(shí)表達(dá)受到明顯抑制，說明低濃度Cd脅迫促進(jìn)擬南芥生長，隨著脅迫濃度增加開始出現(xiàn)生長抑制，與幼苗根系的生長一致（表2）。類似的結(jié)果在Cd脅迫60 h[40]的擬南芥幼苗中也有報(bào)道。

本研究通過分析DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)情況，從損傷后修復(fù)角度探索了Cd脅迫下擬南芥幼苗DNA損傷機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)：（1）低濃度Cd脅迫可以引起擬南芥幼苗的DNA錯(cuò)配損傷，由于該損傷可被MMR系統(tǒng)修復(fù)，因此MMR基因MLH1、MSH2、MSH6在0.125、0.25 mg·L-1Cd脅迫下表達(dá)顯著增加。雖然MMR系統(tǒng)在識(shí)別錯(cuò)配后會(huì)激活DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)阻滯細(xì)胞周期，但由于脅迫濃度低、損傷小、易修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯程度較低，而脅迫響應(yīng)誘導(dǎo)了PCNA1、PCNA2基因的表達(dá)增加（S期DNA合成增加），反而代償了錯(cuò)配損傷的細(xì)胞周期阻滯，而且進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞增殖加快，促進(jìn)了擬南芥幼苗生長。（2）隨著Cd脅迫增加，誘導(dǎo)擬南芥幼苗產(chǎn)生染色體損傷和有絲分裂異常重組，表現(xiàn)在同源重組和非同源末端連接相關(guān)基因的表達(dá)增加；另外，因PCNA2基因表達(dá)降低，細(xì)胞周期開始出現(xiàn)阻滯，細(xì)胞分裂減弱，生長受到抑制（表2）。（3）當(dāng)Cd脅迫濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，MMR基因表達(dá)受到明顯抑制，而BRCA1基因表達(dá)量達(dá)到最大值，說明此時(shí)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)受到抑制，參與DNA損傷修復(fù)的是HR與NHEJ途徑。在最大濃度2.5 mg·L-1Cd脅迫下，所有修復(fù)與細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)均明顯下降（圖4），說明此時(shí)DNA損傷嚴(yán)重，可能修復(fù)基因本身或相關(guān)調(diào)控基因已經(jīng)受到損傷，所有修復(fù)途徑均被抑制。這與本文中DNA損傷以及甲基化損傷在此濃度下明顯增加的結(jié)果一致。

3.4 DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)作為對(duì)Cd脅迫敏感的生物標(biāo)記物

生物標(biāo)記物可準(zhǔn)確高效地指示出生物體受到環(huán)境脅迫的情況，尋找敏感的生物標(biāo)記物已成為當(dāng)今污染診斷和脅迫毒理研究中的熱點(diǎn)之一[5，11]。本研究結(jié)果顯示，擬南芥幼苗在Cd脅迫5 d后，隨著脅迫濃度的增大，各損傷修復(fù)基因表達(dá)變化量以及達(dá)到峰值的先后順序?yàn)椋篗SH6、MLH1、RAD51、MLH2、MRE11、KU70、BRCA1、GR1。在對(duì)Cd脅迫敏感度上，DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)總體表現(xiàn)為MMR＞HR＞NHEJ。其中，MSH6和MLH1基因在0.125 mg·L-1Cd脅迫下表達(dá)差異最顯著，均在1.5倍以上。MSH2雖然有著最顯著的表達(dá)差異，但其峰值出現(xiàn)在0.25 mg·L-1，在敏感性上弱于MSH6、MLH1基因。這可能是因?yàn)镸SH2與MSH6共同形成MutLα復(fù)合體，而MSH6基因有研究證明是Cd的脅迫靶位點(diǎn)[41]，從而導(dǎo)致MSH6的敏感性高于MSH2。綜合本研究檢測的8個(gè)DNA損傷修復(fù)基因在對(duì)Cd脅迫敏感性與響應(yīng)顯著性上的表現(xiàn)，MSH6、MLH1基因可作為擬南芥中對(duì)Cd脅迫敏感的生物標(biāo)記物。

