香菇寡糖提取及分離純化研究

王玖玖+施永生+孫曉紅+韓梅琳+晏卓逸+高紅

摘要：為提取食用菌中寡糖，以人工種植香菇子實(shí)體為試材，用水提、超濾和納濾、醇沉等方法提取其中寡糖。①選擇料液比、浸提溫度和浸提時間3個因素進(jìn)行單因素實(shí)驗，確定其條件范圍，采用正交試驗優(yōu)化提取條件，得到該工藝下最佳提取工藝參數(shù)：料液比1：16，提取溫度60℃，提取時間10 min。②優(yōu)化膜工藝，確定超濾最佳壓力為0.75MPa，納濾最佳壓力為1.95 MPa，料液pH為7；③浸提次數(shù)為2次，95%乙醇抽提。在此工藝下香菇寡糖的最高得率為1.07%。

Abstract： In order to extract oligosaccharides from edible fungi， taking the artificially cultivated mushroom as the test material， oligosaccharides were extracted by water extraction， ultrafiltration and nanofiltration and alcohol precipitation. First， a single factor experiment was carried out by selecting the ratio of material to liquid， extraction temperature and extraction time to determine the scope of its conditions. The extraction conditions were optimized by orthogonal test， and the optimum extraction parameters were obtained： the ratio of material to liquid was 1：16 ， the extraction temperature was 60℃， the extraction time was 10 min. Second， optimized membrane technology to determine the optimal pressure of ultrafiltration was 0.75MPa， the best pressure of nanofiltration is 1.95 MPa， the liquid pH is 7. Third， the extraction times were 2， 95% ethanol extraction. The highest yield of lentinan oligosaccharides was 1.07% under this process.

關(guān)鍵詞：香菇寡糖；超濾；納濾；正交試驗

Key words： mushrooms oligosaccharides；ultrafiltration；nanofiltration；orthogonal test

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-4311（2017）15-0170-05

0 引言

我國人工培育食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，是一個急待開發(fā)的資源寶庫[1]。寡糖分子量在300～2000，廣泛分布于食用菌類、水果中。但有關(guān)香菇寡糖的報道鮮見，香菇寡糖主要成分是β-1，3-葡寡糖[2-4]，可以刺激人體產(chǎn)生細(xì)胞因子，能有效抗腫瘤、抗輻射[5-7]；同時可以誘導(dǎo)植物對病原菌產(chǎn)生抗性，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域具有廣闊的潛在應(yīng)用價值。

β-1，3-葡寡糖制備主要由多糖水解、人工合成兩種方法。這些方法步驟多、產(chǎn)量低、成本高、在實(shí)際應(yīng)用中仍比較困難[8-10]。膜分離是利用半透膜作為選擇障礙層，依據(jù)膜孔徑大小達(dá)到分離目的的一門新技術(shù)，不僅操作簡單，生產(chǎn)過程無污染，而且產(chǎn)物活性高，試驗首次采用超濾和納濾法對香菇寡糖進(jìn)行分離與純化，為香菇寡糖的深入研究和全面開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器、材料

超濾膜[切割分子量（MWCO）為2000，濾膜的有效面積為0.5m2]；納濾膜[MWCO為300]由廈門福美科技有限公司提供；RNF0460-011卷式膜多功能小試設(shè)備。

大批量鮮香菇在收獲季節(jié)不易儲存，因此考慮到實(shí)際生產(chǎn)的需要，將香菇烘干粉碎，有利于延長儲存時間，試驗以香菇粉為研究對象。

香菇購于北京市蔬菜超市，烘干粉碎機(jī)打碎，放置陰涼通風(fēng)處，備用；無水乙醇（分析純）；苯酚（分析純）；濃硫酸（分析純）；葡萄糖（分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 香菇寡糖提取流程

香菇寡糖提取流程如圖1所示。

1.2.2 不同處理方式對香菇寡糖提取的影響

研究香菇干、鮮程度對寡糖得率的影響：①新鮮香菇洗凈、切片，用高速組織搗碎機(jī)破碎勻漿；②將新鮮香菇洗凈，70℃烘干至恒重后，粉碎機(jī)粉碎。

1.2.3 香菇寡糖提取工藝優(yōu)化

以水為溶劑，采用不同提取時間、溫度、料液比[11]，分次水提香菇粉，確定單因素最優(yōu)條件范圍。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取浸提溫度（A）、浸提時間（B）、料液比（C）為因素，采取L9（33）正交實(shí)驗，以提取率為衡量指標(biāo)。

