藥用植物中鯊烯環(huán)氧酶的生物信息學(xué)分析

趙志新，王凡

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

三萜皂苷（Triterpenoid saponins）作為一類重要的藥用植物次生代謝產(chǎn)物，具有保護肝臟、抗凝血、消炎抗病毒、降低膽固醇等多方面的藥理作用[1]。三萜類化合物在自然分布很廣，在菌類、蕨類植物、單子葉植物和雙子葉植物、動物和海洋生物中都有存在，尤其是在雙子葉植物中分布最為廣泛，主要分布于菊科、石竹科、五加科、豆科、遠志科、桔?？萍靶⒖芠2-4]，特別是普遍存在于絞股藍、人參、三七、柴胡以及積雪草等多種藥用植物中[5]。鯊烯環(huán)氧酶（Squalene epoxidase,SE）也被稱為角鯊烯單加氧酶，在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化鯊烯（角鯊烯）為環(huán)氧鯊烯[6]。在植物中，SE催化鯊烯氧化生成2,3-氧化鯊烯，因此被認為是三萜皂苷類化合物合成中一個公認的關(guān)鍵限速酶[7]。同時研究發(fā)現(xiàn)，牛樟芝三萜途徑中最后一步關(guān)鍵的限速酶也是鯊烯環(huán)氧酶（SE）[8]。人參植物中至少含有2種角鯊烯環(huán)氧化物酶，一種參與三萜皂苷的合成，另一種可能參與了植物甾醇的合成[9]。本文主要是利用生物信息學(xué)的手段，查找已經(jīng)公布的藥用植物中的SE基因的序列數(shù)據(jù)，并經(jīng)過整理、分析，根據(jù)得到的結(jié)果來預(yù)測他們之間的同源性和進化關(guān)系，為下一步通過分子生物學(xué)技術(shù)進行基因功能分析及代謝通路研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

檢索已發(fā)表有關(guān)SE研究的學(xué)術(shù)論文，然后從NCBI查找已公布的相關(guān)基因序列。

1.2 方法

運用BLASTn 2.6.0對藥用植物中SE核酸序列的同源性進行分析；借助MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析藥用植物中SE基因的進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥用植物SE核酸序列

截止2017年3月10日為止，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載已經(jīng)公布的藥用植物SE的核酸序列，共28條，包括擬南芥，刺五加，枇杷等10種藥用植物的核酸序列（見表1）。

表1 不同植物SE核酸序列來源

2.2 核酸序列的比對分析

將收集到的28條SE序列與擬南芥和丹參基因組做BLAST分析。使用BLASTn 2.6.0分別分析擬南芥和丹參基因組數(shù)據(jù)中的潛在SE序列，選擇相似性較高的序列。獲得結(jié)果如圖1～圖3。結(jié)果顯示：擬南芥潛在的SE基因序列與刺五加actinSE基因序列相似性最高。同源性分別是刺五加actin（丹參）82%，枇杷SE2（擬南芥）75%，刺五加actin3（擬南芥）86%，刺五加actin2（擬南芥）83%，刺五加actin1（擬南芥）86%。（括號里的物種名為做BLAST的參照基因組）

圖1 丹參基因組與SE序列BLAST圖 [刺五加actin(丹參）]

圖2 擬南芥基因組與SE序列BLAST圖[刺五加actin(擬南芥）]

圖3 擬南芥基因組與SE序列BLAST圖 [枇杷SE2(擬南芥）]

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

為了對藥用植物中三萜皂苷的代謝通路做更深層次的分析，將所獲的NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)注冊的SE核酸序列，經(jīng)同源性分析后做系統(tǒng)進化分析。將BLASTn搜索得到同源性較高的核酸序列，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，依據(jù)五種不同算法所構(gòu)建的進化樹，如圖4～圖8。

