響應(yīng)面法優(yōu)化紅薯莖葉中綠原酸的提取工藝

單長(zhǎng)松，劉 錦，趙子彤，賈朝爽，楊 藝，劉 娟，吳 澎

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.蘇州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，江蘇 蘇州 215123)

紅薯又名白薯、甘薯、地瓜、番薯、山芋等，為旋花科一年生或多年生植物[1]，歷史悠久，在中國(guó)大部分地區(qū)都有種植，種植面積大、產(chǎn)量高，資源豐富，是中國(guó)4大糧食作物之一[2]。紅薯莖葉富含糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、VC等營(yíng)養(yǎng)成分，以及黃酮、綠原酸等生物活性成分[3-4],但其作為紅薯產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品一直未得到充分利用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，紅薯莖葉豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的保健作用越來越受到人們重視，其營(yíng)養(yǎng)與保健作用非常明顯[5-7]。研究表明，綠原酸是植物經(jīng)有氧呼吸過程中的莽草酸途徑所形成的一種苯丙素類化合物，廣泛存在于植物的莖、葉、花等部位，具有抗菌消炎、清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、增加白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能[8-10]，是許多中草藥及中成藥的主要成分。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紅薯莖葉中的綠原酸、黃酮類等物質(zhì)的研究，主要集中在黃酮類物質(zhì)的抗氧化及綠原酸的抗菌消炎功效等方面[11-13]，對(duì)提取工藝的研究也有報(bào)道，主要使用乙醇回流浸提法和超聲波輔助水提法[14-17]，均取得了一定的效果。提取工藝中使用超聲波，可以利用其空化作用使原料局部高溫或高壓，加快浸提中固—液2相間的傳質(zhì)速率，達(dá)到提高提取率的目的，近年來被廣泛應(yīng)用于植物中天然產(chǎn)物的提取工藝[18-21]。本研究以紅薯莖葉為原料，以乙醇為浸提液，使用響應(yīng)面法對(duì)紅薯莖葉中綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為紅薯莖葉綠原酸提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅薯莖葉：采自山東泰安，洗凈晾干，60 ℃烘干24 h，取烘干后的樣品粉碎過80目篩。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)：Sigma-Aldrich公司。無水乙醇(分析純)：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JA2003A電子天平：上海精密儀器有限公司；UV8000紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；BRANSON-B2510E超聲波清洗機(jī)：美國(guó)艾默生電氣集團(tuán)必能信公司；HERMLE-Z206-A離心機(jī)：德國(guó)哈默公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用無水乙醇溶解，并定容于25 mL容量瓶中，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)。用移液槍準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5 mL分別于6只25 mL容量瓶?jī)?nèi)，用無水乙醇定容。在322 nm處測(cè)定其吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，取平均值。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

1.2.2 樣品綠原酸含量的測(cè)定

綠原酸經(jīng)提取后，置于離心管中，以3 000 r/min離心10 min，將上清液定容至100 mL容量瓶中。準(zhǔn)確量取1 mL溶液定容于25 mL容量瓶中，于322 nm處測(cè)定樣品吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算綠原酸的濃度，然后根據(jù)公式(1)計(jì)算綠原酸得率，每組平行測(cè)定3次，取平均值。

(1)

式(1)中：α為綠原酸得率，mg/g；C為樣品中綠原酸濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為紅薯莖葉干粉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在張冕等[15]的研究基礎(chǔ)上，以50%乙醇溶液為溶劑，料液比為1∶35，超聲功率500 W，提取溫度50 ℃，分別將提取時(shí)間設(shè)為10、15、20、25、30 min，考察提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響。

提取時(shí)間25 min，料液比1∶35，超聲功率500 W，提取溫度分別為35、45、55、65、75 ℃，考察提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響。

提取時(shí)間25 min，超聲功率500 W，提取溫度65 ℃，設(shè)置料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，考察料液比對(duì)綠原酸提取率的影響。

提取時(shí)間設(shè)為25 min，料液比1:35，提取溫度65 ℃，設(shè)置乙醇濃度分別為35%、45%、55%、65%、75%，考察乙醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響。

