安寐湯對失眠大鼠腦組織多巴胺含量的影響

刁遠明，陳 群

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006

失眠是睡眠障礙性疾病中最常見的癥狀，屬中醫(yī)“不寐”范疇，在臨床上極為常見，指經(jīng)常不能獲得正常的睡眠，輕者入眠困難，或眠而不安酣，時寐時醒，醒后不能再入睡，嚴重者可整夜不眠，可反復(fù)數(shù)年不愈，給患者的身心健康帶來了嚴重影響[1]。安寐湯為廣州中醫(yī)藥大學(xué)陳群教授多年臨床實踐總結(jié)的經(jīng)驗方，具有寧神安寐、誘導(dǎo)睡眠的作用，臨床應(yīng)用效果顯著。運用安寐湯治療失眠患者126例結(jié)果顯示總有效率為91.27%[2]。本文通過庫侖陣列電化學(xué)高效液相色譜法檢測安寐湯對失眠大鼠腦組織內(nèi)單胺類中樞神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）含量的影響，探討其寧神安寐，誘導(dǎo)睡眠的作用機制，為安寐湯進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0020。正常光照，自由飲水、攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，稱重，隨機化分為正常組、模型組、安寐湯低劑量組、安寐湯中劑量組、安寐湯高劑量組、安定對照組，每組12只，雌雄各半。

1.1.2 實驗儀器與試劑

1.1.2.1 儀器 ESA 5600A庫侖陣列電化學(xué)高效液相色譜儀（美國ESA公司），Coularray Win工作站，Heraeus Thurmo D-37520型高速冷凍離心機（德國Heraeus公司），Dionex Tcc-100型柱溫箱（美國戴安公司），pHS-25型pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），GenPure超純水系統(tǒng)（德國TKA公司），BP211D電子天平（德國Sartorious），3K超濾管（PALL公司）。

1.1.2.2 試劑 DA標準品（批號：100076-200405）為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；對氯苯丙氨酸（PCPA）為sigma公司產(chǎn)品，批號：C6506；安定由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供；乙腈為色譜純（德國默克公司）；實驗用其他試劑均為分析純。

1.1.3 藥物制備及給藥方法

1.1.3.1 藥物制備 安寐湯組成分：夜交藤、酸棗仁、生龍骨、珍珠母、五味子、白芍、生地等。實驗所用中藥飲片均購自廣州市藥材公司，經(jīng)驗證為正品。安寐湯組成藥物中的生龍骨、珍珠母先煎1 h，再與方中其他藥物一起煎煮2次，10倍量水，每次1 h，過濾，合并濾液，水浴濃縮成1∶1藥液，置冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩０捕ㄆ兴榕涑上鄳?yīng)濃度的混懸液備用。

1.1.3.2 給藥方法 除正常組大鼠外，其余各組大鼠腹腔注射對氯苯丙氨酸（PCPA）300 mg/kg，臨用前用弱堿性生理鹽水配置成混懸液，連續(xù)注射2 d。造模同時開始灌胃，各受試藥物的灌胃劑量以人體推薦量為依據(jù)，灌胃量為1 ml/100 g，每日1次。以等效劑量為中劑量，低劑量為等效劑量的1/2，高劑量為等效劑量的2倍給藥，正常組、模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。

1.2 方法

1.2.1 檢測樣品制備

方法[3-6]，實驗大鼠連續(xù)給藥10 d后，禁食12 h，斷頭處死動物，在冰臺上迅速分離出大腦組織，將標本稱質(zhì)量后，錫紙包好，保存于-80℃冰箱中。稱取腦組織0.3 g，加入1 ml 0.1 mol/L高氯酸溶液冰浴勻漿，用渦旋器混勻，4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速15 000 r/min，取上清液置于3 K超濾管中4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，取超濾后上清液檢測。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為 Luna C18色譜柱（Phenomenex，4.6 mm×150 mm，5 μm），Alltech C18預(yù)柱（Alltima，7.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為緩沖液（每升水含EDTA 37.2 g，NaH2PO431.2 g，辛烷磺酸鈉 1 g，pH=4.0）∶乙腈=87∶13；流速為 1.0 ml/min；檢測電壓為350 mV；柱溫為 35℃；自動進樣器溫度為 4℃；進樣量 15.0 μl。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

