核桃青皮乙酸乙酯提取物對煙蚜的防治作用

何念武，趙秦，魏佳樂

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛 726000）

煙蚜（Myzus persicae），又名桃蚜，屬于昆蟲綱同翅目蚜科昆蟲，遍布世界各地，在我國華北地區(qū)每年發(fā)生10余代，南方則高達30～40代，世代重疊極為嚴重，繁殖速度非常快，嚴重危害我國各產煙區(qū)煙草作物的正常生長，給廣大煙葉種植區(qū)帶來了嚴重危害。一直以來，對煙蚜的防治主要依賴化學農藥，在一段時期內，化學防治法占據著主導地位，但是隨著化學農藥的日益濫用，其負面影響也逐漸顯現(xiàn)，諸如煙蚜產生了明顯的抗藥性，殺傷煙蚜天敵，生態(tài)失衡和嚴重的環(huán)境污染等問題[1-2]。為了解決這一突出問題，廣大研究人員將目光轉向了生物防治。首先從植物中提取活性成分，繼而通過一定手段將其制成生物農藥以便用于煙草病蟲害防治，取得了明顯的成效[3]。

核桃青皮，藥材名為青龍衣(Cortex Juglans Mandshuricae)，始載于《開寶本草》，為核桃未成熟果實的外果皮，夏末秋初采收，脫皮機切制而成，再曬干或烘干。據報道核桃青皮中富含胡桃醌、多糖等活性成分[4-5]，具有鎮(zhèn)痛、抗癌、抑菌等功效[6-7]。商洛作為全國主要核桃產地，對于核桃副產物核桃青皮的研究則甚少，更談不上綜合開發(fā)利用。鑒于此，本文擬開展核桃青皮乙酸乙酯提取物的分離制備，繼而探討其對煙草蚜蟲的生物防治作用，以實現(xiàn)廢棄資源再利用和效益的最大化。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃青皮，采自商洛市洛南縣古城鎮(zhèn)中山村(N 34°1′29″；E 110°33′3″，海拔 800～1215 m)，煙苗、煙蚜于2016年5月源于洛南縣永豐冀洼村煙葉基地。農藥吡蟲啉，購于江蘇克勝集團股份有限公司，乙酸乙酯等試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理

將采集的核桃青皮自然晾干或放置于烘箱中烘干，干燥后粉碎，過60目篩，粉末儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乙酸乙酯提取物制備及含量測定

準確稱取核桃青皮粉末100 g，加5倍量乙酸乙酯于25℃下浸泡24 h，然后超聲輔助回流提取，每次超聲提取30 min，抽濾，殘渣用4倍量乙酸乙酯反復提取，重復3次。合并3次濾液，萃取，濃縮，干燥，備用。

采用高效液相色譜法（HPLC）測定提取物中胡桃醌含量[8]。

1.2.3 煙草蚜蟲的飼養(yǎng)

供試煙蚜收集于陜西省洛南縣冀洼煙葉種植基地，挑選形態(tài)大小較一致、體型健碩的煙蚜作為實驗供試蟲，飼養(yǎng)于昆蟲飼養(yǎng)籠內。

1.2.4 乙酸乙酯提取物對煙蚜的防治效果測定

1）對煙蚜的毒殺作用測定方法：采用梁永鋒[9]的噴霧法進行并做適當調整，加大實驗重復次數和供試煙蚜數量。將配制好的系列樣品溶液（1.0～20.0 mg·mL-1）均勻噴灑在事先剪好的煙葉上，以每皿100片煙葉和20頭煙蚜為一個實驗單位。取直徑14 cm清洗干凈的培養(yǎng)皿15個，鋪上濾紙和大小一致的煙草葉片，將供試煙蚜放入培養(yǎng)皿中，不蓋皿蓋，用四層紗布封閉以防煙蚜逃逸。以10 mg·mL-1市售農藥吡蟲啉作為陽性對照，乙酸乙酯溶液為正常對照組。置于昆蟲飼養(yǎng)籠中放置在事宜的條件下分別培養(yǎng)24 h和48 h后，觀察煙蚜死亡情況，煙蚜死亡率和校正死亡率的計算公式分別為：

死亡率=(死亡煙蚜數/供試煙蚜總數)×100%

校正死亡率=［(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)］×100%

2）對煙蚜拒食活性的測定方法：樣品配置和實驗分組安排同1.2.4中1）。不同之處在于煙葉裁剪時面積是之前的5倍，實驗前將煙葉分別浸蘸樣品溶液10 s后取出，在煙葉背部放置10頭煙蚜，其余操作同1.2.4中的1），分別在飼養(yǎng)24 h和48 h后觀察各實驗處理葉片上煙蚜的棲息數量，每處理重復5次，拒食率的計算公式為：