2.3.1 Maximum Likelihood Tree算法

由圖4可知，從進化樹圖上來分析，5種SE序列聚成兩大支，刺五加actin1,3（擬南芥）和枇杷（擬南芥）聚為一大支；刺五加actin（丹參）和刺五加actin2（擬南芥）聚集為一支；刺五加actin2（擬南芥）和刺五加actin1,3（擬南芥）的親緣關(guān)系較遠與枇杷（擬南芥）親緣關(guān)系較近。

2.3.2 Neighbor-joining Tree算法

圖4 Maximum Likelihood算法

圖5 Neighbor-joining算法

由圖5可知，5條SE核酸序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，5種SE序列聚成三大支，刺五加actin1,3（擬南芥）聚為一大支；枇杷（擬南芥）獨立聚為一支；刺五加actin（丹參）和刺五加actin2（擬南芥）為一支；枇杷（擬南芥）與刺五加actin（擬南芥）和刺五加actin(丹參)的親緣關(guān)系較遠。其中，刺五加actin與丹參和擬南芥SE親緣關(guān)系較近，但刺五加actin（擬南芥）之間的親緣關(guān)系較遠。

2.3.3 Maximum Parsimony Tree算法

由圖6可知，5條SE核酸序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，5種SE序列聚成兩大支，刺五加 actin1,2,3（擬南芥）和刺五加 actin（丹參）聚為一大支；枇杷（擬南芥）獨立聚為一支；刺五加actin1,2,3(擬南芥)和刺五加actin（丹參）親緣關(guān)系較近，而枇杷（擬南芥）的親緣關(guān)系較遠。

圖6 Maximum Parsimony算法

2.3.4 UPGMA Tree算法

由圖7可知，5條SE核酸序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，5種SE序列聚成三大支，刺五加actin1,3（擬南芥）聚為一大支；枇杷（擬南芥）獨立聚為一支；刺五加actin（丹參）和刺五加actin2（擬南芥）為一支；枇杷（擬南芥）與刺五加actin（擬南芥）和刺五加actin（丹參）的親緣關(guān)系較遠。其中，刺五加actin與丹參和擬南芥SE親緣關(guān)系較近，但刺五加actin（擬南芥）之間的親緣關(guān)系較遠。

2.3.5 Maximum Parsimony Tree算法

由圖8可知，5條SE核酸序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，5種SE序列聚成兩大支，刺五加actin1,3(擬南芥)和枇杷（擬南芥）聚為一大支；刺五加actin與丹參和擬南芥SE為一支；刺五加actin與丹參和擬南芥SE與刺五加actin1,3(擬南芥)的親緣關(guān)系較遠，而與枇杷（擬南芥）親緣關(guān)系較近。

圖7 UPGMA算法

圖8 Maximum Parsimony算法

3 討論與結(jié)論

將獲得的SE的核酸序列提交到美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的核酸序數(shù)據(jù)庫進行BLASTn相似性序列，結(jié)果顯示：擬南芥SE基因序列與刺五加actinSE基因序列相似性最高。為了分析SE的進化情況，從NCBI的數(shù)據(jù)庫中選取與SE基因編碼相似性較高的5條序列（丹參-刺五加actin（HM051058.1），擬南芥-枇杷SE2（NC_003071.7），擬南芥-刺五加 actin3（NC_003074.8），擬南芥-刺五加actin2（NC_003070.9），擬南芥-刺 五 加 actin1（NC_003076.8）），同源性分別達到刺五加actin（丹參）82%，枇杷SE2（擬南芥）75%，刺五加actin3（擬南芥）86%，刺五加actin2（擬南芥）83%，刺五加actin1（擬南芥）86%。從系統(tǒng)進化樹可以看出，刺五加actinSE基因與擬南芥SE基因的親緣關(guān)系較近，這與序列BLASTN的分析結(jié)果一致。系統(tǒng)進化分析將包括人參在內(nèi)的24種植物的SE進行比較分析，從結(jié)果中可以得出，刺五加actin1,2,3（擬南芥）和刺五加actin（丹參）親緣關(guān)系較近，而枇杷（擬南芥）的親緣關(guān)系較遠，這符合自然的進化規(guī)律。