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其擬合的直線方程為：y=0.027 44x+0.003 48，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，表明綠原酸在0～20 μg/mL范圍內(nèi)與吸光值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，加入50%乙醇35 mL，使料液比為1∶35 g/mL，在微波功率500 W、提取溫度50 ℃條件下，研究提取時(shí)間分別為10、15、20、25、30 min對(duì)紅薯莖葉綠原酸得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果如圖2所示，微波提取時(shí)間從10 min延長(zhǎng)到25 min的過程中，綠原酸得率逐漸增大，這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在微波輔助條件下，綠原酸逐漸從紅薯莖葉中擴(kuò)散至浸提液中，綠原酸得率逐漸增大；當(dāng)提取時(shí)間為25 min時(shí)，綠原酸的得率達(dá)到最大值；此后隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，得率呈下降趨勢(shì)。提取時(shí)間的延長(zhǎng)可以促進(jìn)紅薯莖葉中綠原酸更好地溶出，使溶出更加完全，但是過長(zhǎng)的提取時(shí)間可能會(huì)使溶出的綠原酸被氧化或被分解從而導(dǎo)致得率下降。因此，選擇浸提時(shí)間為25 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，加入50%乙醇35 mL，使料液比為1∶35 g/mL，在微波功率為500 W、提取時(shí)間為25 min的條件下，研究提取溫度(35、45、55、65、75 ℃)對(duì)紅薯莖葉綠原酸得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，在一定溫度范圍內(nèi)，綠原酸的得率隨提取溫度的升高而提高。這與綠原酸的溶解性有關(guān)，低溫條件不利于綠原酸的溶出，隨著溫度的升高綠原酸溶解性逐漸增強(qiáng)，浸提液中的分子運(yùn)動(dòng)速率也逐漸加快，紅薯莖葉與乙醇的傳質(zhì)作用得到加強(qiáng)[24]，綠原酸的得率逐漸升高。當(dāng)溫度為65 ℃時(shí)，綠原酸得率達(dá)到最大，之后，綠原酸得率隨溫度的升高呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。綠原酸本身不穩(wěn)定，提取時(shí)高溫條件會(huì)加速綠原酸的分解，并使其有效成分被破壞，綠原酸失活，從而使綠原酸的得率降低[18]。因此，本研究選擇的提取溫度為65 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響

2.2.3 料液比對(duì)綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，微波功率500 W，在提取時(shí)間為25 min、提取溫度為65 ℃的條件下，通過向各組樣品中加入不同體積的50%乙醇控制料液比，研究料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對(duì)紅薯莖葉綠原酸得率的影響。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)料液比為1:35 g/mL時(shí)，綠原酸的得率達(dá)到峰值，之后再繼續(xù)增大乙醇溶液體積時(shí)，綠原酸得率下降，說明在一定范圍內(nèi)增大乙醇溶液的用量有利于綠原酸的萃取，當(dāng)料液比達(dá)到一定值時(shí)，紅薯莖葉中的綠原酸的溶出量達(dá)到最大值，此后隨著乙醇溶液用量的增大，得率反而下降。這是由于乙醇溶液用量增大導(dǎo)致底物濃度減小，使分子間碰撞機(jī)會(huì)減少，從而使得率有所下降，此外，過大的溶劑用量也會(huì)造成資源浪費(fèi)，增加后續(xù)處理的困難。因此，選擇料液比為1∶35 g/mL。

圖4 料液比對(duì)綠原酸得率的影響

2.2.4 乙醇濃度對(duì)綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，在微波功率500 W、提取溫度65 ℃條件下提取25 min，向各組樣品中加入相同體積不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，使料液比為1∶35 g/mL，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%、45%、55%、65%、75%)對(duì)紅薯莖葉綠原酸得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果如圖6所示。由圖5可以看出，綠原酸得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)，這是由不同濃度的乙醇溶液解吸紅薯莖葉細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)能力不同造成的[27]；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，紅薯莖葉中綠原酸的得率最高，提取效果最佳。當(dāng)乙醇的濃度相對(duì)較高時(shí)，會(huì)使紅薯莖葉細(xì)胞中其它醇溶性物質(zhì)溶出的比例增多，造成有效成分所占比例減少，因此，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)大于45%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加綠原酸的得率逐漸下降。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%用于提取綠原酸。

