云南豬群中豬捷申病毒感染分子生物學(xué)診斷

趙國洪，嚴 歡，韓建強，趙 津，鄒豐才，信愛國

（1．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224；2.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653106；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

云南豬群中豬捷申病毒感染分子生物學(xué)診斷

趙國洪1，2，嚴 歡1，3，韓建強2，趙 津2，鄒豐才3，信愛國1

（1．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224；2.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653106；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

豬捷申病是由豬捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）感染引起的豬的一種病毒性傳染病。文章根據(jù)GenBank收錄的PTV基因序列設(shè)計套式引物，建立檢測PTV的套式RT-PCR診斷方法；從云南省某豬場疑似豬捷申病的病料中檢測出PTV核酸陽性，產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，與GenBank收錄的PTV毒株序列比對，結(jié)果表明該擴增序列與PTV同源性為99%～95%，首次在云南確診了PTV感染存在。

豬捷申病毒（PTV）；RT-PCR；分子診斷

豬捷申病毒（Porcine teschovirus,PTV）可引起豬傳染性腦脊髓灰質(zhì)炎、下痢、心肌炎、心包炎、肺炎、繁殖障礙和皮膚損傷或者無臨床癥狀等多種臨床表現(xiàn)的豬捷申病。該病的發(fā)病率可達50%，致死率達70%～90%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1]。PTV原歸屬于豬腸道病毒（Porcine enterovirus,PEV）Ⅰ類群，在分子結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化中與PEV其他2類群血清型毒株相異，有著獨特的特征，因此，目前已將豬腸道病毒的類群Ⅰ各血清型單獨歸為豬捷申病毒屬。目前已報道的PTV有11種不同血清型[1]。目前捷申病毒已遍布亞洲，國內(nèi)2003年首次從內(nèi)蒙古地區(qū)某豬場分離得到第1株豬捷申病毒[2]，隨后在我國大部分豬場均有PTV分離報道[3-7]，而且PTV常伴隨著豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染[8]和與豬圓環(huán)病毒2型混合感染[9]，這說明PTV在我國豬場中呈現(xiàn)混合感染的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。省內(nèi)最早2003年在云南蘭坪[10]和2007年在云南馬龍[11]有對疑似該病的臨床診治報告，但都沒有實驗室確診報告。自2013年以來，云南多地豬場出現(xiàn)仔豬死亡、腹瀉，以腸炎、腦脊髓灰質(zhì)炎、心肌炎、心包炎、肺炎為主，伴隨繁殖障礙為主要臨床癥狀疫病。經(jīng)臨床癥狀和實驗室診斷，排除了豬的主要幾種疫病病原，最后采用分子診斷技術(shù)確診為PTV感染所致。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品處理

樣品采自2013年9月，云南某地規(guī)?；B(yǎng)豬場，發(fā)病豬群主要為斷奶仔豬，取樣時該豬場豬群中有豬只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，主要表現(xiàn)為后肢麻痹，呈犬坐姿勢，呼吸困難，并伴有腹瀉；豬只對刺激敏感，稍微刺激就尖叫。對發(fā)病豬進行放血，采集腦、心臟、肝臟、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、小腸等組織進行送檢。對采集到的病豬組織樣品進行研磨處理，按每克樣品加3 mL滅菌PBS充分研磨，制備成組織懸液。把組織懸液置于-80℃凍存20 min后取出溶解，重復(fù)3次。置于4℃條件下3 000 r/min離心20 min，取上清液置于低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

病毒總RNA提取試劑（RNAiso Plus）購自寶生物（大連）有限公司；cDNA合成試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super－Mix）、pEasy T1 Cloning Kit和 2×EasyPfu PCR SuperMix試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR膠回收試劑盒和DNA Marker DL 2 000購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PTV引物的設(shè)計與合成

參照GenBank收錄的PTV基因5′-非編碼區(qū)（5′-UTR）保守序列，經(jīng)過比對分析，采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件分析，設(shè)計2對引物，建立檢測PTV所有血清型的套式RT-PCR方法。引物序列見表1。引物由昆明碩擎生物有限公司合成。

