富勒烯對大型蚤的急性毒性和慢性毒性效應

黃勃銘，呂小慧，王秋麗，朱小山，周進，蔡中華

（1.清華大學環(huán)境學院，北京 100084；2.清華大學深圳研究生院，廣東 深圳 518000；3.哈爾濱工業(yè)大學深圳研究生院，廣東 深圳 518000；4.遼寧省環(huán)境監(jiān)測實驗中心，沈陽 110161）

富勒烯對大型蚤的急性毒性和慢性毒性效應

黃勃銘1，2，呂小慧2，3，王秋麗4，朱小山2*，周進2，蔡中華2

（1.清華大學環(huán)境學院，北京 100084；2.清華大學深圳研究生院，廣東 深圳 518000；3.哈爾濱工業(yè)大學深圳研究生院，廣東 深圳 518000；4.遼寧省環(huán)境監(jiān)測實驗中心，沈陽 110161）

為深入理解富勒烯（Fullerene，nC60）的水生生態(tài)毒理效應，以模式動物大型蚤（Daphnia magna）為研究對象，研究nC60對大型蚤的48 h和72 h急性毒性效應以及21 d慢性毒性效應。結(jié)果表明，急性暴露下，nC60對大型蚤的48 h半抑制濃度（EC50）和半致死濃度（LC50）分別為25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1，72 h的EC50和LC50分別為14.9 mg·L-1和16.3 mg·L-1，且大型蚤的跳躍頻率和心跳頻率隨著在nC60中暴露時間的延長先增加后減少；慢性暴露下，1 mg·L-1的nC60即可對大型蚤的繁殖產(chǎn)生影響，21 d內(nèi)總產(chǎn)蚤數(shù)和平均產(chǎn)蚤數(shù)分別為53.3個和0.3個，與對照相比明顯降低。研究結(jié)果表明，無論急性還是慢性暴露下，nC60均顯著抑制大型蚤的生長和繁殖，其水生生態(tài)毒性不容忽視。

大型蚤；nC60；急性毒性；慢性毒性

富勒烯（nC60）作為一種典型的人工納米材料，以其優(yōu)良的性質(zhì)，被人們越來越多地利用，相關(guān)產(chǎn)品遍布人類生產(chǎn)、生活的方方面面[1]。盡管人們對nC60和其他納米材料應用的研究日益豐富、寬泛，但對它們的毒理學和環(huán)境效應所知甚少。大量證據(jù)表明nC60會對人類細胞、細菌和動物產(chǎn)生毒害[2-4]，毒性影響包括改變革蘭氏陰性菌和陽性菌細胞膜組分，引起細胞死亡等[5-6]。此外，nC60引起人類淋巴細胞的DNA損傷和小鼠肺毒性也已被科學家證實。然而，關(guān)于nC60對水環(huán)境生態(tài)效應的研究目前仍較少。

大型蚤是水生浮游動物的代表，是連接水生食物鏈的重要中間體，對凈化水體有重要作用，其初級生產(chǎn)量直接影響水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[7-8]。由于大型蚤具有的普遍性、敏感性和生命周期短等特點，使其成為國內(nèi)外水生生物毒理學研究的標準測試生物，廣泛用于水生生物風險評估測試。目前，國內(nèi)外學者對nC60的水生態(tài)毒理學做了初步研究。Tao等[9]對出生24 h的幼蚤進行急性毒性實驗，結(jié)果表明nC60暴露48 h的LC50為0.44 mg·L-1，在極低的濃度即產(chǎn)生明顯急性毒性；其實驗還發(fā)現(xiàn)延長暴露時間不僅對母蚤產(chǎn)生毒性，而且對其后代產(chǎn)生不利影響。Tervonen等[10]研究了不同濃度下大型蚤對nC60的生物富集情況，發(fā)現(xiàn)在不同暴露濃度下nC60均能被大型蚤迅速攝入，卻很難被排出體外，這使得nC60在腸道內(nèi)形成大量累積。Tao等[11]還發(fā)現(xiàn)斜生柵藻長期暴露在nC60中，其葉綠素含量減少，光合作用受到抑制，從而使多糖、蛋白和脂質(zhì)等光合產(chǎn)物的合成量降低。Britto等[12]發(fā)現(xiàn)在紫外光照射下，nC60和低濃度藻毒素（50 μg· L-1）共同作用會使錦鯉的抗氧化能力受到損傷。nC60與現(xiàn)有污染物的聯(lián)合毒性不容忽視。另外，nC60長期暴露對大型蚤所產(chǎn)生的慢性毒性效應仍不清楚。

本文較為全面地考察了nC60對大型蚤的急性和慢性毒性，分別從抑制率、死亡率、跳躍頻率和心跳頻率等方面展開對急性毒性的研究，從21 d的總產(chǎn)蚤量和日產(chǎn)蚤量兩方面對慢性毒性進行評估，旨在為評估nC60的水環(huán)境風險提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗生物

