植物根際促生菌的分離及對桔梗的促生效應

冀玉良

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛 726000）

植物根際促生菌 (plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是一類生存在植物的根內(nèi)或者根周圍的可促進植物生長及其對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類[1-3]。目前已鑒定出很多種的PGPR菌株，并且發(fā)現(xiàn)利用根際促生菌研發(fā)成促生菌劑應用于消除植物生長過程中的連作障礙方面具有極大的優(yōu)勢和應用潛力[4-7]。藥用植物桔梗在生長過程中面臨的最大難題就是連作障礙[8-9]，雖然接種植物根際促生菌劑在玉米、小麥、蔬菜等植物上的應用已取得了較好的促生作用效果[10-13]，但目前關于桔梗促生菌及其促生菌劑的研究尚不多見。另外目前對促生菌普遍研究的都是從一種植物根際分離的促生菌對本植物的促生作用,從一種植物根際分離的促生菌對另一種植物的促生作用的研究較少，尤其研究油菜根根際促生菌對桔梗的促生效應未見報道。本研究用多種不同配方的培養(yǎng)基從油菜的根際、根表篩選出有促生效應的功能菌株，并采用種子萌發(fā)試驗測定不同菌株對桔梗的促生效應，篩選對桔梗具有優(yōu)良的促生性能的菌株，為研制克服桔梗連作障礙的PGPR接種劑提供良好的菌種資源，進一步探索根際促生菌對藥用植物的促生作用機制，為植物根際促生菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣的采集

土壤樣品來自陜西省商州區(qū)油菜園（33.52°N,109.57°E，海拔798 m）健康油菜幼苗根際土。采用五點取樣法，取表層以下5～10 cm處的根圍土壤，將五處土壤混在一起放入無菌自封袋中帶回，置于4℃冰箱中備用。

1.1.2 桔梗種子

桔梗種子購于商州區(qū)沙河子鎮(zhèn)種子專營店。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基），King's B培養(yǎng)基（KB培養(yǎng)基），NBRIP培養(yǎng)基，硅酸鹽培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，蛋白胨氨化培養(yǎng)基，Ashby無氮培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方見文獻[6]。

1.2 方法

1.2.1 植物根際土壤樣品前期處理

在無菌操作臺中，將采來的健康油菜幼苗根際土壤樣品混合均勻，稱取土樣10 g，迅速倒入含有90 mL無菌水的三角瓶中（內(nèi)裝玻璃珠30粒），30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng) 0.5 h，按 8個濃度梯度（10-2～10-9g·mL-1）稀釋后，分別取0.1 mL土壤稀釋液涂布于NA、KB平板上，各設3個重復，于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。

1.2.2 植物根際促生細菌的篩選

選擇以上合適的稀釋度平板，按照形態(tài)、大小、顏色，挑取形態(tài)各異的典型單個菌落，在LB培養(yǎng)基上純化后得到斜面菌株，保存于4℃冰箱。按照參考文獻的方法將獲得的菌株分別點接至NBRIP培養(yǎng)基和硅酸鹽培養(yǎng)基，篩選具備解磷、解鉀的菌株[6-7]；將同時具有解磷、解鉀能力的菌株轉(zhuǎn)接到蛋白胨氨化培養(yǎng)基中，進行產(chǎn)NH3能力鑒定[6-7]；將同時具有解磷、解鉀和產(chǎn)NH3能力的待測菌株接入Ashby液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d,于620 nm處測其OD值，比較OD值的大小,鑒定各菌株的固氮能力[6-7]；制作生長素IAA標準曲線，將同時具有解磷、解鉀和產(chǎn)NH3能力的待測菌株接入特定液體培養(yǎng)基（添加0.5 g·L-1L-色氨酸）中，測定產(chǎn)IAA能力[6-7]。

1.2.3 種子萌發(fā)試驗

將篩選的菌株接種到含有100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床培養(yǎng)3 d，待細菌濃度達108cfu·mL-1時，將發(fā)酵菌液依次稀釋為6個梯度（10-1～10-6）的接種菌懸液。

在無菌環(huán)境下將桔梗種子用10%H2O2處理20 min，再用無菌蒸餾水沖洗6～7遍，晾干。然后將消毒的桔梗種子在對應濃度的菌懸液中浸泡20 min后，點播于裝有濕潤濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，以每皿放入30粒種子為宜，并向每皿中加入相應濃度梯度的菌懸液（菌懸液加入量以浸濕濾紙和種子為宜），每個處理做3個重復，對照組以無菌水代替菌懸液。加好后將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫箱中進行黑暗培養(yǎng)，萌發(fā)過程中每48 h添加1次等量的相應濃度梯度菌懸液和無菌水，定期觀察種子出芽的情況。種子萌發(fā)以胚根伸出1 mm為標準，第12 d時統(tǒng)計發(fā)芽率，培養(yǎng)18 d后，測定幼苗莖長度。

