基于穿刺活檢的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者源性異種移植模型的建立

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院介入科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

基于穿刺活檢的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者源性異種移植模型的建立

馬 晗，王 英，王廣志，許立超，何新紅，李文濤

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院介入科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：現(xiàn)行的結(jié)直腸癌患者源性異種移植(patient-derived xenografts，PDXs)模型建模樣本多來源于外科手術(shù)，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)患者手術(shù)機會少，難以獲取標(biāo)本。該研究旨在利用穿刺活檢術(shù)建立mCRC的PDXs模型。方法：入組12例結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者，存在臨床癥狀和(或)影像學(xué)提示術(shù)后復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移，需行穿刺活檢明確診斷、且不存在穿刺活檢禁忌證者，保留用于常規(guī)病理診斷包括基因檢測的組織量后，剩余的標(biāo)本用于PDXs模型的建立。結(jié)果：共成功建立7例mCRC的PDXs模型，成功率為77.8%。結(jié)論：基于穿刺活檢術(shù)建立mCRC的PDXs模型成功率高，可較完整的復(fù)制原始腫瘤特性，且操作安全、簡便。

穿刺活檢術(shù)；復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌；患者源性異種移植模型

患者源性異種移植(patient-derived xenografts，PDXs)模型是將患者的腫瘤接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)用于制作模型，作為腫瘤研究的有效工具。目前國際上已經(jīng)建立了多個瘤種的PDXs模型，包括胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌和乳腺癌等［1］。其中，PDXs肺癌模型在克服表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)或漸變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)酪氨酸激酶抑制劑耐藥的研究中已獲得較大突破［2］。以往結(jié)直腸癌的PDXs模型建立方法比較成熟，成功率達(dá)60%以上，很大程度上由于建模標(biāo)本主要來源于外科手術(shù)切除［1］，可以獲得足夠的組織量，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)患者手術(shù)機會少，難以獲取標(biāo)本。本研究采用穿刺活檢手段獲取腫瘤組織標(biāo)本來建立mCRC的PDXs模型，探索安全簡便、成功率高的建模方法，為mCRC的治療研究提供良好的模型。

1 材料和方法

1.1 患者入組

結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者，存在臨床癥狀和(或)影像學(xué)提示術(shù)后復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移，需行穿刺活檢明確診斷、且不存在穿刺活檢禁忌證者，保留用于常規(guī)病理診斷包括基因檢測的組織量后，剩余的標(biāo)本用于PDXs模型的建立。入組12例患者，簽署受試者知情同意書，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批通過。

收集患者臨床資料，包括年齡、性別、TNM分期、家族史、實驗室檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果、病理學(xué)檢查結(jié)果(包括基因突變情況)、治療資料(用藥方案、不良反應(yīng)和治療效果等)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況(出現(xiàn)時間、臨床癥狀、部位和病灶大小)，建立患者資料表。

1.2 實驗動物

雌性BABL/c裸鼠12只，6周齡，體質(zhì)量20 g左右，均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于華中師范大學(xué)腦功能研究所無特定病原體(specific pathogen free，SPF)動物房。

1.3 取材方法

以CT引導(dǎo)下套管針穿刺活檢取材獲取結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本，最后1次取材后采用明膠海綿封堵穿刺針道，防止出血及針道種植轉(zhuǎn)移。除去臨床診斷所需，剩余組織置于含有0.9%氯化鈉溶液的無菌培養(yǎng)皿中，儲存于4 ℃恒溫冰箱中，并在6 h內(nèi)運輸至華中師范大學(xué)腦功能研究所SPF動物房以供接種。運輸中腫瘤樣本置于凍存盒中，以保證腫瘤樣本的活性。

1.4 種植方法

固定裸鼠，暴露腹側(cè)，以75%乙醇浸泡的棉球消毒腹側(cè)皮膚穿刺點，同軸套管針針芯拔出少許，無菌鑷夾取取材組織裝入套管針鞘，兩指捏起裸鼠腹側(cè)皮膚，將裝有取材組織的同軸套管針插入裸鼠皮下，針尖推至腋下血供豐富處，輕推針芯將組織塊推入裸鼠皮下，輕輕退出穿刺針，消毒穿刺點，以針管輕碾接種部位皮膚，保證接種組織集中于接種部位。每3 d觀測1次腫瘤生長情況，如果超過90 d裸鼠接種部位仍無移植瘤生長跡象即判定為失敗。當(dāng)原代模型(F0代)建立成功，移植瘤可在鼠間連續(xù)傳代則被視為建模成功。

