高血糖對大鼠絲狀乳頭、菌狀乳頭及味蕾的影響

劉彩云，龍明生，董紅，孟楊

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，湖北十堰442000；. 2.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔解剖生理學(xué)教研室，湖北武漢430071)

·論著·

高血糖對大鼠絲狀乳頭、菌狀乳頭及味蕾的影響

劉彩云1，龍明生1，董紅1，孟楊2

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，湖北十堰442000；. 2.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔解剖生理學(xué)教研室，湖北武漢430071)

目的探討高血糖對絲狀乳頭、菌狀乳頭及味覺感受器的影響，為臨床糖尿患者味覺功能紊亂的診斷、評估與治療提供形態(tài)學(xué)資料。方法30只健康雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為正常對照組(n=14)和糖尿病組(n=16)。以鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg一次性腹腔注射建立1型糖尿病模型。普通飼料喂養(yǎng)12周后取舌組織，以亞甲藍染色光鏡下觀察兩組大鼠舌菌狀乳頭數(shù)目以及類型。采用HE染色并在光鏡下觀察兩組大鼠菌狀乳頭、味蕾的組織學(xué)變化。采用Phtoshop軟件測量味蕾的大小、面積，并以SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果與對照組比較，糖尿病組大鼠味蕾數(shù)目減少、味蕾面積顯著縮小(P＜0.01)，但兩組間乳頭總數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；對照組大鼠菌狀乳頭91.1%為有孔菌狀乳頭，8.9%為無孔菌狀乳頭，未發(fā)現(xiàn)絲狀樣變的菌狀乳頭；與對照組比較，糖尿病組大鼠有孔菌狀乳頭數(shù)僅占59.1%，無孔菌狀乳頭數(shù)目顯著增多，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，并且出現(xiàn)絲狀樣變的菌狀乳頭。結(jié)論1型糖尿病大鼠味覺感受器表現(xiàn)出一系列萎縮的形態(tài)學(xué)改變特征；菌狀乳頭味蕾的面積與味覺敏感性相關(guān)。

糖尿病；菌狀乳頭；味蕾；味覺

味覺是對動物至關(guān)重要的特殊感覺功能，味覺的感受器是味蕾，味蕾是由60～100個味蕾細胞構(gòu)成的卵圓形小體。在哺乳動物中，味蕾主要分布于菌狀乳頭、葉狀乳頭和輪廓乳頭的上皮內(nèi)，而絲狀乳頭不具有味覺功能[1]。味覺系統(tǒng)構(gòu)成一個額外的內(nèi)分泌調(diào)控位點，影響食物攝入，進而調(diào)節(jié)機體能量平衡[2]。許多因素如年齡、溫度及疾病均可對味覺產(chǎn)生明顯的影響。隨著社會發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，糖尿病在世界范圍發(fā)病率逐年上升，而我國糖尿病患者數(shù)量位居全球首位，嚴重危害人民健康[3]。糖尿病主要危害為其各種并發(fā)癥，味覺損害正是其中之一。糖尿病患者的甜、咸等味覺敏感性顯著低于健康人群，嚴重影響其生活質(zhì)量，并因此可能導(dǎo)致其攝入較多的糖、鹽及調(diào)味品等從而不利于糖尿病患者的飲食控制。以往對糖尿病與味覺關(guān)系的研究多局限于味覺閾和敏感性方面，但糖尿病對味覺感受器形態(tài)、功能方面的影響方面的研究仍然少有報道。本研究建立了糖尿病大鼠模型并對高血糖對絲狀乳頭、菌狀乳頭及味覺感受器的形態(tài)學(xué)影響進行了研究，以期為臨床糖尿患者味覺功能紊亂的診斷、評估與治療提供形態(tài)學(xué)方面的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型建立SPF級成年雄性SD大鼠30只(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體質(zhì)量210～260 g。將大鼠按體質(zhì)量隨機分為對照組(n= 14)和造模組(n=16)。大鼠禁食24 h，造模組一次性腹腔注射1%STZ-檸檬酸鹽緩沖液，劑量為60 mg/kg(注射前取-20℃保存的粉劑STZ，以0.1 mmol/L，pH值為4.2的枸櫞酸緩沖液配制)。對照組腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。注射后48 h并禁食4 h后尾靜脈取血，檢測血糖(SureStep血糖儀)，以空腹血糖大于16.7 mmol/L，尿糖3+～4+，出現(xiàn)多飲、多食、多尿等表現(xiàn)并維持一周以上者確定為糖尿病模型建立并作為糖尿病組。模型建立后每周稱量體質(zhì)量，測定空腹血糖并排除不符合標準的實驗對象(糖尿病組1只造模不成功，中途死亡2只，故糖尿病組納入研究對象13只，對照組14只)。

