無患子皂苷的生物活性與生產開發(fā)

姚衛(wèi)蓉，伍 恒，魏敏平，謝云飛

（江南大學食品學院，江蘇無錫 ，214122)

無患子皂苷的生物活性與生產開發(fā)

姚衛(wèi)蓉，伍 恒，魏敏平，謝云飛

（江南大學食品學院，江蘇無錫 ，214122)

無患子果皮中含有豐富的皂苷和倍半萜糖苷，是天然的非離子表面活性劑，其提取液具有非常強的表面活性以及殺菌、消炎、抗腫瘤等生物活性。本研究以無患子皂苷濃縮液為原料，采用生物發(fā)酵法純化無患子皂苷，皂苷純度提高到75.50%；同時評價其對炭黑污布、蛋白污布、皮脂污布的去污能力，去污值分別達到99.1%、54.1%、63.2%；此外，還考察了其對埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、紅色毛癬菌、痤瘡丙酸桿菌這4種常見皮膚致病菌的抑制效果。實驗結果表明，無患子發(fā)酵液對紅色毛癬菌、痤瘡丙酸桿菌表現(xiàn)出較強的抑菌活性，二者的最低抑制濃度(MIC)分別為0.39 mg/mL、1.29 mg/mL。本研究結果表明無患子皂苷具有良好的表面活性和抑菌性，為進一步開發(fā)利用無患子資源提供了基礎信息。

非離子表面活性劑；無患子皂苷；生物活性；發(fā)酵；去污能力；抑菌活性

無患子，亦稱洗手果、油羅樹，是分布于熱帶以及亞熱帶國家的一種無患子科落葉喬木，其根、葉、果皮、種子等均具有很強的藥用價值，是不可多得的自然資源。無患子果皮中富含的三萜皂苷類和倍半萜糖苷均具有優(yōu)良的非離子表面活性，能降低水的表面張力，泡沫豐富細膩，去污力強，抗硬水性強，溶解性好，可用作天然洗滌劑，還可用來制造牙膏、洗發(fā)香波及各種潔膚護膚化妝品等[1,2]；同時，隨著近年來無患子化學成分提取研究的不斷開展，其藥用價值得到了很大的開發(fā)，大量研究表明：其提取液具有非常強的殺菌[3]、消炎[4]、抗腫瘤[5]、保肝降壓[6]等生物活性。

目前對無患子皂苷活性物質的研究大都采用無患子粗提液作為原材料[7]，但由于其中含有大量的糖及少量的蛋白質、金屬離子等雜質，因此，并不能真實反映無患子皂苷所具有的良好性能。

鑒于此，本實驗在無患子皂苷水提濃縮液的基礎上，采用微生物發(fā)酵方法對無患子皂苷水提濃縮液進行純化，利用酵母菌將其中糖類作為碳源、蛋白質作為氮源的特點，以達到提高無患子皂苷純度的目的。同時考察了無患子皂苷發(fā)酵液對炭黑污布、蛋白污布、皮脂污布的去污能力，以及對埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、紅色毛癬菌、痤瘡丙酸桿菌4種常見皮膚致病菌的抑菌活性，旨在為以無患子為原料的日用品開發(fā)提供基礎支撐。

1 實驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

無患子水提濃縮液：福建省源華生物科技有限公司提供。香草醛、高氯酸、冰醋酸、葡萄糖、氯化鈉、乙酸鈉、可溶性淀粉、L-半胱氨酸鹽酸鹽等均為分析純。

1.1.2 供試菌種

安琪葡萄酒干酵母 BV818，埃希氏大腸桿菌 ATCC8099 (Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌ATCC6538 (Staphylococcus aureus)、紅色毛蘚菌ATCC294 (Trichophyton rubrum)：江南大學食品學院提供；痤瘡丙酸桿菌 ATCC6919 (Propionibacterium acnes)：廣東省微生物菌種檢測中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1000 mL；厭氧培養(yǎng)基配方：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏10 g、葡萄糖5.0 g、氯化鈉5.0 g、酵母膏3.0 g、乙酸鈉3.0 g、可溶性淀粉1.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1000 mL；沙氏培養(yǎng)基配方：蛋白胨10.0 g、葡萄糖40.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1000 mL。