1.5 腫瘤傳代

腫瘤成功移植后待F0代裸鼠腫瘤體積達(dá)到

500 mm3，頸椎脫臼法處死裸鼠，取出腫瘤組織，留取1/5腫瘤組織凍存，1/10組織送檢確定基因突變類型，1/10組織10%的甲醛溶液固定、石蠟薄層切片，H-E染色后于光鏡下觀察。其余均分5份傳代至F1代裸鼠。F1代模型成熟后傳代15～20只裸鼠(F2代)。當(dāng)F2代裸鼠腫瘤體積達(dá)到200 mm3后可行藥物試驗。記錄原代模型成瘤率、各代實驗動物生長情況及腫瘤生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 穿刺活檢術(shù)

共取12例患者穿刺活檢樣本，穿刺活檢術(shù)后患者均未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥(表1)。

2.2 模型的建立

12例患者中，3例患者穿刺標(biāo)本與預(yù)期病理結(jié)果不符(1例傾向間葉性腫瘤，1例傾向惡性淋巴瘤，1例未見惡性證據(jù))。共成功建立7例結(jié)直腸癌PDXs模型，成功率為77.8%。7例模型均成功傳代(圖1)。接種成功的裸鼠可于15～30 d內(nèi)于接種部位觸及結(jié)節(jié)，黃豆大小，表面光滑，質(zhì)硬，活動度差。3個月左右腫瘤體積可達(dá)到傳代要求，直徑0.7～1.0 cm。

2.3 模型傳代

腫瘤傳代后生長速度明顯高于上一代并隨著傳代次數(shù)呈遞增趨勢(圖2)，由此可見，異種移植腫瘤可在鼠間傳代過程中逐漸適應(yīng)裸鼠體內(nèi)環(huán)境，可能與原始腫瘤中的基質(zhì)細(xì)胞隨著模型鼠間傳代而逐漸被小鼠體內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞所取代有關(guān)，后期將進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

表 1 入組患者一般資料Tab. 1 Clinical characteristics of patients

圖 1 基于穿刺活檢術(shù)成功建立的mCRC的PDX模型Fig. 1 The mCRC PDXs established by image-guided biopsy

圖 2 同一腫瘤的PDXs模型F1代和F2代生長曲線Fig. 2 The tumors growth curve of F1 generation PDXs and F2 generation PDXs derived from the same primary tumor

2.4 腫瘤樣本生長情況

BRAF基因野生型腫瘤樣本生長較快，生長不均勻，傳代時可見瘤塊內(nèi)壞死組織偏多，質(zhì)地疏松；而BRAF突變型腫瘤樣本生長較慢，但長勢穩(wěn)定，尤其初代模型，其原代與傳代模型瘤塊較均勻，傳代時可見其大部分為魚肉樣致密組織，壞死組織少(圖3、4)。

圖 3 BRAF突變型和BRAF野生型mCRC腫瘤樣本Fig. 3 The tumor specimens of BRAF mutant mCRC and BRAF wild mCRC

圖 4 BRAF突變型結(jié)直腸轉(zhuǎn)移癌與BRAF野生型結(jié)直腸轉(zhuǎn)移癌F1代PDX模型生長曲線Fig. 4 The F1 generation tumor growth curve of BRAF mutant mCRC and BRAF wild mCRC

3 討 論

精準(zhǔn)癌癥醫(yī)療是利用最先進(jìn)技術(shù)研究癌癥與患者的特征，然后設(shè)計患者特異性治療方案以便精準(zhǔn)的靶向定位疾病的遺傳變異靶點。很多臨床實驗，如針對非小細(xì)胞肺癌的BATTLE實驗［3］，均證明了該策略的應(yīng)用價值。然而，最近的數(shù)據(jù)表明，該方法施行過程中出現(xiàn)約10%的低響應(yīng)率［4］，那些攜帶腫瘤驅(qū)動突變基因如EGFR突變基因型的患者即使接受對癥治療方案，其總生存期獲益仍然很低［5］。在美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的靶向治療方法中，響應(yīng)率波動范圍較大。人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)過表達(dá)或基因擴增的乳腺癌對曲妥單抗的響應(yīng)率約為30%［6］，攜帶BRAF基因突變的黑色素瘤對維羅非尼的響應(yīng)率為60%［7］。此外，大部分響應(yīng)靶向治療的癌癥，最終都會產(chǎn)生耐藥性［7］。耐藥腫瘤樣本組織切片可用于研究繼發(fā)性耐藥的機制。然而，缺乏耐藥患者腫瘤組織標(biāo)本則阻礙了這個關(guān)鍵問題的研究。