1.2 標本制備普通飼料喂養(yǎng)，自由進食進水，喂養(yǎng)12周。處死前禁食12 h，自由飲水并稱取體質(zhì)量，斷尾取血并測定血糖。注射過量的戊巴比妥鈉以深麻醉致死大鼠，快速取出舌組織并制備組織切片，分別以亞甲藍及HE進行染色。

1.3 光鏡觀察以光學(xué)顯微鏡下觀察舌組織亞甲藍染色切片，比較兩組大鼠舌菌狀乳頭、味蕾的形態(tài)學(xué)變化，并對菌狀乳頭、味孔進行計數(shù)。觀察舌組織HE染色切片，比較兩組大鼠舌菌狀乳頭、味蕾的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 圖形分析光鏡下對菌狀乳頭味蕾的連續(xù)縱切面進行拍照，取味蕾面積最大者以Photoshop軟件測量味蕾長軸、短軸。因菌狀乳頭的味蕾縱切面近似橢圓形，故采用公式“截面積=π×長半軸×短半軸”(π為圓周率)計算味蕾面積。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法在同等放大倍數(shù)下，隨機選擇20個觀測值用SPSS15.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。本實驗中的計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差()表示，對相關(guān)數(shù)據(jù)之間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠狀態(tài)及體質(zhì)量、血糖情況對照組SD大鼠攝食、飲水情況、精神狀態(tài)及日?；顒泳?，體質(zhì)量逐漸增加。糖尿病組大鼠在STZ注射后一周內(nèi)即出現(xiàn)多尿、多飲、多食癥狀，體質(zhì)量自第2周開始較正常組有所下降。如表1所示，至第12周時，糖尿病組大鼠體質(zhì)量較正常組明顯下降(P＜0.01)。糖尿病組大鼠血糖較正常組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 兩組大鼠血糖、體質(zhì)量測量結(jié)果()

表1 兩組大鼠血糖、體質(zhì)量測量結(jié)果()

組別例數(shù)實驗前血糖(mmol/L)實驗后血糖(mmol/L)實驗前體質(zhì)量(g)實驗后體質(zhì)量(g對照組糖尿病組t值P值14 13 4.1±0.3 4.2±0.1 1.143 0.264 4.2±0.4 25.7±1.6 48.733＜0.01 236.8±9.2 239.4±8.4 0.765 0.451 ) 443.2±7.3 206.1±6.2 90.565＜0.01

2.2 大鼠舌乳頭形態(tài)結(jié)構(gòu)改變

2.2.1 亞甲藍染色正常對照組SD大鼠在舌背表面數(shù)量較多，呈圓錐狀的為絲狀乳頭。菌狀乳頭散在于絲狀乳頭之間，數(shù)量較少、體積較大、頂部呈凸向上的近似半圓形，著色較淺(圖1A)。在菌狀乳頭的頂部中央著色較深，該處即為味孔區(qū)域(圖1B)。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)對照組大鼠菌狀乳頭有兩種形態(tài)，即有孔菌狀乳頭和無孔菌狀乳頭，其中有孔菌狀乳頭比例高達91.1%。與對照組比較，糖尿病組菌狀乳頭呈現(xiàn)三種形態(tài)：有孔菌狀乳頭、無孔菌狀乳頭和絲狀樣變的菌狀乳頭(圖1C、1D)。如表2所示，其中有孔菌狀乳頭數(shù)量僅占59.1%，顯著減少；無孔菌狀乳頭達34.9%，顯著增多；而且還出現(xiàn)了少量絲狀樣變的菌狀乳頭。