發(fā)芽率=發(fā)芽的種子總數(shù)/供試的種子總數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 根際促生菌的篩選

用2種不同配方的培養(yǎng)基，從油菜根際土壤中經(jīng)分離、純化共獲得81株菌，通過初篩得到19株菌具備溶磷和解鉀能力，通過進一步復篩，其中6個菌株又具備產(chǎn)氨、固氮、產(chǎn)IAA的能力，分別為 N-1、N-3、N-15、N-33、K-18、K-25。這些菌株的編號及相關信息如表1所示。

表1 6株促生菌的形態(tài)特征

2.1.1 菌株產(chǎn)氨能力

將19株具有溶磷和解鉀能力的菌株轉(zhuǎn)接到蛋白胨氨化培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)液中加入 4～6 滴納氏試劑，N-3、N-33、N-1、N-15、K-25、K-18這6種菌分別出現(xiàn)棕紅色沉淀，而不接種的蛋白胨氨化培養(yǎng)基未出現(xiàn)紅色沉淀。由此表明這6株菌具備產(chǎn)NH3的能力。6株菌的顏色由深到淺依次為K-25、N-15、K-18、N-33、N-1、N-3，相應的產(chǎn)氨能力由強到弱。

2.1.2 菌株固氮能力

具固氮能力的菌株在固氮培養(yǎng)基中能生長，菌體濃度越大，在620 nm處測得的OD值也越大。表2表示各菌液的OD值和菌株的固氮能力，從中可知，6株菌的固氮能力由強到弱依次為 K-25、N-15、K-18、N-1、N-33、N-3。通過對產(chǎn)氨和固氮能力的測定后發(fā)現(xiàn)，菌株K-25的產(chǎn)氨能力和固氮能力都是最強的。

表2 6株促生菌的固氮能力

2.1.3 菌株生長素含量

根據(jù)生長素在530 nm波長下的吸光度大小與其含量成一次線性關系制得標準曲線，以吸光度(Y)對生長素IAA濃度(X)進行回歸分析，得到回歸方程為：Y=0.0171X+0.0284，R2=0.9993。測定各菌株培養(yǎng)液在530 nm波長處的光密度值，計算 IAA 產(chǎn)量（mg·L-1）（表 3）?？梢钥闯?，OD 值越大相應的IAA含量越高，菌株K-18產(chǎn)生的生長素含量最少，菌株N-3產(chǎn)生的生長素含量最多。產(chǎn)生長素含量由高到低依次為N-3、N-33、N-1、N-15、K-25、K-18。

表3 6株促生菌的IAA含量

2.2 促生菌對種子萌發(fā)的影響

圖1中的(b)(c)(d)分別為接種3株促生菌菌懸液后桔梗種子的萌發(fā)情況，從中可以看出，與未接菌懸液的萌發(fā)種子幼苗相比，在N-1、K-25、N-15接種菌的影響下，桔梗幼苗的莖粗、莖長均超過對照組，具有明顯的促生作用。

圖2、圖3分別顯示了接種不同稀釋度的6株功能菌菌懸液后桔梗種子發(fā)芽率和莖長的變化趨勢。從中可以看出，在不同稀釋度的N-3和N-33菌懸液分別處理下的桔梗種子發(fā)芽率與莖長明顯低于對照組。接種N-33的桔梗種子在10-5稀釋度菌懸液下發(fā)芽率最高，為23.33%，比對照組發(fā)芽率低13.34%；平均莖長為0.71 cm，比對照組平均莖長少0.36 cm。接種N-3的桔梗種子在10-5稀釋度菌懸液下發(fā)芽率最高，為16.67%，比對照組發(fā)芽率低20%；平均莖長為0.62 cm，比對照組平均莖長少0.46 cm。

圖1 促生菌對桔梗幼苗生長的影響

圖2 促生菌對桔梗種子發(fā)芽數(shù)的影響

圖3 促生菌對桔梗幼苗莖長的影響

接種K-25的桔梗種子在10-5稀釋度菌懸液下發(fā)芽率最高，為70%，比對照組發(fā)芽率高33.33%；平均莖長為2.03 cm，比對照組平均莖長長0.95 cm。接種N-15的桔梗種子在10-4稀釋度菌懸液下發(fā)芽率最高，為60%，比對照組發(fā)芽率高23.33%；平均莖長為1.83cm，比對照組平均莖長長0.75 cm。接種N-1的桔梗種子在10-4稀釋度菌懸液下發(fā)芽率最高，為56.67%，比對照組發(fā)芽率高19.99%；平均莖長為1.61cm，比對照組平均莖長長0.53 cm。