4 結(jié)論

（1）Cd（0.125～2.5 mg·L-1）脅迫5 d后，脅迫濃度越大，擬南芥幼苗受到的DNA損傷和表觀遺傳損傷越嚴(yán)重。

（2）在對(duì)Cd脅迫敏感度上，擬南芥DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)總體表現(xiàn)為MMR＞HR＞NHEJ。輕度Cd脅迫主要引起DNA錯(cuò)配損傷，同時(shí)促進(jìn)生長。隨著Cd脅迫濃度的增大，會(huì)引起DNA斷裂與染色體損傷，從而造成細(xì)胞周期阻滯與生長抑制。

（3）本文檢測的細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)均與Cd脅迫濃度的增加呈明顯的倒U型劑量效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)各損傷修復(fù)基因表達(dá)變化量以及達(dá)到峰值的先后順序，擬南芥幼苗MSH6、MLH1基因的表達(dá)對(duì)Cd脅迫最為敏感，可作為檢測Cd脅迫對(duì)植物遺傳毒性效應(yīng)的敏感生物標(biāo)記物。

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Analysis of Cd-induced DNA damage in Arabidopsis seedlings

SONG Jie1,2,WANG He-tong3,CUI Wei-na2,4,SUN Li-zong2,CAO Xia5,6,HE Lei2,JIANG Li-si2,CHENG Zhi-bo2,HUI Xiu-juan1,TAI Peidong2,YANG Yue-suo7,LIU Wan2*
（1.School of Environmental Science,Liaoning University,Shenyang 110036,China;2.Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering,Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,China;3.Liaoning He University,Shenyang 110163,China;4.Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China;5.Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China;6. Institute of Vegetable Science,Tongliao Academy of Agricultural Sciences,Tongliao 028000,China;7.Laboratory of Ecological Restoration of Polluted Environment and Resource Technology,Shenyang University,Shenyang 110044,China）

DNA damage assay based on RAPD,ELISA-based global methylation analysis,and expression analysis of genes related to DNA damage,repair,and cell cycle were used to study genomic DNA damage and stress response of DNA repair and cell cycle in Arabidopsis plantlets exposed to 0,0.125,0.25,1.0 mg·L-1and 2.5 mg·L-1cadmium（Cd）for 5 d.Compared with the control,DNA damage and global methylation rate were increased significantly with the increased Cd dose,and expression of cell division genes（PCNA1 and PCNA2）, MMR genes（MLH1,MSH2 and MSH6）,homologous recombination genes（RAD51 and BRCA1）,and non-homologous end joininggenes（KU70,MRE11 and GR1）were followed an obvious inverted U-shaped dose-response effect of Cd exposures and a MMR＞HR＞NHEJ sensitivity rule.The results showed that low-dose Cd result in easy-repaired mismatch damage,and high-dose Cd stress cause difficult-repaired chromosome damage and double strand break,which could accumulate and aggravate with the stress duration.In addition,the expression of MSH6 and MLH1 is the most sensitive indicator which could be a sensitive biomarker,applied to early diagnosis and risk assessment of genotoxic effects of Cd pollution in ecotoxicology.

Cd;DNA damage;DNA repair;cell cycle

X171.5

A

1672-2043（2017）04-0635-08

10.11654/jaes.2016-1467

2016－11－21

宋婕（1990—），女，遼寧沈陽人，碩士研究生，從事分子生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail：joy_cpu@126.com

*通信作者：劉宛E-mail：liuwan63@hotmail.com

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21677151，41673232，41472237）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016YFD0800305）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（21677151，41673232，41472237）；The National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China（2016YFD0800305）

宋婕，王鶴潼，崔偉娜，等.Cd脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗DNA損傷分析[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（4）：635-642.

SONG Jie,WANG He-tong,CUI Wei-na,et al.Analysis of Cd-induced DNA damage in Arabidopsis seedlings[J].Journal of Agro-Environment Science, 2017,36（4）:635-642.