由于鯊烯環(huán)氧酶在植物中存在的種類不多，且大多在藥用植物中，特別是在人參屬植物中，已發(fā)現(xiàn)并命名的基因至少有17個基因[10]。有一部分藥用植物中的SE基因已經(jīng)被克隆出來[5,7,11-17]，而桔梗中的三萜皂苷代謝通路的理論研究還不成熟。因此，在藥用植物中分析SE基因可以為揭示三萜皂苷的代謝通路、利用植物基因工程技術(shù)人工合成三萜皂苷具有重要意義，也為下一步克隆這些基因提供生物信息學(xué)理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]郁梅,方彭華,于桂芳,等.桔梗的化學(xué)成分和抗腫瘤活性研究進展[J].國際藥學(xué)研究雜志,2011,38(4)：280-283.

[2]李潔,高陽,劉云鳳,等.不同樹木落葉中三萜化合物的比較分析[J].河北林業(yè)科技,2011(2)：6-8.

[3]趙秀玲.桔梗的化學(xué)成分、藥理作用及資源開發(fā)的研究進展[J].中國調(diào)味品,2012,37(2)：5-8,24.

[4]唐瑤,陳洋,曹婉鑫,等.三萜皂苷結(jié)構(gòu)及應(yīng)用的研究進展[J].安徽化工,2015,41(2)：13-22.

[5]蔣軍富,李雄英,吳耀生,等.絞股藍鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆與序列分析[J].西北植物學(xué)報,2010,30(8)：1520-1526.

[6]付先軍.中藥歸經(jīng)（肺經(jīng)）理論和肺系方劑配伍規(guī)律的解析及在海洋中藥研發(fā)中的應(yīng)用[J].中國海洋大學(xué),2009,32(6)：1-249.

[7]牛云云,朱孝軒,羅紅梅,等.三萜皂苷合成生物學(xué)元件的開發(fā)：三七鯊烯環(huán)氧酶編碼基因克隆及表達模式分析[J]. 藥學(xué)學(xué)報,2013,48(2)：211-218.

[8]李晶,林雄杰,何靜敏,等.牛樟芝菌絲體和子實體三萜含量測定及Se和Mvd基因表達分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2016,29(9)：2206-2211.

[9]張艷敬,候志芳,梁韶,等.人參屬藥用植物三萜皂苷合成途徑關(guān)鍵酶的研究進展[J].特產(chǎn)研究,2016,38(2)：53-57,70.

[10]金健,吳亞運,晏旋,等.人參屬植物鯊烯環(huán)氧酶編碼基因的生物信息學(xué)分析[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué),2016,27(3)：9-12.

[11]李惠華,徐劍,劉小英,等.鯊烯環(huán)氧酶基因(SQEs)的克隆及其在溫度脅迫下與枇杷懸浮培養(yǎng)細胞中熊果酸(UA)含量的相關(guān)性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2015,23(4)：481-491.

[12]邢朝斌,曹蕾,陳龍,等.刺五加鯊烯環(huán)氧酶基因cDNA的克隆及序列分析[J].中國中藥雜志,2012,37(2)：172-175.

[13]牛云云.三七、西洋參中三萜皂苷合成關(guān)鍵酶基因的克隆及表達模式分析[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2013：1-82.

[14]殷秀梅.蛇足石杉HsFPS1、HsSQS1和HsSE1基因克隆、生物信息學(xué)預(yù)及表達分析 [D].重慶：西南大學(xué),2013：1-45.

[15]成慧,楊光,劉雅婧,等.龍牙楤木SE基因克隆與植物表達載體構(gòu)建[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,33(1)：47-50.

[16]SUZUKI H,ACHNINE L,XU R,et al.A genomics approach to the early stages of triterpene saponin biosynthesis in Medicago truncatula.Plant J,2002,32(6)：1033-1048.

[17]孫婷婷,鄒莉,張林芳,等.桑黃鯊烯環(huán)氧酶基因克隆與序列分析[J].中草藥,2015,46(18)：2768-2773.