模式生物大型蚤由南開大學贈送，體長為（3.7± 0.2）mm，并按照Tao等[13]方法進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（21±1）℃，溶解氧為6 mg·L-1，光暗周期16 h/8 h，每天定時投喂斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）。斜生柵藻的培養(yǎng)參照趙麗紅[14]的方法。

1.2 實驗試劑

nC60購于南京先豐納米材料有限公司，雜質(zhì)包含C70、C60的氧化物，以及微量溶劑和極少量高富勒烯，純度大于99.5%。其余試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純或分析純，純度均高于99.0%。玻璃儀器在使用前均用10.0%濃硝酸浸泡48 h，并用去離子水沖洗干凈。

1.3 儲備液的制備

試驗體系是曝氣3 d的自來水，pH 7.4，總有機碳（TOC）為1.6 mg·L-1，水中Ti、Cu、Cd和Pb的質(zhì)量濃度分別為0、60、70、9 ng·L-1（ICP-MS）。取20 mg nC60溶于100 mL曝氣3 d的自來水中，連續(xù)超聲24 h，直至形成橙黃色液體，然后配成200 mg·L-1的nC60儲備液待用[15]。用曝氣3 d的自來水稀釋nC60儲備液，分別制備5、20、40 mg·L-1的nC60懸浮液待用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 實驗方法

1.4.1 急性毒性實驗

配備濃度為0、1、5、10、20、40 mg·L-1的懸浮液200 mL，在100 mL小燒杯中分別加入各個濃度懸浮液50 mL，每個燒杯加入10頭大型蚤（蚤齡5 d）。每個濃度設置3個平行樣，靜水放置72 h。大型蚤活動抑制和死亡的判斷標準如下：反復轉(zhuǎn)動燒杯，15 s內(nèi)失去活動能力即視為活動抑制；將大型蚤在顯微鏡下觀察，心臟停止跳動即視為死亡。每24 h觀察抑制數(shù)和死亡數(shù)[8]。另外，分別在0、2、4、8、12、24、48、72 h時將1頭蚤依次轉(zhuǎn)入裝有10 mL對應濃度的懸浮液的比色管中，肉眼計數(shù)其在30 s內(nèi)的跳躍次數(shù)，每頭蚤數(shù)2次，共數(shù)5頭，求取平均跳躍頻率[10]。在上述相同暴露時間下，取3頭蚤依次在光學顯微鏡下觀察其心跳并拍攝視頻，計數(shù)其在30 s內(nèi)的心跳次數(shù)，計算平均心跳頻率[10]。

1.4.2 慢性毒性實驗

實驗單元為100 mL的燒杯內(nèi)含50 mL的nC60水溶液。實驗設置0、0.1、1.0 mg·L-1三個濃度處理組，每個濃度組設置三個平行。每個實驗單元包含10頭7 d蚤齡的大型蚤，每天計數(shù)新生小蚤的個數(shù)，并將小蚤從實驗單元分離后更換暴露液。大型蚤每天以斜生柵藻喂食，并保證暴露液中藻細胞濃度為2×104個· mL-1，持續(xù)記錄21 d后，計算每頭成蚤21 d內(nèi)的日均產(chǎn)蚤數(shù)。為確保水的質(zhì)量，每4 d對水的溫度、溶解氧、pH、電導率和堿度進行監(jiān)測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用EPA提供的專業(yè)軟件Probit計算nC60對大型蚤的48 h和72 h的EC50和LC50，采用SPSS對數(shù)據(jù)進行方差分析（One Way ANOVA）及Turkey′s Test分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗

如圖1和圖2所示，大型蚤的抑制數(shù)和死亡數(shù)隨著nC60濃度的增加而增加，對于蚤齡為5 d的大型蚤，nC60對其的48 h和72 h的EC50和LC50如表1所示。與暴露48 h相比，nC60對大型蚤的72 h EC50和LC50值均顯著降低，表明暴露時間越長，nC60對大型蚤的毒性越強，說明暴露時間對于評價污染物毒性具有關(guān)鍵性作用。

圖1 nC60對大型蚤的活動抑制Figure1 Immobilization of D.magna after exposure to nC60

圖2 nC60對大型蚤的致死率Figure 2 Mortality of D.magna after exposure to nC60

表1 nC60對大型蚤的EC50和LC50Table 1 EC50and LC50of nC60to D.magna

如圖3所示，單一濃度組在實驗開始的階段，大型蚤的跳躍頻率不斷增加，與暴露時間呈正相關(guān)；但是隨著暴露時間的延長，大型蚤的跳躍頻率逐漸降低，游動變得遲緩。對于不同的濃度組，大型蚤跳躍頻率的變化趨勢基本相同，只是跳躍頻率的峰值和達到峰值的時間有所不同：0、1、5、10、20、40 mg·L－1濃度組在實驗結(jié)束時的跳躍頻率分別為116、116、105、71、22、0次·min－1，跳躍頻率分別在暴露48、24、12、8、2、2 h達到峰值，分別為124、154、156、152、152、142次·min－1。

