基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法*

程祖樂， 王 琨， 毛紅菊， 夏文薇， 金慶輝， 趙建龍

(1.中國科學(xué)院 上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 傳感技術(shù)聯(lián)合國家重點實驗室，上海 200050；2.中國科學(xué)院 研究生院，北京 100039;3.上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法*

程祖樂1,2， 王 琨1,2， 毛紅菊1， 夏文薇3， 金慶輝1， 趙建龍1

(1.中國科學(xué)院 上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 傳感技術(shù)聯(lián)合國家重點實驗室，上海 200050；2.中國科學(xué)院 研究生院，北京 100039;3.上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

BEAMing是一種基于磁珠表面核酸擴增的乳滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，具有很高的靈敏度, 然而后續(xù)檢測目標(biāo)磁珠比較困難。通過修飾鏈霉親和素的聚苯乙烯微球捕獲BEAMing實驗中生物素修飾的目標(biāo)磁珠并利用微柱陣列芯片攔截微球,可以達到統(tǒng)計磁珠的目的。微柱陣列芯片采用基于尺寸差異的攔截原理。該芯片組裝簡單成本低，降低了BEAMing技術(shù)的磁珠統(tǒng)計難度。利用該方法對不同濃度的特定DNA序列做了檢測，驗證了該方法的實用性。

微柱陣列芯片； 乳滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)； 微球； 生物傳感器

0 引 言

BEAMing(beads,emulsion,amplification,and magnetics)是一種基于磁珠固相擴增的乳滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)[1],由于擴增磁珠與靶標(biāo)分子個數(shù)存在對應(yīng)關(guān)系，通過檢測擴增磁珠即可得到靶標(biāo)分子的拷貝數(shù)[2]。傳統(tǒng)的BEAMing實驗磁珠計數(shù)困難且成本高[1～3]。

本文在先前實驗室微球過濾方法[4]的基礎(chǔ)上提出了一種基于微球和微柱陣列芯片傳感器[5,6]的BEAMing核酸檢測方法，該方法在保證了BEAMing檢測靈敏度的同時提高了檢測效率，降低了檢測難度。

1 實驗方法

1.1 BEAMing實驗

實驗引物序列如表1所示。將10 μL SA修飾磁珠Dynabeads M—270(美國Invitrogen公司)與1 μL 100 mmol/L 引物1在結(jié)合緩沖液(5 mmol/L pH 7.5三羥甲基氨基甲烷—氯化氫(Tris—HCl),0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),1 mol/L NaCl)中室溫孵育15 min。利用磁場富集磁珠并用重懸液(20 mmol/L pH 8.4 Tris—HCl,50 mmol/L KCl)清洗3次，用10 μL重懸液重懸。油乳混合液由質(zhì)量濃度7 %ABIL WE09(德國Evonik Degussa公司)，體積分?jǐn)?shù)20 %的礦物油(美國Sigma公司)和體積分?jǐn)?shù)73 %的Tegosoft DEC(德國Evonik Degussa公司)組成。反應(yīng)預(yù)混液成分如表2所示。在一個1.5 mL離心管中加入一顆5 mm鋼珠，200 μL油乳混合液和40 μL反應(yīng)預(yù)混液，放入全自動多樣品組織研磨儀(Tissuelyser—24，上海凈信科技公司)中33Hz頻率振蕩20s形成油包水乳液。轉(zhuǎn)移乳液至500 μL PCR反應(yīng)管中，在標(biāo)準(zhǔn)PCR儀(日本Takara公司)中擴增，反應(yīng)條件包括：94 ℃/2 min熱啟動激活,98 ℃/15 s變性,60 ℃/45 s退火,72 ℃/75 s延伸,共45個從變性到延伸循環(huán)。擴增完成之后，收集乳液至1.5 mL離心管中，加入600 μL破乳緩沖液(10 mmol/L Tris—HCl (pH 7.5),1 % 氚核Triton—X 100,1 % SDS,100 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA)，振蕩后放入離心機(德國Eppendof公司)中,3 200gn下，離心3 min，吸去上層油相之后，重復(fù)以上步驟1次。富集磁珠，移除上清后加入40 μL結(jié)合緩沖液重懸。