1.1.4 實驗儀器

TU-1900雙束紫外可見分光光度：日本島津公司；PYX-DHS-50×65-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療機械廠；W501恒溫水浴鍋：上海申順生物科技有限公司；R-501旋轉蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；DELTA320型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；RJ-TDL-50A低速臺式大容量離心機：無錫瑞江。

1.2 測定方法

1.2.1 無患子皂苷濃縮液的純化

將干酵母按1.5%的接種量接種至無患子皂苷濃縮液(皂苷純度44.63%)中，于自然pH、30 ℃下靜置發(fā)酵4天，然后在8000 r/min 離心10 min 以除去菌體，從而得到無患子皂苷發(fā)酵液，并對其進行皂苷含量、可溶性固形物含量的測定。

無患子皂苷含量的測定采用香草醛－冰醋酸法[8]。

可溶性固形物含量的測定參考伍恒等[9]的研究，簡述如下：準確量取10 mL發(fā)酵液于鋁盒中→60 ℃水浴蒸干→真空干燥(60 ℃、真空度93.3-98.7 kPa)5 h→冷卻→恒重。

1.2.2 無患子皂苷發(fā)酵液去污力的測定

稱取無水CaCl216.5 g和MgSO4·7H2O 24.7 g，加蒸餾水10 L，取1 L沖稀至10 L即為250 ppm硬水。將待測樣品及標準洗衣粉用250 ppm的硬水配制成表面活性劑含量0.2%的溶液。實驗前先用光電比色計進行讀數(shù)，利用反射光的強弱可以讀出布面的白度。先將白瓷板校正（用濾光片500號，以標準白碳酸鎂為100校正），將污布剪成24塊圓布(每塊直徑為6 cm)，然后分別將每塊污布的正反兩面的5個部位讀出反光度，取其平均值，即可進行洗滌實驗。實驗時先在去污機的24只瓶內倒入300 mL配制好的表面活性劑溶液，在預熱槽中預熱至43 ℃即放入污布，裝入轉軸架中在45 ℃下轉動1 h，取出用自來水沖洗，放在搪瓷盤中晾干后進行讀數(shù)。

1.2.3 無患子皂苷發(fā)酵液抑菌活性的測定

菌懸液的制備：實驗菌株經活化后，挑取單菌落，采用麥氏比濁法用無菌生理鹽水稀釋成濃度約為106 cfu/mL的菌液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

試管二倍稀釋法：用蒸餾水將無患子發(fā)酵液稀釋至皂苷含量為100 mg/mL的水溶液，然后將10支滅菌試管排成一列、編號，各加入雙倍營養(yǎng)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(紅色毛癬菌用沙氏培養(yǎng)基，痤瘡丙酸桿菌用厭氧培養(yǎng)基)1 mL，在第一管內加入1 mL待測樣品，混勻后吸取1 mL到第2管，混勻再取1 mL到第3管，依次類推到第9管，棄去1 mL，第10管不加提取物。待培養(yǎng)基凝固后，每管加入菌液20 μL，混勻，置于37 ℃(紅色毛癬菌，30 ℃)培養(yǎng)箱(痤瘡丙酸桿菌，在厭氧條件下)靜置培養(yǎng) 24 h(紅色毛癬菌及痤瘡丙酸桿菌，48 h)。結果判定：培養(yǎng)基表面無菌落或菌絲表示無細菌生長，有菌落表示有細菌生長，以能抑制細菌(紅色毛癬菌)生長的發(fā)酵液最高稀釋度作為其最低抑菌濃度(MIC)，以生理鹽水做為空白對照，氨芐青霉素溶液作為細菌的陽性對照，那他霉素作為紅色毛癬菌的陽性對照。

