干旱脅迫對(duì)柴胡中柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性及柴胡皂苷含量的影響

韓曉偉 馮紅 馮建明 嚴(yán)玉平 張丹 鄭開顏 鄭玉光

摘要：目的 研究干旱脅迫對(duì)柴胡中柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性及皂苷含量的影響，從蛋白水平揭示柴胡對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。方法 通過盆栽控水試驗(yàn)，設(shè)置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個(gè)水平栽培柴胡。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)6個(gè)月和1年生柴胡根中4種柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IPPI）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）和β-香樹素合成酶（β-AS）的活性，采用HPLC檢測(cè)不同土壤飽和含水量情況下樣品中柴胡皂苷a、d的含量。結(jié)果 柴胡苗在飽和含水量40%～50%時(shí)4種酶的活性最高，在飽和含水量60%～70%、70%～80%時(shí)次之，在飽和含水量20%～30%時(shí)最低，柴胡皂苷a、d含量變化與酶活性變化趨勢(shì)相似。結(jié)論 40%～50%土壤飽和含水量能顯著提高柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性，且柴胡皂苷含量與酶活性之間呈顯著正相關(guān)，說明在干旱脅迫下，柴胡通過調(diào)節(jié)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性來調(diào)節(jié)柴胡皂苷的合成，對(duì)干旱脅迫作出響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：干旱脅迫；柴胡；酶活性；柴胡皂苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.017

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）05-0071-05

Effects of Drought Stress on Activity of Key Enzyme in Saikosaponin Biosynthesis Passway and Saponins Content in Bupleurum chinense HAN Xiao-wei1， FENG Hong2， FENG Jian-ming1， YAN Yu-ping1， ZHANG Dan1， ZHENG Kai-yan1， ZHENG Yu-guang1 （1. Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050200， China； 2. Anguo Digital Materia Medica Testing Center Co.， LTD.， Anguo 071200， China）

Abstract： Objective To research the effects of drought stress on activity of key enzyme in saikosaponin biosynthesis and saponins content in Bupleurum chinense； To reveal response of Bupleurum chinense to drought stress from protein level. Methods Bupleurum chinense was cultivated in potted water control experiment with 70%–80%， 60%–70%， 40%–50% and 20%–30% saturated soil water contents. The enzyme activities of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase （HMGR）， isoprenyl-based coke （IPPI）， farnesyl pyrophosphate synthase （FPS） and β-carotenoid synthase （β-AS） of six months and one year old Bupleurum chinense were measured. The contents of saikosaponins a and d in samples of different soil water contents were determined by HPLC. Results When the saturated moisture was 40%–50%， the enzymatic activities of HMGR， IPPI， FPS and β-AS were the highest， followed by saturated moisture 60%–70%、70%–80% and 20%–30%. The trend of saikosaponin was similar to that of the activity of key enzyme. Conclusion 40%– 50% soil saturated water content can significantly increase the activity of the key enzymes in the saikosaponin synthesis pathway. The saponin content and enzyme activity show a significant positive correlation， indicating that under drought stress， Bupleurum chinense regulates the synthesis of saikosaponin by regulating the key enzyme activity of saikosaponin synthesis pathway to respond drought stress.

Key words： drought stress； Bupleurum chinense； activity of enzyme； saikosaponin

柴胡Bupleurum chinense DC.為傘形科柴胡屬植物，是《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的藥用柴胡主要來源之一[1]。柴胡所含的主要有效成分柴胡皂苷是一種齊墩果烷類型的三萜皂苷，主要為柴胡皂苷a和柴胡皂苷d。柴胡皂苷屬于次生代謝產(chǎn)物，是柴胡抵御脅迫的產(chǎn)物，也是主要的藥效成分[2-3]。柴胡皂苷合成的途徑主要由3部分組成[4]，首先合成前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸（IPP）、二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）、法呢基焦磷酸（FPP），在此基礎(chǔ)上合成2，3-角鯊烯氧化物環(huán)化合成齊墩果烷型或達(dá)瑪烷型三萜骨架，最后是三萜類骨架在細(xì)胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等酶的修飾下形成皂苷[5-6]。在上述過程中，HMG-CoA還原酶（HMGR）催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）生成甲羥戊酸（MVA），MVA在MVA激酶、磷酸MVA激酶和脫羧酶的作用下形成IPP，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（IPPI）催化IPP和DMAPP之間的可逆轉(zhuǎn)化，法呢基焦磷酸合酶（FPS）催化FPP的形成，β香樹脂合成酶（β-AS）催化形成β-香樹素[7]，這些酶均為柴胡皂苷合成途徑中關(guān)鍵的限速酶。