表1 引物序列

表2 預(yù)混液成分

1.2 微柱陣列芯片的制作

如圖1所示，將硅片置于煮沸的清洗液(H2SO4∶H2O2=10∶1)中浸泡10 min。取出硅片，放入去離子水清洗腔中噴淋甩干。將LC100A正膠旋涂在清洗后的硅片上，旋涂厚度為3 μm。涂完后前烘，利用曝光顯影工藝，將掩膜版上的圖案轉(zhuǎn)移到光刻膠上，暴露出硅片上被刻蝕的部分。利用深反應(yīng)離子刻蝕(DRIE)在硅片上刻蝕出一系列微井陣列，微井大小為130 μm×30 μm，微井間距隨著行數(shù)減小，變化范圍為50～6 μm，微井陣列為0.8 μm×0.8 cm,刻蝕深度為30 μm，用等離子去膠工藝去除殘膠。對制作好硅片模具硅烷化，然后取聚二甲基硅氧烷(PDMS)預(yù)聚體：固化劑為10∶1配制PDMS。將配制好的PDMS澆筑在硅片模具上，靜置1～2 h，90 ℃加熱1 h。待PDMS完全固化后剝離，微井陣列轉(zhuǎn)化為微柱陣列，然后用藍膜包覆，手動切割打孔。最后將載玻片與芯片通過等離子體鍵合。至此芯片組裝完成[7]。

圖1 硅片模具的制作流程

1.3 檢測流程

取1 μL SA聚苯乙烯微球(約5 000個)，用結(jié)合緩沖液稀釋至10 μL，每次1 μL分5次逐步加入到制備好的40 μL磁珠懸濁液中充分吹打，室溫孵育30 min，隨后 6 000 r/min,離心5 min，吸去上清液。加入40 μL PBST溶液(pH 7.4 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)溶液，0.01 %失水山梨醇聚氧乙烯醚酯(Tween 20)重懸，吹打混勻。富集磁珠，吸去上清液。重復(fù)3次清洗步驟后，用40 μL PBST溶液重懸。

微柱陣列芯片采取負(fù)壓進樣，用進樣儀將200 μL PBST溶液通入到裝置中，以10 mL/h的速率沖洗。取20 μL微球和磁珠重懸液，用PBST溶液將其重懸至100 μL，以5 mL/h的速率通入到裝置中。進樣完成后，用200 μL PBST沖洗2次。

2 結(jié)果討論

2.1 檢測原理

BEAMing實驗中加入磁珠數(shù)遠大于靶標(biāo)分子數(shù)，滿足單個磁珠與靶標(biāo)分子共存在一個液腔中的泊松分布條件。引物2參與靶標(biāo)分子的擴增使目標(biāo)磁珠帶上生物素,引物3提高了磁珠表面擴增效率[2]。SA修飾微球捕獲目標(biāo)磁珠形成復(fù)合物并在磁場下富集，游離微球則隨著上清液一起吸除。微球磁珠復(fù)合物會因尺寸大而被截留在微柱陣列通道內(nèi)，游離的磁珠則流出芯片。每個微球飽和結(jié)合磁珠數(shù)量約為20個，通過統(tǒng)計截留的微球，即可知道目標(biāo)核酸大致個數(shù)。

2.2 乳液的熱穩(wěn)定性與試劑配比

為了驗證乳滴熱穩(wěn)定性，分別在熱循環(huán)前后吸取0.5 μL乳液在倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)400倍下觀察，乳滴狀態(tài)沒有發(fā)生變化。為了保證大于80 %的液滴最多只能包含一個磁珠，根據(jù)泊松分布，反應(yīng)中加入的磁珠數(shù)最多應(yīng)為乳滴的80 %。按照乳滴直徑為10～15 μm的標(biāo)準(zhǔn)，40 μL的預(yù)混液可以打出3×106～1×107個乳滴，每毫升磁珠懸濁液含有(6～7)×108個磁珠，據(jù)此計算，應(yīng)加入的磁珠量為5～8 μL。本文選取了6 μL作為加入量，結(jié)果如圖2所示。磁珠較為均勻地分散在乳滴中，且大部分乳滴只含有一個磁珠。