在確定最優(yōu)條件后，將水提液加入到RNF0460-011卷式膜設(shè)備中過濾，收集濾液，醇沉后冷凍干燥制得成品[12]。

1.2.4 壓力對膜通量的影響

膜通量與壓力成正比關(guān)系，壓力越大，通量越大，但是壓力越大，能耗越大，成本隨之增加，所以研究操作壓力的大小對指導(dǎo)實(shí)際應(yīng)用有重要意義。

1.2.5 料液pH對膜通量的影響

料液的pH可以改變聚電解質(zhì)構(gòu)型和分散性，分別控制料液pH為3、5、7、9和11，測定膜通量的變化，以及寡糖含量的變化。

1.2.6 水提次數(shù)的確定

以上試驗基礎(chǔ)上，分別測定浸提次數(shù)1次、2次、3次對寡糖提取率的影響。

1.2.7 醇抽提方法的確定

甲醇法：5mL水提取液中加入95mL甲醇，攪拌后靜置冷卻24h后離心。

乙醇法：5mL水提取液中加入95mL甲醇，攪拌后靜置冷卻24h后離心。

甲醇-乙醇法：5mL水提取液中加入95mL甲醇-乙醇混合物（V：V=1：1），攪拌后靜置冷卻24h后離心。

1.2.8 香菇寡糖測定

采用苯酚-硫酸法測定香菇寡糖的含量，包括制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定實(shí)驗樣品香菇寡糖含量兩部分[13]。

寡糖提取率根據(jù)以下公式計算：

式中，M1寡糖含量、M2香菇粉單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對香菇寡糖提取率的影響

由表1可見，鮮香菇直接破碎勻漿后提取與烘干粉碎再提取，寡糖含量差異不顯著，但所得寡糖顏色有明顯差異。

2.2 香菇寡糖的提取工藝優(yōu)化

以水為溶劑，使用不同提取時間、溫度、料液比，分次水提香菇粉，過濾后合并提取液，水提液稀釋到4L后加入到卷式膜設(shè)備中，收集300～2000分子量的寡糖溶液，蒸發(fā)溶液至小體積[14]，95%乙醇醇沉，過濾，收集濾粉。濾粉復(fù)溶于水，真空干燥制得香菇寡糖樣品。采用單因素試驗和正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取條件，探討各條件對香菇寡糖得率的影響。

2.2.1 單因素試驗

影響香菇寡糖提取率的因素，經(jīng)上述分析可知，主要有提取時間、提取溫度和料液比3個影響因素。在一定范圍內(nèi)，浸提時間、浸提溫度、料液比越大寡糖含量相對越高，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，考慮節(jié)約成本及提取效率等實(shí)際因素，應(yīng)當(dāng)綜合考慮。

2.2.1.1 單因素提取時間試驗結(jié)果

20g香菇粉，在提取溫度70℃，料液比1：20條件下進(jìn)行提取，提取時間對寡糖提取率影響結(jié)果如圖3。

圖3所示，隨著提取時間的增長，提取率在一定范圍內(nèi)呈上升趨勢，10min時達(dá)到最大提取率1.04%，之后隨著時間的延長呈下降趨勢，造成上述現(xiàn)象的原因：①完成上述實(shí)驗過程需要足夠時間，在最初10min，寡糖的含量有明顯的增加，隨著提取時間延長，寡糖含量下降，這是由于寡糖在長時間提取過程中進(jìn)一步被水解破壞，致寡糖含量降低，使提取率下降；②隨著時間的持續(xù)，部分香菇多糖溶解，多糖結(jié)構(gòu)中重復(fù)單元的有序鏈段，能與另一個多糖鏈的相同序列鏈段發(fā)生締合，形成雙螺旋，構(gòu)成具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，對寡糖的吸附有一定影響。為縮短工時降低能耗，選擇提取時間為5～25min進(jìn)行正交實(shí)驗為宜[15～16]。