表1 PTV套式RT-PCR引物

1.4 組織中核酸提取

按RNAiso Plus提取試劑的說明書，提取病豬組織中總RNA。

1.5 PTV套式RT-PCR檢測

1.5.1 病毒cDNA的制備 按TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行cDNA的制備。反應(yīng)體系（體系20 μL）組分如下：RNA 7.5 μL，PTV-1R 0.5 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，gDNA Removal 1.0 μL，Tran－Script RT/RI Enzye mix 1.0 μL。輕輕混勻，42℃30 min，85℃5 s，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 套式PCR反應(yīng) 第一輪PCR擴增：PCR反應(yīng)總體積為25 μL，cDNA 1 μL，PTV-1F/PTV-1R（10 μM）各0.5 μL，2×EasyPfu PCR SuperMix 12.5 μL，補水至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共擴增35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

第二輪PCR擴增：首輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取該輪PCR產(chǎn)物1 μL作為模板，使用PTV-1nF和PTV-1nR各0.5 μL作為引物，其余反應(yīng)體系及條件與首輪相同。反應(yīng)結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳鑒定。

1.5.3 擴增產(chǎn)物的分子克隆及序列比對分析 第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，使用膠回收試劑盒回收目的條帶，將其連接于pEasy T1載體中，轉(zhuǎn)化DH5α，挑選陽性克隆送昆明碩擎生物有限公司測序。所測序列采用VectorNTI 8.0軟件包中Contig Express整理拼接，之后提交GenBank進行Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析。

1.6 其他幾種豬病的實驗室診斷

對病料進行豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬kuba病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（Rotavirus）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細小病毒（PPV）檢測，按照云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室對上述豬病檢測方法進行。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病臨床癥狀觀察及病理變化

據(jù)觀察統(tǒng)計，感染豬場中斷奶仔豬中發(fā)病率53.5%（45/84）?；疾∝i體溫升高，食欲廢絕，被毛粗亂，呼吸困難，嘔吐、腹瀉及行動失調(diào)。1～2 d后，體溫降至正常后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，呈現(xiàn)四肢麻痹僵直（特別是后肢）和昏迷，病豬呈犬坐姿勢或于一側(cè)臥地，前肢作劃水樣，受聲響或觸摸刺激時，可引起四肢不協(xié)調(diào)的運動，或角弓反張，也可見面部麻痹和失音。部分病豬伴有腹瀉。

病理剖檢可見胸膜粘連，心臟表面附著灰白色纖維素性滲出物卻不易剝落，心肌壞死和漿液性纖維素性心包炎病變（圖1A和B）；肺部尖葉、心葉有灰色實變區(qū)（圖1C）；腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)腫大；腸黏膜充血、出血，腸壁變??；也有患病豬觀察不到特征性的病變。

圖1 PTV患病豬病理剖檢

2.2 其他豬相關(guān)病原檢測結(jié)果

送檢病料對豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬kuba病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（Rotavirus）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細小病毒（PPV）進行了檢測，均為陰性結(jié)果，排除了上述這幾種病原的感染。

2.3 PTV套式RT-PCR檢測結(jié)果

將疑似PTV的病料中各組織勻漿后提取病毒基因組RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以其為擴增模板，用PTV特異性檢測引物進行鑒定。結(jié)果顯示，樣品獲得與預(yù)期的158 bp條帶一致的特異性擴增條帶，初步判定送檢的病料為PTV陽性（圖2）。

圖2 PTV臨床樣品檢測結(jié)果

2.4 PTV病料PCR擴增產(chǎn)物測序分析結(jié)果

將上述第2輪PCR擴增產(chǎn)物純化連接于pEasy T1載體中，挑陽性克隆測序，采用VectorNTI 8.0軟件讀取數(shù)據(jù)，分析處理后，得到下列序列（圖3）。經(jīng)提交GenBank進行Blast比對分析后發(fā)現(xiàn)，提交比對序列與GenBank收錄的豬PTV序列同源性在99%～95%之間，其中與中國分離株（swine/CH/IMH/ 03）的同源性為98%，從病毒的進化分類結(jié)果顯示該核酸序列來源于PTV基因組（圖4）。結(jié)果表明送檢豬病料為PTV感染，將送檢病料命名為PTV/YN/ 2013。