表2 兩組大鼠菌狀乳頭的類型和數(shù)目比較(，個)

表2 兩組大鼠菌狀乳頭的類型和數(shù)目比較(，個)

注：FF：菌狀乳頭。

組別例數(shù)有孔FF 無孔FF 絲樣變FF FF總數(shù)對照組糖尿病組t值P值14 13 76.58±1.20 47.34±2.31 41.721＜0.001 7.46±0.35 27.93±1.01 71.445＜0.001 0 4.70±0.20 88.065＜0.001 84.04±0.60 79.97±2.03 1.967 0.061

2.2.2 HE染色正常對照組大鼠菌狀乳頭呈蘑菇狀，乳頭表面為較薄的角化上皮，乳頭結(jié)締組織內(nèi)毛細血管較豐富，乳頭頂部上皮內(nèi)可見味蕾(圖2A)。與對照組比較，糖尿病組觀察到3種形態(tài)的菌狀乳頭。(1)有孔菌狀乳頭：菌狀乳頭內(nèi)含有味蕾及味孔，但菌狀乳頭表面角化層明顯增厚，結(jié)締組織內(nèi)毛細血管減少，味蕾體積縮小(圖2B)。(2)無孔菌狀乳頭：菌狀乳頭內(nèi)未見味蕾及味孔，菌狀乳頭表面角化層增厚，固有層內(nèi)未見初級乳頭(圖2C)。(3)絲狀樣改變菌狀乳頭：菌狀乳頭呈尖錐狀隆起，角化層明顯增厚(圖2D)。正常組絲狀乳頭排列有序，統(tǒng)一向舌根方向傾斜(圖3A)，糖尿病組絲狀乳頭排列較雜亂(圖3B)。比較兩組大鼠味蕾面積，對照組大鼠味蕾約(551.32±18.30)μm2，糖尿病組味蕾面積縮小至(265.67±13.24)μm2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 大鼠舌乳頭亞甲藍染色

圖2 大鼠舌菌狀乳頭HE染色

圖3 大鼠舌絲狀乳頭HE染色

3 討論

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟的數(shù)據(jù)，中國糖尿病患者總數(shù)近1.1億，已成為全球糖尿病發(fā)病的第一大國；且患者仍迅速增加，至2040年預(yù)計將達到1.5億，仍居世界首位。糖尿病已經(jīng)成為我國人民健康造的重大威脅。糖尿病的危害主要在于其多種并發(fā)癥。味覺損害也是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，并長期遭到忽視。Floch等[4]用電味覺和化學(xué)測定兩種方法研究了糖尿病對患者味覺的影響，結(jié)果顯示糖尿病患者甜、苦、咸、酸四種基本味覺均有減退，有73%的患者味覺受損，而健康人僅為16%，結(jié)果還提示味覺損害與糖尿病導(dǎo)致的周圍神經(jīng)病變相關(guān)。味覺損害嚴重影響糖尿病患者生活質(zhì)量，特別是由于味覺退化，患者較之健康人群傾向于更多地攝取鹽、糖及各類調(diào)味品，不利于糖尿病飲食控制，長此以往將加重糖尿病病情。然而，糖尿病引起的味覺損害尚未引起足夠重視，而當味覺功能減退時，國內(nèi)外目前尚無有效的治療方法。因此，對糖尿病導(dǎo)致味覺損害的機制進行研究對臨床糖尿患者味覺功能紊亂的診斷、評估與早期預(yù)防均有重要的意義。