拒食率（%）=1-處理葉片煙蚜數/對照葉片煙蚜數×100%

3）作用時間對煙蚜拒食活性的影響評價方法

參照文獻[8]的方法進行。

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析

數據處理采用2016版Excel進行，統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行。

2 結果與分析

2.1 核桃青皮提取物中胡桃醌的含量

由圖1可以看出，胡桃醌標品色譜峰在22.0～22.5 min出現(xiàn)，而提取物色譜圖出峰較多，主要是含有其他成分的緣故。由外標法計算出乙酸乙酯提取物中的胡桃醌含量為24.5 mg·g-1。

2.2 乙酸乙酯提取物對煙蚜毒殺作用

由表1可知，不同濃度的乙酸乙酯提取物在作用24 h后，對煙蚜有明顯的毒殺作用，隨著提取物濃度的升高，其死亡率和校正死亡率都在升高，呈現(xiàn)出良好的劑量-效應關系。正常對照組毒殺作用不明顯，而陽性對照組的作用效果較明顯。當提取物濃度為20 mg·mL-1時，死亡率和校正死亡率最高，死亡率為43.13%，校正死亡率為 42.56%，其毒殺效果略高于陽性對照組。

圖1 胡桃醌和核桃青皮提取物HPLC圖

不同濃度乙酸乙酯提取物作用48 h后，毒殺效果比24 h的更加明顯。這說明提取物的毒殺作用不僅與濃度有關，也與時間有關，這為后續(xù)探究相同濃度在不同時間對煙蚜的拒食活性提供了依據。從表1中可以看出，當提取物濃度為20 mg·mL－1，在處理 48 h 后，毒殺活性最高，死亡率為66.35%，校正死亡率為65.81%。正常對照組毒殺效果依舊不明顯，與陽性實驗相比較，提取物濃度為20 mg·mL－1時，毒殺作用效果更明顯，校正死亡率和死亡率都比較高。

表1 核桃青皮提取物對煙蚜的觸殺作用/%

2.3 核桃青皮提取物對煙蚜的拒食活性

從表2中可以看出，核桃青皮乙酸乙酯提取物不同濃度對煙蚜的拒食作用有明顯的影響，作用24 h后，隨著濃度升高，拒食活性逐漸增大。陽性對照組拒食率相對較高，與之前的毒殺作用實驗相比，拒食活性實驗也存在良好的劑量-效應關系，而正常對照組的拒食率相對很低，對煙蚜幾乎沒有影響。

當提取物濃度為20 mg·mL-1時，處理48 h后拒食率最高，為70.22%，拒食率略高于陽性對照組。而正常對照組的拒食率在24 h和48 h時都很低，對煙蚜幾乎沒有影響。陽性對照組隨時間的增加，對煙蚜的拒食率也在逐漸升高。

在研究不同濃度提取物對煙蚜的毒殺作用和拒食活性實驗中，也存在一定的時間-效應關系，但是由于只設定了24 h和48 h兩個時間段。為了更好的說明這一點，繼而對作用時間進行了考察，從表3中可以看出，同一濃度的提取物在不同時間內對煙蚜有一定的拒食活性，隨著時間的不斷延長，拒食率越來越高，在48 h時，拒食率達到最高為42.3%，在72 h后拒食率又降低。這說明在一定的時間范圍內，核桃青皮的提取物對煙蚜存在時間-效應關系。陽性對照組的拒食率隨著時間的推移，也在升高；正常對照組幾乎沒有太大變化。

表2 煙蚜對不同濃度的核青青皮提取物的拒食率/%

表3 作用時間對煙蚜的拒食率/%

3 結論與討論

不同濃度的乙酸乙酯提取物在相同時間以及同一濃度不同時間均會對煙蚜產生不同程度的毒殺和拒食活性，隨著濃度和時間的不斷增大或延長其毒殺作用和拒食活性都在逐漸增大，并且呈現(xiàn)出較好的量效關系，說明核桃青皮乙酸乙酯提取物對煙蚜有較好的防治效果。

本文系統(tǒng)探究了核桃青皮乙酸乙酯提取物不同濃度和不同作用時間對煙草蚜蟲的生防作用，結果表明，核桃青皮乙酸乙酯提取物對煙蚜具有很好的毒殺作用和拒食活性，這與文獻[8]頗有異曲同工之處，不同的是文獻[8]中采用的是氯仿作為提取溶劑，并且本文研究結果要明顯優(yōu)于文獻[8]。另外，與梁永鋒等[9]研究相比，本文充分考察了作用時間和濃度對防治效果的影響。此外，王宏虬等[10]雖然也考察了核桃青皮不同溶劑提取物對馬鈴薯蚜蟲的防治作用，但未充分考察乙酸乙酯提取物作用時間對馬鈴薯蚜蟲的綜合防治效果。因此，本研究在一定程度上能夠為煙草病蟲害的生物防治提供參考。

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