PDXs模型的建立有望解決精準(zhǔn)醫(yī)療中所遇到的問題。該模型是基于未經(jīng)篩選和未經(jīng)培養(yǎng)的患者腫瘤標(biāo)本所建立的，擁有與患者相同的遺傳背景和組織形態(tài)學(xué)特征。已有研究證實，PDXs具有相對穩(wěn)定的基因組。因此，基于PDXs施行的療效研究可更真實的反映腫瘤患者的藥物反應(yīng)，有研究證實，患者和PDXs的反應(yīng)有極高的一致性［8］。

PDXs另一個顯著的特征是可基于一個患者發(fā)展出許多相同的PDXs，可為靶向治療和化療的篩選提供便利，不論單一藥物或藥物組合，均可篩選出最有效的藥物。就精準(zhǔn)醫(yī)療來說，主要問題是一個患者的腫瘤有多個潛在的靶點［9］，然而大多數(shù)這些遺傳變異并不是癌癥細(xì)胞功能的關(guān)鍵驅(qū)動點。臨床上由于預(yù)期壽命和毒性的限制，僅允許有限的幾個不同藥物在患者身上嘗試。因此，在最初的幾次嘗試中選擇最有效的治療方法在癌癥治療中至關(guān)重要。PDXs可將相同的腫瘤復(fù)制到大量的小鼠體內(nèi)，為測試治療靶點的潛在效能提供模型，不論是單藥還是藥物組合，均可同時進(jìn)行。PDXs模型可用于判斷腫瘤對化療藥的敏感性，并篩選出哪些藥是有效的。此外，實驗過程中或腫瘤復(fù)發(fā)時均可獲得一系列的活檢樣本用于研究繼發(fā)性耐藥的機制，這一點在臨床研究實體腫瘤患者時是很難實現(xiàn)的。

PDXs在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方面具備其他幾種模型所不具備的獨特優(yōu)勢，如癌細(xì)胞株移植瘤模型和基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse，GEMM)。癌細(xì)胞株在體外經(jīng)過長時間的培養(yǎng)，積累了許多不同于原發(fā)腫瘤的額外遺傳變異。已有研究證實，即使傳代次數(shù)不多，原發(fā)腫瘤和來自該腫瘤的細(xì)胞系之間也存在著極大地不可逆的基因分化［10］。因此，基于細(xì)胞株基因背景建立的藥物反應(yīng)預(yù)測模型經(jīng)常無法預(yù)測臨床藥物的藥效［11］。而基因工程小鼠模型利用種系轉(zhuǎn)基因、基因敲除或突變，以及更復(fù)雜的時空基因表達(dá)調(diào)控等多種技術(shù)修改小鼠的基因表達(dá)［12］。腫瘤通常在數(shù)月至2年內(nèi)在小鼠體內(nèi)發(fā)展成熟。盡管GEMM表現(xiàn)出人類腫瘤的某些發(fā)展特征，然而GEMM小鼠體內(nèi)的腫瘤具有較高的基因同質(zhì)性。而許多人類腫瘤基因暴露在吸煙和環(huán)境致癌物中多年，產(chǎn)生了多種多樣的基因變異。因此，基于GEMM實施的臨床前實驗無法滿足針對特定靶點的患者特異性治療方案的研究需求。

但PDXs也有許多缺點不能忽視［2］，尤其是基于PDXs得出實驗結(jié)論時需慎重：① 并不是所有的腫瘤都可以建立異種移植模型，因此PDXs無法代表患者群體特征；② 通常需要4～5個月建立原代PDXs，但傳代后PDXs僅需2～5周便可發(fā)展成熟。這一缺陷使PDXs更多應(yīng)用于實驗研究而不是臨床工作中，尤其在那些疾病進(jìn)展快、患者生存期短的腫瘤中，如非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌［13-14］。但在疾病進(jìn)展相對較慢的腫瘤中，基于PDXs所得出的臨床前實驗使研究結(jié)果可以轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，如結(jié)直腸癌和前列腺癌。此外，原始腫瘤的基質(zhì)成分在傳代過程中會被小鼠基質(zhì)所替換和免疫缺陷受體小鼠不具備免疫應(yīng)答功能也是PDXs的主要缺點。