味蕾是味覺的化學(xué)感受器，味蕾頂端的味孔和伸入味孔的味毛是味覺產(chǎn)生的起始部位。味物質(zhì)通過味孔與味細胞頂端微絨毛上的味受體或離子通道受體結(jié)合，進而將化學(xué)刺激信號傳遞至胞內(nèi)，隨后味細胞去極化并向與之相連的味覺傳入神經(jīng)釋放神經(jīng)遞質(zhì)并引發(fā)神經(jīng)元興奮，產(chǎn)生的電信號傳入大腦并最終引起味覺。可見，味蕾在味覺產(chǎn)生中扮演著至關(guān)重要的角色。味蕾的分化、發(fā)育及正常形態(tài)的維持有賴于味覺神經(jīng)的支配及營養(yǎng)作用[5]。當神經(jīng)纖維損傷或切斷時，其支配的味蕾隨之減少甚至消失，而神經(jīng)重新分布支配時，味蕾再生[6]。哺乳動物的味蕾絕大部分分布于味乳頭尤其是菌狀乳頭中，味蕾的數(shù)量、大小及功能取決于味乳頭的健康狀態(tài)。有國外研究表明感覺神經(jīng)纖維在味乳頭特別是菌狀乳頭的形成與發(fā)育中起著重要作用[7]。在倉鼠上進行的單側(cè)鼓索神經(jīng)切斷試驗表明[8]：失去鼓索神經(jīng)支配的菌狀乳頭上味蕾味孔直徑變小，味小管管徑變窄。Sollars等[9]也研究發(fā)現(xiàn)：新生大鼠切除單側(cè)鼓索神經(jīng)后該側(cè)菌狀乳頭數(shù)量減少，味蕾體積縮小，發(fā)育受到嚴重影響，提示菌狀乳頭和味蕾的正常發(fā)育高度依賴神經(jīng)支配。

糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)病變可累及人體神經(jīng)系統(tǒng)的各個部分，且感覺神經(jīng)受損早于運動神經(jīng)，相當一部分患者在糖尿病早期乃至糖耐量受損期就出現(xiàn)了可經(jīng)肌電圖證實的感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢。研究表明：糖尿病周圍神經(jīng)病變患者常合并味覺功能減退[10]。本研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病組大鼠有孔菌狀乳頭明顯減少且菌狀乳頭味孔密度顯著降低，反之無孔菌狀乳頭、絲狀樣變的菌狀乳頭顯著增多，菌狀乳頭頂部變窄，初級乳頭消失，絲狀乳頭也出現(xiàn)了萎縮等現(xiàn)象；味蕾面積顯著縮小，部分菌狀乳頭內(nèi)味蕾消失。與正常對照組相比，糖尿病組菌狀乳頭角化層明顯增厚，固有層內(nèi)未見明顯初級乳頭，味蕾的高度降低，面積顯著縮小。隨著菌狀乳頭及味蕾、味孔的密度降低，味覺化學(xué)感受器減少，這直接影響味物質(zhì)與味細胞、味受體的結(jié)合，進而導(dǎo)致味覺功能受損。Patricio等[11]研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病患者味覺損害可能與味乳頭密度減少有關(guān)，本研究結(jié)果進一步證實了上述發(fā)現(xiàn)。味乳頭及味蕾正常形態(tài)和功能的維持高度依賴味覺神經(jīng)纖維，據(jù)此我們進一步推測糖尿病組大鼠味蕾及味乳頭的改變可能與糖尿病導(dǎo)致的味覺神經(jīng)纖維受損有關(guān)，這也為糖尿病患者味覺損害機制研究及防治提供了新的思路。

Schiffman等[12]提出：“味覺是人的大問題和難題，我們可以矯正視力，改善聽力，但是很難恢復(fù)我們的味覺”。味覺損害是糖尿病的早期并發(fā)癥之一，且與神經(jīng)損傷密切相關(guān)。本研究探討了高血糖對菌狀乳頭、絲狀乳頭及味蕾的影響，為糖尿病導(dǎo)致的味覺損害機制研究和臨床味覺功能紊亂癥的早期診斷與治療以及糖尿病神經(jīng)損害的早期預(yù)警提供了形態(tài)學(xué)資料。但其具體機制及與糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)損害間的相互關(guān)系仍不明確，有待進一步研究。

[1]陳令中,鐘翠平,蔡文琴.現(xiàn)代組織學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)文獻出版社,2003:744-751.

[2]Cai H,Maudsley S,Martin B.What is the role of metabolic hormones in taste buds of the tongue[J].Front Horm Res,2014,42: 134-146.

[3]Mizisin AP,Bache M,DiStefano PS,et al.BDNF attenuates functional and structural disorders in nerves of galactose-fed rats[J].J Neuropathol Exp Neurol,1997,56(12):1290-1301.