圖5 乙醇濃度對(duì)綠原酸得率的影響

2.3 工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取影響綠原酸得率的4個(gè)主要因素，即提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析。每個(gè)因素取3個(gè)水平，分別以1、0、-1編碼，使用Design-Expert 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而確定紅薯莖葉綠原酸提取的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)自變量因素編碼及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD綠原酸得率/(mg/g)14-10-103．27271501013．123416-100-13．123317100-13．2557180-10-13．16581900003．4724200-1-103．1617210-1103．12782210103．24842300003．533124-11003．19002501-103．0976261-1003．22032700003．52132800003．329029-1-1003．1737

應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到紅薯莖葉中綠原酸的得率與各因素的二次方程模型：

綠原酸得率:

R1=3.46+9.392×10-3A-2.1×10-3B-2.2×10-2C-4.167×10-4D+1.2×10-2AB+3.5×10-2-4.3×10-2AD-1.2×10-2BC-1.1×10-2BD-2.175×10-3CD-1.1×10-1A2-1.8×10-1B2-1.4×10-1C2-1.4×10-1D2

對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

注：*表示顯著(P<0.05)。

由表3可知，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值的主次順序?yàn)镃>B>A>D，其因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.855 2)，當(dāng)P<0.05時(shí)表示該指標(biāo)顯著，回歸方差分析結(jié)果表明，整體模型的P=0.001 2<0.05，說明該二次方程模型達(dá)到顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.778 0>0.05，不顯著，說明該方程擬合較好，回歸方程能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，該模型可用于紅薯莖葉中綠原酸提取的最佳工藝條件的確定。

2.5 響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)值和各實(shí)驗(yàn)因子構(gòu)成的立體曲面圖如圖6所示，顯示了提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度中任意2個(gè)變量取0水平時(shí)，其余2個(gè)變量對(duì)紅薯莖葉中綠原酸提取率的影響。等高線圖中同一橢圓區(qū)域內(nèi)，綠原酸提取率是相同的，橢圓中心點(diǎn)為綠原酸提取率最高的點(diǎn)；由中心點(diǎn)向外緣延伸，綠原酸提取率逐漸減少。等高線的形狀可以反映實(shí)驗(yàn)因子交互影響響應(yīng)值的強(qiáng)弱，形狀越接近圓形則交互作用越不顯著。

圖6 各因素交互作用對(duì)綠原酸提取率影響的響應(yīng)曲面

圖6a、圖6b、圖6c和圖6e中等高線的形狀較圖6d和圖6f中的等高線的形狀更趨于橢圓，因此提取時(shí)間與提取溫度、提取時(shí)間與料液比、提取時(shí)間與乙醇濃度、提取溫度與乙醇濃度的交互作用對(duì)紅薯莖葉中綠原酸提取率的影響比提取溫度與料液比、料液比與乙醇濃度2因素的交互作用更顯著。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用Design Expert軟件進(jìn)行理論最佳工藝條件優(yōu)化，結(jié)果為：提取時(shí)間為25.17 min，提取溫度為64.43 ℃，料液比為1∶34.6，乙醇濃度為44.97%，在此最佳工藝條件下紅薯莖葉中綠原酸的理論得率為3.460 6 mg/g。為驗(yàn)證該方法的可靠性，采用最優(yōu)提取條件對(duì)紅薯莖葉中綠原酸進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn)，為了便于操作，將最佳提取工藝條件修正為提取時(shí)間為25 min、提取溫度為64.5 ℃、料液比為1∶35 g/mL、乙醇濃度為45%，在此條件下綠原酸的實(shí)際得率為3.442 1 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本一致。表明該模型可以較好地預(yù)測(cè)紅薯莖葉中綠原酸的提取率。

3 結(jié)論

采用Design-Expert軟件的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，建立紅薯莖葉中綠原酸提取工藝的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。方差分析結(jié)果表明：紅薯莖葉中綠原酸的提取率與提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度均有一定關(guān)系。結(jié)合響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定其最佳工藝參數(shù)：提取時(shí)間25 min，提取溫度64.5 ℃，料液比1∶35g/mL，乙醇濃度45%，在此條件下得率達(dá)3.442 1 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相符。根據(jù)響應(yīng)面分析法得到的紅薯莖葉中綠原酸的提取工藝參數(shù)是真實(shí)可靠的。

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