方差齊性檢驗結(jié)果p=0.379>0.05，變異數(shù)分析結(jié)果F=209.849，顯著性p<0.05，影響顯著。

2.2.1.2 單因素提取溫度試驗結(jié)果

20g香菇粉，提取時間10min、料液比為1：20條件下，提取溫度對寡糖提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4所示，提取率隨著提取溫度的升高而上升，提取溫度為60℃時達(dá)到最高提取率1.07%。提取溫度大于60℃后，提取率隨著溫度升高降低。造成上述現(xiàn)象的原因是：①香菇子實(shí)體的細(xì)胞壁存在多糖和寡糖，這部分多糖對細(xì)胞組織起著軟化和粘合的作用，隨著溫度不斷升高，水分子運(yùn)動加快，多糖分子之間的氫鍵容易被破壞，多糖糖基上的羥基、糖苷鍵上的氧原子更容易與水分子結(jié)合形成氫鍵，使多糖在水中溶解度增大，部分香菇多糖溶解；②香菇多糖具有β-1，3-葡萄糖苷鍵，是一種直鏈多糖，直鏈多糖粘稠性強(qiáng)于支鏈多糖，可以吸附一部分寡糖，寡糖提取率降低；③溫度可以影響不同聚合度寡糖的提取，有實(shí)驗研究顯示，低聚合度寡糖（聚合度2～6）的水解適宜溫度為70°C，但是隨著提取溫度繼續(xù)升高，低聚合度寡糖逐漸水解為葡萄糖；游離狀態(tài)的多糖容易被破壞而生成聚合度較大的寡糖，隨著水解進(jìn)行，多糖分子繼續(xù)水解生成寡糖速度較慢，而小分子寡糖生成葡萄糖的速度相對較快，導(dǎo)致寡糖收率降低，所以選擇提取溫度50～70℃進(jìn)行正交實(shí)驗為宜[17～18]。

方差齊性檢驗結(jié)果p=0.679>0.05，變異數(shù)分析結(jié)果F=321.088，顯著性p<0.05，影響顯著。

2.2.1.3 單因素料液比的影響

20g香菇粉，在提取溫度50℃，提取時間10min條件下，料液比對寡糖提取率的影響結(jié)果見圖5。

如圖5所示，料液比增大，香菇寡糖提取率在一定范圍內(nèi)上升，當(dāng)料液比達(dá)到1：24時，提取率達(dá)到最高0.84%，繼續(xù)增加料液比，提取率不再明顯上升，反而下降。造成上述現(xiàn)象的原因是：①料液比過小，寡糖溶解不完全，所以寡糖提取率較低，料液比持續(xù)增加，香菇寡糖提取量在一定范圍內(nèi)增加，當(dāng)料液比達(dá)到1：24時，基本可以溶解所有寡糖。②卷式膜設(shè)備分離寡糖過程中，膜對寡糖也存在一定吸附，也會增加膜對寡糖截留率，致提取率比較低。由于料液比是影響提取率的重要因素，選擇料液比1：16～1：32進(jìn)行正交實(shí)驗為宜。

方差齊性檢驗結(jié)果p=0.349>0.05，變異數(shù)分析結(jié)果F=24.670，顯著性p<0.05，影響顯著。

2.2.2 香菇寡糖提取正交實(shí)驗

按95%乙醇提取，選取浸提溫度、浸提時間、料液比進(jìn)行三因素三水平正交試驗，試驗結(jié)果見表3。

正交實(shí)驗效應(yīng)曲線如圖6所示。

圖6大致反映了溫度（A）、時間（B）、料液比（C）對寡糖提取率的影響，較高的溫度對寡糖的提取有益，而相對較短的時間也有利于寡糖的溶解，相對較低的料液比，降低多糖對寡糖的吸附等影響，也對寡糖的提取有益[19-20]。極值R反應(yīng)了不同因素的水平改變對實(shí)驗結(jié)果影響的大小，其值越大，所在列的因素影響也越明顯，極差R值的大小是A>C>B，因此各因素對寡糖提取率的影響主次為A>C>B，最佳寡糖提取工藝條件是A3B2C1，即60℃、10min、1：16時，此優(yōu)化條件下，香菇寡糖的提取率可達(dá)1.07%。

2.2.3 香菇寡糖浸提液的分級純化過程

利用超濾、納濾技術(shù)實(shí)現(xiàn)香菇寡糖的分級純化，料液初始濃度會影響其截留性能，濃度過大，超濾過程中濾膜上的凝膠層越易形成，膜污染的程度越大，對膜傷害越大；同時操作壓力越大，料液循環(huán)速度越快，但是操作壓力過高，膜的壓密效應(yīng)顯著，膜孔徑會變小，也不利于膜濾；過濾過程中濾液的溫度對膜分離過程的傳質(zhì)效果、膜面沉積等都有著較大影響。