圖3 nC60對大型蚤跳躍頻率影響Figure 3 Effect of nC60on hop frenquency of D.magna

如圖4所示，對于單一濃度組在實驗開始的階段，大型蚤的心跳頻率不斷增加，與暴露時間呈正相關(guān)；但是隨著暴露時間的延長，大型蚤的心跳頻率逐漸降低。對于不同的濃度組，大型蚤跳躍頻率的變化趨勢基本相同，但實驗結(jié)束時的心跳頻率、達到峰值的時間和峰值有所不同：0、1、5、10、20、40 mg·L－1濃度組的心跳頻率分別在暴露48、12、8、8、4、4 h達到峰值，分別為150、200、198、219、204、220次·min-1。

圖4 nC60對大型蚤心跳頻率影響Figure 4 Effect of nC60on heartbeat frenquency of D.magna

2.2 慢性毒性實驗

如表2所示，大型蚤暴露于nC6021 d后，0.1 mg· L-1濃度組中大型蚤的總產(chǎn)蚤數(shù)下降，1.0 mg·L-1濃度組中大型蚤的平均產(chǎn)蚤數(shù)和總產(chǎn)蚤數(shù)均顯著下降，且在暴露5 d后，出現(xiàn)大型蚤死亡現(xiàn)象。21 d慢性實驗表明，nC60在較低濃度下（1 mg·L-1）仍能對大型蚤產(chǎn)生明顯毒性效應，再一次說明暴露時間對評價毒物毒性的關(guān)鍵性。

表2 nC60對大型蚤的21 d慢性毒性Table 2 21d chronic toxicity of nC60to Daphnia magna

3 討論

本實驗測定了自來水體系中TOC和幾種主要有毒金屬的含量，結(jié)果表明其濃度都很低，不會對大型蚤急性和慢性毒性實驗產(chǎn)生影響。

急性毒性是評價污染物毒性的基本指標。本研究中nC60對蚤齡為5 d的大型蚤48 h的EC50和LC50分別為25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1，Tao等[9]和Zhu等[16]研究表明nC60對大型蚤48 h的LC50分別為0.4 mg· L-1和0.8 mg·L-1。實驗結(jié)果的差異可能與大型蚤的蚤齡有關(guān)（后者所用蚤均為蚤齡小于24 h的幼蚤），也可能與儲備液的制備方法有關(guān)。傳統(tǒng)的急性毒性實驗一般將暴露時間設置為48 h，但由于nC60在大型蚤體內(nèi)的高度累積，本實驗將暴露時間延長至72 h，以探究nC60的毒性指標是否出現(xiàn)明顯變化。實驗結(jié)果顯示其72 h的EC50和LC50都出現(xiàn)顯著降低，表明將暴露時間延長至72 h也許對評估nC60的毒性更有意義。慢性毒性是評價污染物長期毒性的指標。在本研究中，1 mg·L-1濃度的nC60短時間內(nèi)并未對大型蚤產(chǎn)生明顯毒性效應，但是21 d慢性實驗表明nC60在較低濃度下（1 mg·L-1）仍能對大型蚤產(chǎn)生明顯毒性效應。晏曉敏等[17]發(fā)現(xiàn)nC60在濃度低至0.5 mg·L-1時能顯著降低大型蚤14 d暴露的孵化幼蚤數(shù)，在種群水平對大型蚤產(chǎn)生影響。與傳統(tǒng)的污染物相比，nC60的慢性毒性低于Ni和壬基苯酚，但是高于兩種主要樹脂酸：脫氫乙酸和松香酸[18-20]。

其他人工納米材料對大型蚤的毒性先前已有報道。朱小山等[21]研究發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管（SWCNTs）和多壁碳納米管（MWCNTs）對大型蚤活動的48 h EC50值分別為1.3 mg·L-1和8.7 mg·L-1；李軼等[22]實驗表明納米二氧化鈦對大型蚤72 h LC50和EC50分別為22.7 mg·L-1和16.7 mg·L-1。毒性的大小可能與納米材料的性質(zhì)有關(guān)。