K-25菌株在10-5稀釋度菌懸液下的促生效果最強，其次為N-15菌株在10-4稀釋度菌懸液下的促生效果較強，而N-1菌株在10-4稀釋度菌懸液下的促生效果略低于N-15菌株在10-4稀釋度菌懸液下的促生效果。在K-18菌株作用下的桔梗種子生長效果與對照組基本上沒有差別，說明沒有明顯的促生效應。

在稀釋度為 10-2的 N-3、N-33、N-1、N-15、K-25這5種菌懸液的作用下，桔梗種子都沒有發(fā)芽，而在此稀釋度的K-18菌作用下，桔梗種子的平均發(fā)芽率與平均莖長分別為40%、1.15 cm，略高于對照組。結合各促生菌生長素的含量來分析，推測桔梗種子在10-2稀釋度的各菌懸液作用下都沒有發(fā)芽可能是因為生長素含量太高，從而抑制了桔梗的生長。因為K-18產(chǎn)生的生長素含量較少，所以在該濃度下對桔梗有促生作用，但在更小的菌懸液濃度下也沒有促生作用。

3 結論與討論

本研究從油菜根際土壤中分離到19株同時具有溶磷和解鉀能力的功能菌，其中6株菌（N-1、N-3、N-15、N-33、K-25、K-18）具備產(chǎn)氨、產(chǎn) IAA和固氮能力。種子萌發(fā)試驗測定顯示接種N-1、N-15、K-25三株菌的桔梗種子發(fā)芽率和幼苗莖長均明顯高于未接菌的對照組，3株菌K-25、N-1、N-15對桔梗具有明顯的促生作用，其中K-25菌株的促生效果最強。這些結果證明了從一種植物根際能夠分離到對另一種植物有促生作用的功能菌株，促生菌株在不同植物根際的分布和作用存在交叉現(xiàn)象。由于不同植物的根際環(huán)境不完全相同，一種植物根際可能具有另一種植物根際促生菌所不具備的一些特性，因此在促生菌的分離中應該利用這種交叉現(xiàn)象來篩選某種植物的促生菌。

既然促生菌在不同植物根際存在交叉現(xiàn)象，在研發(fā)促生菌劑時也應該考慮促生菌之間的互補性，即將不同植物根際的促生菌組合在一起制成復合接菌劑，這樣可能會收到更好的促生效果。就本研究來說，從油菜根際土壤中篩選到的對桔梗具有促生作用的3株優(yōu)良菌株，可以再配合從桔梗根際篩選的促生菌來研發(fā)和制備桔梗促生菌劑。

PGPR一般通過產(chǎn)生長素、產(chǎn)嗜鐵素、溶磷解鉀等多種機制促進植物生長[14-17]，目前篩選促生菌一般也都以此為依據(jù)，如楊蓉等[18]以此為指標，從番茄、黃瓜、茄子、辣椒4種蔬菜作物的根際土壤中分別篩選出對黃瓜幼苗和番茄幼苗生長有顯著促生作用的細菌。另外植物根際細菌對植物起促生作用還是抑制作用，主要取決于不同物種的植物以及菌種代謝產(chǎn)物的濃度是否合適[7]，對此在本研究中也得到印證。本研究發(fā)現(xiàn)N-3和N-33菌株產(chǎn)生長素含量高，但對桔梗種子萌發(fā)和生長有抑制的現(xiàn)象，這說明促生菌產(chǎn)生長素的量和促生作用之間并不一定成正相關，促生菌對桔梗的促生作用有一定的生長素范圍，生長素含量太大往往反而對桔梗幼苗生長會產(chǎn)生抑制。因此，促生菌的篩選可以以溶磷、解鉀，產(chǎn)氨、產(chǎn)IAA和固氮能力等多項指標為依據(jù)，但必須進一步通過接種菌懸液的種子萌發(fā)試驗來驗證，而且具體到應用上，由于實際生態(tài)環(huán)境的復雜性[19]，最終更要通過大田試驗來驗證促生菌的促生效應。造成N-3和N-33菌株對桔梗生長抑制現(xiàn)象的主要原因可能是這兩株菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的其他次生代謝產(chǎn)物抑制了植物的正常生長，對此還有待進一步做深入的探索。

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