圖2 微乳滴與磁珠分布示意圖

2.3 定量結(jié)果分析

實驗采用分步加入微球的方法保證SA微球能與目標(biāo)磁珠充分結(jié)合，每一步加入的微球數(shù)量約在500個左右，其具體加入的數(shù)量亦可調(diào)整。孵育之后，利用磁鐵聚集磁珠，吸取上清液放置在顯微鏡下觀察，上清液中的微球如圖3(a)所示，圖3(b)顯示的是磁珠微球復(fù)合物的形貌。

為了驗證該方法可行性，選取一段長度為66 bp的cDNA片段作為檢測標(biāo)的。將含有該序列的cDNA溶液按2倍梯度稀釋之后分別對這3個溶液樣本進行了檢測，圖4為芯片中截取部分微球攔截結(jié)果。3張芯片分別截取到287，148，85個微球，轉(zhuǎn)化為核酸拷貝數(shù)約為5 740，2 960，1 700個拷貝，而空白對照試驗無微球截獲。該結(jié)果與稀釋倍數(shù)相對照呈現(xiàn)了較好的線性關(guān)系，表明本方法具有可行性。

圖3 上清液和沉淀中微球形態(tài)

圖4 不同模板濃度溶液樣本的芯片攔截結(jié)果

3 結(jié)束語

本文根據(jù)BEAMing技術(shù)和微流控芯片技術(shù)設(shè)計了一種核酸檢測方法，其特點包括：1)計數(shù)簡單，只要統(tǒng)計微球

數(shù)便可知道整個溶液中磁珠數(shù)量的大致范圍；2)BEAMing具有乳滴數(shù)字PCR的特點，可以很容易達到幾十萬級甚至百萬級的反應(yīng)腔數(shù)，同時又不增加實驗操作難度；3)根據(jù)檢測要求和通量的不同，下一步還可以增加微柱數(shù)和芯片面積，改變微球直徑大小參數(shù)等，并且可以對微球進行不同基團修飾，做到多重檢測。綜上，本文提出的核酸檢測方法，檢測成本低，制備操作簡單，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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[3] Boulanger J,Muresan L,Tiemann-Boege I.Massively parallel haplotyping on microscopic beads for the high-throughput phase ana-lysis of single molecules[J].Summaries of Technical Papers of Annual Meeting Architectural Institute of Japan，D：Environmental Engineering,2012,7(4):292-294.

[4] 范曉云,賈春平,李 剛,等.一種用于循環(huán)腫瘤細胞檢測的生物傳感器芯片[J].傳感器與微系統(tǒng),2015,34(11):119-121.

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程祖樂(1990 -)，男，碩士研究生，主要研究方向為微流控技術(shù)在核酸檢測中的應(yīng)用。

毛紅菊,通訊作者，E—mail：hjmao@mail.sim.ac.cn。

Emulsion digital PCR quantitative method based on microbeads and micropillar array chip*

CHENG Zu-le1,2， WANG Kun1,2， MAO Hong-ju1， XIA Wen-wei3， JIN Qing-hui1， ZHAO Jian-long1

(1.State Key Laboratory of Transducer Technology,Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200050,China;2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100039,China;3.Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200011,China )

BEAMing is an emulsion digital polymerase chain reaction(PCR)technology with high sensitivity.However,the available beads detecting method is complex,which limits its' applications.Through counting the streptavidin modified polystyrene latex microspheres which have fully captured the target magnetic beads,the number of target magnetic beads can be calculated easily.The microsphere trapping mechanism is based on the difference of microsphere diameter and micropillars intervals.The fabrication of this chip is simple and low-cost.This chip-and-beads-based method reduces difficulty of magnetic beads counting in BEAMing.Feasibility of this method is demonstrated by detecting a DNA sequence in different concentrations.

micropillar array chip; emulsion digital polymerase chain reaction(PCR); microspheres; biosensor

10.13873/J.1000—9787(2017)05—0016—03

2016—05—18

國家重大科學(xué)研究計劃資助項目( 2012CB933303)；國家自然科學(xué)基金資助項目( 61571429，61271161)；上海市科委資助項目(15140902402)

TP 212.3; O 482.54

A

1000—9787(2017)05—0016—03