干旱是影響植物生長(zhǎng)、生存和分布的重要環(huán)境因子之一。柴胡主要分布在我國(guó)干旱和半干旱地區(qū)，目前，隨著全球暖干化，干旱脅迫普遍存在，而且呈現(xiàn)出加劇的趨勢(shì)，因此，研究柴胡對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)理就顯得尤為重要。黃璐琦等[8]研究逆境脅迫對(duì)藥材的作用后提出了道地藥材形成的逆境效應(yīng)理論，即藥用植物在適度的逆境下可以提高其藥效成分的積累。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)柴胡的研究主要集中在柴胡的藥理作用[9]、真?zhèn)舞b定[10-15]和栽培[16]等方面，而對(duì)柴胡干旱脅迫下的分子響應(yīng)機(jī)制研究較少，因此，本研究通過設(shè)置土壤的含水量人為模擬干旱條件，探討干旱脅迫對(duì)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響，從而為進(jìn)一步研究干旱脅迫對(duì)柴胡皂苷積累的影響奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

GL-20G-II型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；EPOCH酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器公司；Eppendorf移液槍；MGC-P型光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；賽默飛OMS100烘箱；沃特世2695高效液相色譜系統(tǒng)。

植物HMGR、β-AS、FPS和IPPI酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號(hào)均為201512），上海酶聯(lián)生物科技有限公司；柴胡皂苷a對(duì)照品（批號(hào)110777-201510）、柴胡皂苷d對(duì)照品（批號(hào)110778-201510），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，氨水、甲醇為分析純。

6個(gè)月和1年生柴胡幼苗，河北省邯鄲市涉縣農(nóng)牧局提供，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為北柴胡Bupleurum chinese DC.。

2 方法

2.1 植物材料的處理

選取生長(zhǎng)良好整齊的柴胡苗，移栽到花盆中，花盆口徑29 cm、底徑19 cm、高20 cm、質(zhì)量295 g，每個(gè)花盆下有一塑料托盤。土壤為沙壤土、營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按1∶1∶1混合均勻。6個(gè)月和1年生柴胡幼苗分別于2015年12月和2016年5月移栽于盆中，每盆4穴，每穴2株。移栽后正常澆水，生長(zhǎng)1個(gè)月后，選取正常生長(zhǎng)、一致的幼苗作為供試材料。

采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個(gè)水平，采用稱重法進(jìn)行水分控制。控水期間每日17：00稱取盆重，補(bǔ)充失去的水分，使各處理保持設(shè)定的相對(duì)含水量。每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，控水處理1個(gè)月后采集樣品測(cè)定各指標(biāo)。

2.2 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)4種酶活性

2.2.1 原理及方法 采用雙抗體夾心法測(cè)定樣品中HMGR、IPPI、FPS和β-AS的酶活性。以FPS為例，用純化的植物FPS抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入植物FPS，再與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的FPS抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色深淺與樣品中的植物FPS呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植物FPS活性。HMGR、IPPI和β-AS活性測(cè)定方法與FPS相同。

2.2.2 粗酶的提取 將柴胡種苗從土壤中取出，用水沖洗數(shù)遍去除泥沙，再用吸水紙吸干多余水分，并去除莖葉部分，用電子天平準(zhǔn)確稱量每棵柴胡種苗根部的質(zhì)量，按質(zhì)量體積比1∶18加入0.01 mol/L PBS（pH 7.15），冰浴研磨成勻漿，放置冰箱浸提2 h，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，去除沉淀取上清，重復(fù)上述步驟，離心后取上清。

2.2.3 酶活性測(cè)定 將試劑盒提供的原倍標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為60、30、15、7.5、3.75 IU/L。加樣：分別設(shè)空白孔（不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)孔準(zhǔn)確加樣50 ?L，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 ?L，再加待測(cè)樣品10 ?L（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 ?L，空白孔除外。溫育（同上）。洗滌（同上）。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 ?L，再加入顯色劑B 50 ?L，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。終止：每孔加終止液50 ?L（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔OD值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

2.3 HPLC測(cè)定柴胡皂苷a、d含量

皂苷含量測(cè)定條件參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，方法參照張宇等[4]步驟進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 干旱對(duì)柴胡皂苷a、d含量的影響