含量計算公式：含量（μg/g濕組織）=CV/W，式中C為大鼠腦組織樣品測得的濃度（μg/ml），V為樣品預(yù)處理過程中加入液體體積總量（ml），W為腦組織濕重（g）。統(tǒng)計采用SPSS 12.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，總體比較采用方差分析，組間比較采用方差分析LSD進行兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組DA含量結(jié)果見表1。大鼠第一次腹腔注射PCPA造模后28～30 h開始出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天也活動不停，煩躁不安，易激惹和攻擊性增強等表現(xiàn)，表明失眠大鼠造模成功。腦組織DA含量檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中DA含量與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。安寐湯高、中劑量組大鼠腦組織中DA含量與模型組相比顯著降低（P＜0.05），安寐湯低劑量組大鼠腦組織中DA含量與模型組相比有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。安定對照組大鼠腦內(nèi)DA含量與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各實驗組大鼠腦內(nèi)DA含量

3 討論

失眠， 中醫(yī)又稱為 “不寐”、“不得眠”、“不得臥”、“目不瞑”等，是以經(jīng)常不能獲得正常睡眠為特征的一類病癥。目前，影響人們身心健康、生活質(zhì)量和工作效率的第一問題是失眠，預(yù)計到2020年全球有大約超過7億失眠者。

安寐湯方中生龍骨、珍珠母含鈣、鐵、鈉、鉀等微量元素，可抑制神經(jīng)與骨骼肌興奮，作用于快波睡眠期，對失眠伴有多夢、驚悸、遺精、盜汗效果較好。五味子含五味子素、五仁醇，與白芍均對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制、鎮(zhèn)靜作用。夜交藤藥性平和，功擅引陽入陰，據(jù)現(xiàn)代藥理研究[7]，在諸多安神藥中，以夜交藤誘導(dǎo)睡眠、縮短入睡潛伏期的作用最好，并有明顯的安定作用，可用于各類失眠。酸棗仁對實驗動物和人均有顯著而溫和的催眠、鎮(zhèn)靜、安定效果，為治療虛煩不得眠的要藥。酸棗仁與夜交藤兩藥，為無論古代醫(yī)家還是現(xiàn)代中醫(yī)治療失眠使用最多的藥物，也是安寐湯的君藥。

安寐湯以化石、介殼類安神藥生龍骨、珍珠母潛陽入陰、重鎮(zhèn)安神；以植物類安神藥夜交藤、酸棗仁、五味子、白芍、生地黃養(yǎng)心安神，誘導(dǎo)睡眠，辨證加減用于治療不寐癥，取得了較好的臨床療效。該方藥味精煉，組方巧妙合理，治標當(dāng)中兼顧治本?，F(xiàn)代藥理及臨床實驗研究結(jié)果也顯示，本類藥物可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，起鎮(zhèn)靜、催眠作用，或改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，且無毒副作用、耐藥性和藥物依賴性，是治療失眠具有開發(fā)前景的理想藥物。

研究表明，睡眠發(fā)生不僅是生物體對環(huán)境變化的被動反應(yīng)，更是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的一個主動過程，當(dāng)與睡眠-覺醒機制相關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生改變時，機體會表現(xiàn)出明顯的睡眠障礙。有實驗報道，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）存在大量的多巴胺神經(jīng)元，其纖維投射到紋狀體、邊緣系統(tǒng)、大腦皮質(zhì)外，還與視前區(qū)、藍斑、中縫核等與睡眠一覺醒有關(guān)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)有著廣泛的聯(lián)系，當(dāng)腦內(nèi)DA濃度增高時，腦電出現(xiàn)低幅快波，即興奮的表現(xiàn)[8]。

安寐湯是臨床行之有效的治療失眠的方劑，作者前期研究中也證實安寐湯高中低劑量組均有顯著的促睡眠作用，能顯著提高小鼠入睡率，縮短入睡時間，延長睡眠時間，但其作用機制尚不明確。從本研究來看，大鼠注射PCPA造模后腦內(nèi)DA含量顯著升高，與文獻[8]報道一致，經(jīng)灌胃給藥10 d后，安寐湯中、高劑量組用藥后DA含量顯著下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。安寐湯低劑量組用藥后DA含量與模型組比較有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與其劑量較低未能明顯起效有關(guān)。安定對照組大鼠腦內(nèi)DA含量與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明安定鎮(zhèn)靜催眠作用的發(fā)揮主要不是通過DA含量變化起作用的。DA在腦內(nèi)主要起興奮作用，對睡眠具抑制作用，安寐湯中、高劑量組可使失眠大鼠腦內(nèi)升高的DA含量降低，從而使大腦興奮性降低，由此認為安寐湯促睡眠機制與其可以調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)DA的含量密切相關(guān)，其促睡眠機制是否與其他中樞神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)系有待進一步深入研究。

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