圖3 PTV/YN/2013病原核酸檢測序列克隆測序結(jié)果

圖4 PTV/YN/2013核酸序列Blast比對結(jié)果

3 討論

豬捷申病在我國是一種新出現(xiàn)的豬只疫病，目前主要采用病毒分離鑒定和分子生物學(xué)檢測進行診斷。在云南地區(qū)，雖然有兩例疑似病例報道[10-11]，都沒有進行確診。本文采用RT-PCR擴增PTV特異基因，結(jié)合核酸序列比對分析方法，首次對云南省豬群中對PTV感染引發(fā)的豬捷申病做出確診。證實云南省存在PTV感染，為我省的養(yǎng)豬疫病防控提供了科學(xué)依據(jù)。此外，PTV常和PRRSV、PCV2或其他一些容易引起豬產(chǎn)生神經(jīng)癥狀和以流產(chǎn)為主要癥候群的疫病引起相似臨床癥狀，我們對這些豬常見疫病進行了鑒別診斷，排除了幾種病原感染的可能性，明確了該次疫病是由PTV感染所致。但是據(jù)報道，PTV目前在我國主要和PRRSV、PCV2混合感染，主要引起流產(chǎn)、仔豬死亡以及腹瀉、腸炎等[12]。因此，對PTV進行快速、準確的診斷對該病的控制具有重要意義。

豬是捷申病毒的唯一宿主，不同年齡的豬都易感，仔豬的易感性較強。PTV血清型眾多，相互之間沒有交叉免疫性，在同一豬群中可有多個血清型，任何年齡的豬在感染某一血清型毒株后，可再感染其他血清型毒株。本次所檢測到的豬PTV具體屬于豬捷申病毒屬的哪個血清型還需進一步對病毒進行分離鑒定。此外，引起神經(jīng)癥狀、母豬繁殖障礙、腸炎、肺炎、心包炎和心肌炎等癥狀的疾病很多，PTV在云南地區(qū)流行的情況還不清楚，有必要進一步對PTV開展病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查。

應(yīng)對PTV的防控策略，目前國內(nèi)外對豬捷申病尚無有效的治療方法，也無特效抗病毒藥物，只有采取綜合防制措施，才會有效降低發(fā)病率和死亡率。因此，建議豬場堅持自繁自養(yǎng)，盡量減少外購豬的數(shù)量，嚴格控制外購豬的質(zhì)量。加強飼養(yǎng)管理，特別要注意提高飼糧中能量飼料的供給，完善防寒保暖措施，提高豬群整體抗病能力。搞好豬舍的清潔衛(wèi)生和消毒工作。豬場一旦感染發(fā)病，除用抗菌藥物防止細菌繼發(fā)感染外，還要采取隔離措施，防止發(fā)病豬舍的病毒傳到健康舍。因該病毒在環(huán)境中廣泛存在，建議用發(fā)病豬的病料組織（如心、肝、脾、肺、腎或腦組織）分離病毒，如能從病料組織中分離到病毒，說明豬場確實存在此病，可用從病料組織中分離出的病毒研制疫苗；如果僅在腸道里分離到病毒，有可能是帶毒[13]。也有建議采用后備種豬與隱性感染豬混養(yǎng)或接近混養(yǎng)，促使健康豬群產(chǎn)生抗體而達到預(yù)防的目的。但是，豬捷申病在我國尚未形成暴發(fā)流行，因此，搞好環(huán)境衛(wèi)生、做好保健工作，加強飼養(yǎng)管理才是最重要防控措施。

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（編輯：郭玉翠）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)02-0113-03

2017-03-03

趙國洪（1984-），男，云南尋甸人，碩士，主要從事臨床獸醫(yī)教學(xué)及科研工作.E-mail：345994746@qq.com

信愛國（1974-），男，云南瀘西人，研究員，博士，主要從事動物病毒學(xué)研究工作.E-mail：kmvir@sina.com