2 結果與討論

2.1 無患子總皂苷的純化

按1.2.1所述方法進行發(fā)酵實驗，結果如表1所示。

表1 無患子皂苷濃縮液及其發(fā)酵液的理化性質

由表1可知，無患子皂苷水提濃縮液經發(fā)酵過后可溶性固形物含量從140.00 g/L降低至75.00 g/L，無患子皂苷純度從44.63%上升到75.50%，分析原因可能是由于無患子皂苷濃縮液中糖和蛋白質等營養(yǎng)物質被酵母菌優(yōu)勢利用于生長，相反，皂苷類活性成分被利用程度較弱，并且副代謝產物產生很少，從而，純度得到明顯提高。近幾年來，用于分離純化皂苷的方法較多，包括水提醇沉法[10]、正丁醇萃取法[11]、超濾膜分離法[12]、大孔樹脂法[13]以及微生物發(fā)酵法[14]等，各種方法所受影響因素不一，因此，各具優(yōu)劣。其中微生物發(fā)酵法是指一些物化方法較難去除的大分子物質通過微生物發(fā)酵進行分解，從而達到純化的目的，并且效果十分顯著。微生物發(fā)酵法所得皂苷純度比常規(guī)水提法所得產品純度高，同時在發(fā)酵過程中可對皂苷進行改性，從而提高皂苷的生物活性。皂苷純度提高的幅度主要取決于菌株的耗糖能力[15]，趙丹青等[16]在酵母膏培養(yǎng)基接種乳酸菌來對無患子皂苷水提液進行精制，實驗結果發(fā)現(xiàn)：葡萄糖和甘露糖完全消耗，并且溶液表面張力變化不大，表明無患子皂苷在發(fā)酵過程中具有一定的穩(wěn)定性；張翠等[17]在無患子水提液基礎上，比較了水提醇沉法、絮凝法、正丁醇萃取法和米曲霉發(fā)酵純化無患子皂苷的效果。結果表明：接種米曲霉發(fā)酵效果最佳，按3%的接種量在30℃搖床發(fā)酵7天后所得皂苷純度從48.71%提高至82.47%。本實驗通過在無患子皂苷水提濃縮液中接種酵母菌，實驗得出皂苷純度從44.63%提高至75.50%，由此可知：酵母菌發(fā)酵所得皂苷純度提高的幅度雖略低于米曲霉發(fā)酵的結果，但米曲霉發(fā)酵周期相對較長。從經濟效益角度考慮，接種酵母菌更有利于工業(yè)化生產。

2.2 無患子皂苷發(fā)酵液的去污力

無患子皂苷發(fā)酵液對3種具有代表性污布的去污力結果如圖1所示。

圖1 無患子皂苷發(fā)酵液的去污力

實驗結果表明：無患子皂苷濃縮液發(fā)酵后，對炭黑污布、蛋白污布及皮脂污布的去污力分別從89.0%、45.2%、52.3%提高至99.1%、54.1%、63.0%?？梢姛o論是哪種類型的污布，無患子皂苷發(fā)酵液的去污力均比無患子皂苷濃縮液高。張翠[10]曾考察了無患子皂苷水提液在發(fā)酵過程中pH的變化情況，實驗得出發(fā)酵4天后pH值從4.12升至7.21，他們認為可能是在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵液中糖的減少，蛋白質在分解成氨基酸后進一步生成胺類物質，呈堿性的產物不斷增加，從而導致pH上升；同時pH對洗滌劑的去污能力有一定的影響，堿性越大，洗滌效果就越好，但一般以中性較好。本實驗以無患子皂苷濃縮液為原料，經酵母菌發(fā)酵后pH值從4.41升至6.92，結合去污力實驗結果，正好驗證了張翠的猜想。此外，對于炭黑污布，無患子皂苷濃縮液經發(fā)酵純化后的去污力雖僅提高11.3%，但其優(yōu)勢更加明顯，近乎達到完全去污；相反，對蛋白和皮脂污布發(fā)酵液的去污力提高了近20%，但仍然沒有達到《衣料用液體洗滌劑》的標準要求。由此得知：在相同的測試條件下，去污力與污垢的成分密切相關。為增強對蛋白和皮脂的去除效果，可試圖開展將無患子皂苷發(fā)酵液與其他表面活性劑進行復配的后續(xù)研究。