不同土壤飽和含水量處理的6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量見圖1。在干旱脅迫下，土壤飽和含水量為40%～50%時(shí)，6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量最高，土壤飽和含水量為60%～80%時(shí)次之，土壤飽和含水量為20%～30%時(shí)最低。說明適度干旱脅迫可以使柴胡皂苷a、d的積累量增加。

3.2 干旱對(duì)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響

3.2.1 酶活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 6月齡和1年生柴胡苗的FPS、β-AS、HMGR和IPPI酶活性檢測(cè)具有不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2均為0.99左右，說明后續(xù)結(jié)果可信。

3.2.2 酶活性測(cè)定結(jié)果 6月齡柴胡苗β-AS的酶活性最高，達(dá)到20 000 IU/g左右；IPPI的酶活性較低，只有250 IU/g左右。在干旱處理?xiàng)l件下，40%～50%土壤飽和含水量使FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性達(dá)到最高，而土壤飽和含水量在70%～80%與60%～70%的情況下FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性相差不大，而當(dāng)土壤飽和含水量降到20%～30%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性明顯降低。結(jié)果見圖2。

1年生柴胡苗在干旱脅迫條件下，土壤飽和含水量40%～50%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較高，而土壤飽和含水量70%～80%與60%～70%的情況下酶活性相差不大，土壤飽和含水量20%～30%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較低。結(jié)果見圖3。

以上結(jié)果說明柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性在適度干旱條件下較高，水分過多或過少都會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生不良的影響。

3.3 柴胡皂苷含量與酶活性的相關(guān)性

采用SPSS19.0軟件分析不同處理下柴胡皂苷含量與HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性的相關(guān)性，結(jié)果見表2、表3。6月齡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a、d含量呈極顯著的正相關(guān)（P<0.01）；1年生柴胡苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a含量呈極顯著的正相關(guān)（P<0.01），與柴胡皂苷d的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。6月齡和1年生柴胡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性之間均呈極顯著的正相關(guān)（P<0.01），說明作為柴胡皂苷合成途徑的關(guān)鍵酶，每種酶的表達(dá)都與其下游酶活性相關(guān)，4種酶統(tǒng)一協(xié)調(diào)柴胡皂苷的合成過程。

4 討論

張宇等[4]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能使HMGR、IPPI、FPS和β-AS的基因表達(dá)量上升，而基因表達(dá)的產(chǎn)物就是酶類，但基因表達(dá)升高并不一定代表酶活性的升高，酶活性能更直接地反映干旱脅迫與柴胡皂苷之間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，6月齡柴胡苗的酶活性雖然較1年生柴胡苗的酶活性低很多，但在干旱處理下其變化趨勢(shì)是一致的。6月齡柴胡苗的HMGR酶活性約為1200 IU/g，而1年生柴胡苗的HMGR酶活性達(dá)到5000 IU/g，而且，無論是6月齡苗還是1年生苗其β-AS酶活性均明顯高于另外3種酶，1年生苗的β-AS酶活性達(dá)到80 000 IU/g，較其他3種酶活性高出1個(gè)數(shù)量級(jí)。這說明隨著外界溫度的升高，柴胡皂苷的合成也在加速，另外，β-AS作為最靠近終產(chǎn)物的酶類，其活性在某種程度上代表了柴胡皂苷合成的多少。

6月齡和1年生柴胡苗對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)趨勢(shì)是一致的，在土壤飽和含水量為40%～50%時(shí)，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性最高，土壤飽和含水量60%～70%與土壤飽和含水量70%～80%時(shí)的4種酶活性大致相當(dāng)，土壤飽和含水量40%～50%應(yīng)該是酶活性的最適水分。但是，干旱脅迫對(duì)于酶活性的增加是有限的，當(dāng)土壤飽和含水量降至20%～30%時(shí)，酶活性迅速降低。在干旱脅迫下，柴胡皂苷含量的變化趨勢(shì)與酶活性一致，說明柴胡皂苷含量的提高需要一定的干旱期。

另外，β-AS作為最靠近皂苷生成的酶，在干旱脅迫下其活性上調(diào)最明顯，4種酶的活性呈顯著正相關(guān)，說明上游酶類影響著下游酶類的表達(dá)，呈現(xiàn)逐級(jí)遞增的趨勢(shì)，積累到一定程度，就會(huì)表現(xiàn)為柴胡皂苷含量的增加。相關(guān)性分析也表明，4種酶的表達(dá)與柴胡皂苷的含量呈極顯著的正相關(guān)。由此可知，適度的干旱脅迫能夠促進(jìn)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)，進(jìn)而影響柴胡皂苷的積累。

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