經(jīng)過不斷的發(fā)展，PDXs將來或許可用于臨床，如多種藥物同時選擇最有效的藥物或藥物組合治療的篩選，揭示原發(fā)耐藥機制，在臨床決策中為患者選擇生物標(biāo)志物。這些都將有助于將分子靶向治療轉(zhuǎn)化為腫瘤精準(zhǔn)治療［15］。

PDXs常用制作方法是將手術(shù)標(biāo)本或活檢樣本裁剪后直接接種至受體小鼠體內(nèi)，通過免疫缺陷小鼠間傳代來保持模型長期可用。同時，最好留取一部分原始腫瘤或初代模型腫瘤組織凍存以便隨時取用。種植成功率與所需時間主要取決于小鼠品系、腫瘤侵襲程度和種植部位。常見接種部位有原位接種、皮下接種和腎包膜下接種。但原位種植不便觀測腫瘤的發(fā)展與變化，腎包膜下接種技術(shù)難度大，而皮下接種易于種植且便于觀測，因此，本研究選擇通過皮下接種的方式建立mCRC的PDXs模型。

mCRC較原發(fā)灶具有更高的侵襲性和異質(zhì)性，其主要治療方式是輔助性化療聯(lián)合分子靶向治療，大部分患者不具備外科手術(shù)切除的條件。由于這些患者在原發(fā)灶術(shù)后均接受過一定程度的化療，因此對既有的化療方案有一定的耐藥性。而分子靶向治療費用高昂且響應(yīng)率低［16］。同時，由于個體間差異，無論是化療藥物還是靶向藥對患者的療效都不盡相同，因此，mCRC患者的生存期望較低［17］。

在以往的研究中，由于取材困難，mCRC的PDXs模型難以成型，無法為臨床和基礎(chǔ)研究提供良好的模型和充足的腫瘤樣本。影像引導(dǎo)下的穿刺活檢不失為一種良好的方法，其適應(yīng)證廣泛，手術(shù)風(fēng)險低。即解決了取材的困難，還極大的降低了患者承受的風(fēng)險和傷害。同時，mCRC的高侵襲性保證了建模的成功率。

總之，本研究成功建立mCRC的PDXs模型，并且可基于該模型進(jìn)行一系列有效藥物和藥物組合的篩查，研究耐藥機制。利用該模型可能會加速新藥物的發(fā)現(xiàn)，指導(dǎo)mCRC治療方案的改進(jìn)。

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Establishment of metastatic colorectal cancer patient-derived xenografts models by image-guided biopsy

MA Han, WANG Ying, WANG Guangzhi, XU Lichao, HE Xinhong, LI Wentao (Department of Interventional Radiology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

LI Wentao E-mail: liwentao98@126.com

Background and purpose:Current colorectal cancer patient-derived xenografts (PDXs) models were established by samples taken during surgery. However, metastatic colorectal cancer (mCRC) patients have less surgical opportunities, and it was difficult to obtain enough tumor fragment. The aim of the present study was to establish mCRC PDXs by image-guided biopsy.Methods:A total of 12 patients with colorectal cancer who underwent surgery were included. All patients had recurrent lesions or metastatic lesions needed to be histologically confirmed, and none of them had contraindication to biopsy. Tumor tissues not required for clinical diagnosis were used to establish mCRC PDXs.Results:Seven PDXs grew sufficiently for transfer into mice. The success rate was 77.8%.Conclusion:The PDXs established by image-guided biopsy had the advantage of convenient operation, good reproducibility, high achievement ratio, short experimental periodicity and reliably retain specific genetic and morphological features of the primary patient tumors.

Biopsy; Metastatic colorectal cancer; Patient-derived xenografts models

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.04.006

R735.3

A

1007-3639(2017)04-0276-05

2016-09-13

2016-12-07）

國家重點研發(fā)計劃(2016YFC0106203)；上海市科委實驗動物專項(14140902202)；上海市申康新興前沿技術(shù)項目(SHDC12014112)；上?？莆匀豢茖W(xué)基金(14ZR1407900)。

李文濤 E-mail: liwentao98@126.com