2.3 無患子皂苷發(fā)酵液的抑菌性

無患子皂苷發(fā)酵液對幾種常見皮膚病原菌的抑制效果如表2所示。

表2 無患子皂苷發(fā)酵液對4種常見皮膚病原菌的抑菌性

由表2可以得出：無患子皂苷發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌和紅色毛癬菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為25.00 mg/mL、12.50 mg/mL、1.29 mg/mL和0.39 mg/mL。由此表明：無患子皂苷發(fā)酵液對紅色毛癬菌抑制效果最佳，痤瘡丙酸桿菌次之，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌稍差。從上述結果還可以看出：無論是無患子皂苷濃縮液還是無患子皂苷發(fā)酵液，二者對革蘭氏陽性菌的抑制作用均優(yōu)于革蘭氏陰性菌，分析原因可能是由于他們的細胞壁結構不同所致。Tamura等[18]研究了無患子甲醇提取物的抑菌活性，結果表明：實驗用樣對革蘭氏陽性菌具有中等生長抑制活性，對革蘭氏陰性菌抑制活性較弱，這跟本實驗的結果相似。此外，無患子皂苷濃縮液發(fā)酵后對實驗所選菌種的抑菌性稍有增強，而有些保持不變，說明在發(fā)酵過程中，酵母菌不利用或較少利用抑菌活性物質，并且可能由于發(fā)酵后皂苷純度提高，所以對痤瘡丙酸桿菌和紅色毛癬菌抑制活性增強，但具體是哪種或哪幾種皂苷成分發(fā)揮作用有待進一步研究。

3 結論

無患子假種皮中含有大量的皂苷成分，本實驗以其水提濃縮液為原料進行了發(fā)酵純化，并對所獲得的發(fā)酵液進行了去污力、抑菌活性研究。

3.1 采用耗糖能力強的酵母菌發(fā)酵來實現(xiàn)對無患子皂苷的純化，數(shù)據(jù)顯示皂苷純度提高了31.00%左右；

3.2 通過3種具有代表性的污布評價了無患子皂苷發(fā)酵液的去污能力，結果表明，其去污效果良好，對炭黑污布甚至能達到完全去污；

3.3 抑菌實驗表明，無患子皂苷發(fā)酵液對常見的4種皮膚致病菌均具有抑制效果，其中以紅色毛癬菌、痤瘡丙酸桿菌尤為明顯。

本實驗提供了一種低成本、高純度、操作周期短的無患子皂苷純化方法，有利于大規(guī)模的工業(yè)化生產，為進一步分離純化無患子皂苷成分提供了數(shù)據(jù)參考，同時為基于無患子皂苷的日化產品開發(fā)奠定了科學依據(jù)。

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Analysis on the Bioactivity and Development of Sapindus Saponins

Yao Weirong?, Wu Heng, Wei Minping, Xie Yunfei
( School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi214122, China)

Rich in saponins and sesquiterpene glucosides, the pericarp of Sapindus mukurossi is considered as natural non-ionic surfactants. The extract of Sapindus pericarp has strong surfactivity and biological activities such as anti-inflammatory, antimicrobial and antitumor activities. A fermentation process was performed to purify saponins by BV818 yeast based on the concentrated saponins solution of Sapindus pericarp. The results showed that the purity of saponins increased to 75.50%. The detergency of fermentation product was also determined, and the detergency for carbon black dirty cloth, protein dirty cloth and sebum dirty cloth reached 99.10%, 54.10% and 63.20%, respectively. In addition, this paper investigated the inhibitory effect of fermentation product against 4 kinds of common skin pathogens including Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Trichophyton rubrum and Propionibacterium acnes. The antimicrobial test showed the strong antimicrobial activity of fermentation product against Trichophyton rubrum and Propionibacterium acnes with minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.39 mg/mL and 1.29 mg/mL, seperately. The results of this study underscored that Sapindus saponins have excellent surface activity and antimicrobial activity, which would provide basic information for further development and utilization of Sapindus mukurossi.

Sapindus saponins; bioactivity; fermentation; detergency; antimicrobial activity

TQ423.2；TQ649.6

A

1672-2701（2017）04-32-05

姚衛(wèi)蓉女士，教授，博士，研究方向：食品安全與質量控制。E-mail:yaoweirongcn@ jiangnan.edu.cn。