[4]Le Floch JP,Lièvre GL,Verroust J,et al.Factors related to the electric taste threshold in type 1 diabetic patients[J].Diabet Med,1990,7 (6):526-531.

[5]Jung HS,Akita K,Kim JY.Spacing patterns on tongue surface-gustatory papilla[J].Int J Dev Biol,2004,48(2-3):157-161.

[6]Nosrat CA,Olson L.Changes in neurotrophin-3 messenger RNA expression patterns in the prenatal rat tongue suggest guidance of developing somatosensory nerves to their final targets[J].Cell Tissue Res, 1998,292(3):619-623.

[7]Whitehead MC,Kachele DL.Development of fungiform papillae, taste buds,and their innervation in the hamster[J].J Comp Neurol, 1994,340(4):515-530.

[8]Parks JD,Whitehead MC.Scanning electron microscopy of denervated taste buds in hamster:morphology of fungiform taste pores[J]. Anat Rec,1998,251(2):230-239.

[9]Sollars SI.Chorda tympani nerve transection at different developmental ages produces differential effects on taste bud volume and papillae morphology in the rat[J].J Neurobiol,2005,64(3):310-320.

[10]李利,王軍,姜宏衛(wèi).糖尿病并發(fā)癥研究進展-第61屆ADA年會紀要[J].國外醫(yī)學(xué):內(nèi)分泌學(xué)分冊,2002,22(1):52-53.

[11]Patricio EFS,Gallo CB,Pellegrini VD.Taste acuity and gustatory papillae density in patients with chronic diseases[J].Oral Surg,Oral Med,Oral Path and Oral Rad,2015,114(4):e109.

[12]Schiffman SS,Zervakis J,Suggs MS,et al.Effect of tricyclic antidepressants on taste responses in humans and gerbils[J].Pharmacol Biochem Behav,2000,65(4):599-609.

Impact of hyperglycemia on filiform papillae,fungiform papillae and taste buds in rats.

LIU Cai-yun1,LONG Ming-sheng1,DONG Hong1,MENG Yang2.1.Department of Oral Medicine,Dongfeng Stomatology Hospital，Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;2.Department of Oral Anatomy and Physiology,School of Medicine, Wuhan University,Wuhan 430071,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the impact of hyperglycemia on the filiform papillae,the fungiform papillae and taste buds in rats,so as to provide morphological data for diagnosis,assessment and treatment of diabetics with taste dysfunction.MethodsThirty healthy male SD rats were randomly divided into control group(n=14)and diabetic group(n=16)according to weight.Type 1 diabetic rats were induced by a single intraperitoneal injection streptozotocin (60 mg/kg).And then rats were fed on regular chow diet for 12 weeks.The tongue tissues were removed after 12 weeks. The number and shapes of fungiform papillae were observed by methylene blue staining and light microscopy.The morphological alterations of fungiform papillae and taste buds were observed by HE staining.Phtoshop software was used to measure the size and area of taste buds.The results were analyzed by the SPSS15.0 statistical software.ResultsCompared with normal controls，the number and area of taste buds in diabetic rats decreased significantly(P＜0.01).However，there was no significant difference in total number of the papillae between the two groups(P＞0.05).Taste pores were found on 91.1%fungiform papillae(poreless papillae was 8.9%),and there was no fungiform papillae with a filiform-like appearance in control rats.Compared with control rats,taste pores were found on 59.1%fungiform papillae in diabetic rats,and the number of poreless papillae was significantly increased(P＜0.01),there was fungiform papillae with filiform-like papillae.ConclusionGustatory receptor of type 1 diabetic rat showed a series of atrophy changes. The area of taste buds on fungiform papillae was associated with taste sensitivity.

Diabetes;Fungiform papillae;Taste buds;Rats;

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.001

R-332

A

1003—6350（2017）08—1205—04

2016-11-16)

湖北省衛(wèi)生廳科研基金（編號：JXIB068）;湖北省十堰市科技局引導(dǎo)型資助項目（編號：14y5Y51)

孟楊。E-mail:Mengyang56@126.com