濾膜的污染是不可逆的，因此將浸提液稀釋到4L，溫度降為室溫，控制操作壓力為0.75MPa和1.95MPa，把浸提液依次用截留相對分子質(zhì)量為2000和300的卷式膜過濾，收集300～2000分子量的寡糖溶液，整個過濾過程控制溫度在25℃～40℃。

2.2.4 壓力對膜通量的影響

操作壓力對膜通量的影響可以分為低壓、中壓、高壓，不同壓力影響膜通量的主導(dǎo)阻力不相同，相應(yīng)的有不同的控制方法。在最佳工藝條件下，考察壓力對通量的影響，實(shí)驗結(jié)果如表4所示。

增幅根據(jù)以下公式計算：

由表4可知，操作壓力由0.75MPa上升到2.35MPa的過程中，超濾和納濾膜濾速也是呈上升趨勢，但料液流速的加快勢必會增加系統(tǒng)的能耗，所以料液流速不能無限制地升高，通過對比增幅，可以相對準(zhǔn)確的確定膜壓力。超濾膜壓力由0.75MPa升高到2.35MPa時，壓力改變0.4MPa，濾速由1.13增加到1.9，則濾速增幅為1.9；同理可知，納濾膜從1.55MPa升高到1.95MPa，濾速增幅為17.5。

RNF0460-011卷式膜膜芯2000Dal（超濾）走水測試低壓為0.35MPa，高壓1.1MPa，超濾最高壓力一般控制在1.1MPa以內(nèi)；模芯300Dal（納濾）走水測試低壓為0.69MPa，中壓1.55MPa，高壓2.5MPa以上。在實(shí)際應(yīng)用中，操作壓力通常選擇在中壓區(qū)，這樣既能保證有較高的膜通量，又可以預(yù)防凝膠層形成，以免過濾總阻力過高。

綜合以上因素考慮，選定超濾膜壓力為0.75MPa，納濾膜為1.95MPa。

2.2.5 料液pH對膜通量的影響

在用膜分離寡糖中，料液中蛋白質(zhì)、酶會被吸附在膜上，降低膜通量，甚至形成凝膠層，造成膜污染，在不影響寡糖提取率的條件下，將pH值調(diào)至遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，可以減少膜污染。相同體積4L，相同初始濃度（多糖和寡糖）0.0219mg/ml的溶液，分別調(diào)pH為3、5、7、9、11，膜通量和寡糖含量的結(jié)果如表5。

料液中蛋白質(zhì)、酶等含量很低，如表5所示，pH的改變對膜通量影響不顯著，pH過低或者過高，不僅會對膜造成一定程度腐蝕而且可能改變寡糖性質(zhì)，對比寡糖濃度，最終確定料液pH為7。

2.2.6 浸提次數(shù)的確定

在上述試驗的基礎(chǔ)上，選用提取溫度50℃、提取時間10min、料液比為1：24的條件下，浸提次數(shù)對糖提取率的影響結(jié)果：

抽提一次，香菇寡糖提取率為0.44%，抽提兩次，提取率為0.64%，抽提三次時，香菇寡糖提取最多為0.84%，但是在實(shí)驗過程中，殘渣越來越難過濾，第三次抽濾時間甚至超過第一次和第二次抽濾時間之和，能耗過大，因此確定提取次數(shù)為2次。

2.2.7 醇抽提方法的確定

寡糖不溶于醇等有機(jī)溶劑，水提醇沉法是常見的提取方法，試驗設(shè)備簡單，操作容易，但耗時長、提取過程醇使用量大，所以為了降低成本，適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，研究不同的醇抽提方法有重要意義。實(shí)驗結(jié)果如表6。

表6可知，乙醇抽提法可以得到品質(zhì)好、含量高的寡糖，因此確認(rèn)工藝的醇提方法為95%乙醇抽提。

3 小結(jié)

①水提-膜過濾-醇沉工藝提取香菇中寡糖的主要影響因素是料液比、浸提時間和浸提溫度。②香菇寡糖的最佳提取工藝參數(shù)是：溫度為60℃，料液比為1：16（g/mL），浸提時間為10min。超濾膜操作壓力為0.75MPa，納濾膜操作壓力1.95MPa，料液pH為7。③將香菇粉按優(yōu)化出的最佳條件提取2次，經(jīng)卷式膜過濾和95%乙醇醇沉，最終寡糖的提取率為1.07%。

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