已有文獻表明，nC60也會對其他水生模式生物產(chǎn)生急、慢性毒性。晏曉敏等[17]研究發(fā)現(xiàn)，nC60濃度達8 mg·L-1時盡管不影響青鳉（Oryziaslatipes）胚胎孵化率，但增加孵化幼魚的畸形率。朱小山等[21]研究表明nC60對斜生柵藻生長的96 h的EC50值為13.1 mg·L-1。本研究對nC60的水生生物毒性數(shù)據(jù)進行了一定補充。

nC60進入水體會發(fā)生團聚[23]，很容易被大型蚤吸入腸道內(nèi)并難以排出體外[10]，據(jù)此我們推測nC60對腸道粘膜的物理損傷是使大型蚤致毒的主要原因之一。

由于動物的行為是聯(lián)系生態(tài)過程和生物生理機能的紐帶，其對研究污染物的毒性效應具有重要意義。行為指標比死亡率對于評價污染物毒性更加敏感。對于大型蚤而言，跳躍、心跳和攝食行為是幾個易于觀察的行為指標，因此本文選擇其二來評價nC60對大型蚤的毒性。Tao等[13]研究了nC60對大型蚤跳躍頻率的影響，其研究結(jié)果表明大型蚤的跳躍頻率與暴露時間呈正相關(guān)。在本研究中，實驗初期的現(xiàn)象與Tao等研究基本一致，但是隨著暴露時間的延長，大型蚤的跳躍頻率逐漸降低，游動變得遲緩。對這種實驗現(xiàn)象的出現(xiàn)可以作出推測：大型蚤在攝入nC60的初始階段，由于納米顆粒在大型蚤體內(nèi)的累積使大型蚤做出應激行為，表現(xiàn)為猛烈地跳動以排出體內(nèi)的nC60顆粒；但是隨著時間延長，nC60的毒性作用顯現(xiàn)，大型蚤逐漸出現(xiàn)中毒癥狀，活動變得遲鈍。在本研究中，心跳頻率的變化趨勢與跳躍頻率的變化趨勢一致。心跳在一定程度上反映機體的能量供給情況，心跳頻率的變化在一定程度上對跳躍頻率的變化作出了解釋。

4 結(jié)論

（1）nC60暴露下大型蚤的跳躍和心跳活動會受到抑制，濃度越高抑制越明顯。

（2）nC60對大型蚤的48 h急性毒性指標EC50和LC50分別為25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1，72 h的EC50和LC50分別為14.9 mg·L-1和16.3 mg·L-1。

（3）在1 mg·L-1濃度下，nC60對大型蚤的繁殖產(chǎn)生影響，具有明顯慢性毒性。

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Toxicity assessments of fullerene to Daphnia magna：Acute toxicity and chronic toxicity

HUANG Bo-ming1,2,Lü Xiao-hui2,3,WANG Qiu-li4,ZHU Xiao-shan2*,ZHOU Jin2,CAI Zhong-hua2
（1.School of Environment,Tsinghua University,Beijing 100084,China;2.Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University,Shenzhen 518000,China;3.Shenzhen Graduate School,Harbin Institute of Technology,Shenzhen 518000,China;4.Liaoning Environmental Monitoring &Experiment Center,Shenyang 110161,China）

The toxicity of fullerene（nC60）on aquatic organisms has received increasing concerns due to its proliferated applications and the increasing occurrence potential in water environments.The present study evaluated the acute and chronic toxicity of nC60in a model animal, zooplanktonDaphnia magna,using immobilization and mortality as the observation endpoints.The 48 h and 72 h EC50values of nC60were 25.3 mg·L-1and 14.9 mg·L-1,respectively,and the LC50values were 28.5 mg·L-1（48 h）and 16.3 mg·L-1（72 h）,respectively.Moreover, nC60exposure led to increasing hop and heartbeat frequencies ofD.magnain the initial experiment stage,while the hop and heartbeat frequencies decreased with longer exposure time.During chronic exposure,the reproduction ofD.magnawas significantly repressed at the concentration of 1 mg·L-1.A significantly decrease of the total yield and the average yield ofD.magnawas observed after 21-d exposure. These results suggested that the leakage of nC60,could pose risks to the aquatic animals such asD.magna,which indicated that the aquatic toxicity of nC60should not be ignored.

Daphnia magna;nC60;acute toxicity;chronic toxicity

X171.5

A

1672-2043（2017）04-0620-05

10.11654/jaes.2016-1570

2016－12－07

黃勃銘（1990—），男，河北廊坊人，碩士研究生，從事納米材料生態(tài)毒理學研究。E-mail：dmxjhbm@163.com

*通信作者：朱小山E-mail：zhu.xiaoshan@sz.tsinghua.edu.cn

國家自然科學基金項目（41373089,41573094）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（41373089，41573094）

黃勃銘，呂小慧，王秋麗，等.富勒烯對大型蚤的急性毒性和慢性毒性效應[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36（4）：620-624.

HUANG Bo-ming,Lü Xiao-hui,WANG Qiu-li,et al.Toxicity assessments of fullerene to Daphnia magna：Acute toxicity and chronic toxicity[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（4）:620-624.