基因芯片檢測(cè)乙肝病毒分型和耐藥突變的準(zhǔn)確度靈敏度分析

程瑞斌+劉靜

（咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北咸寧 437100）

[摘 要] 目的：分析基因芯片檢測(cè)乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）分型和耐藥突變的準(zhǔn)確度靈敏度，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：以我院2014年5月至2016年9月確診且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的351例乙型病毒性肝炎患者為研究對(duì)象，采用基因芯片法檢測(cè)其血清標(biāo)本HBV基因分型及核苷酸類藥物突變情況，以DNA直接測(cè)序法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算基因芯片檢測(cè)HBV分型和耐藥突變的準(zhǔn)確度靈敏度。結(jié)果：基因芯片與基因測(cè)序檢測(cè)HBV分型、耐藥突變結(jié)果完全一致。以基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)HBV分型和耐藥突變的準(zhǔn)確度為100%；基因芯片檢測(cè)HBV分型和耐藥的最低檢出限為103 copies/mL。結(jié)論：基因芯片技術(shù)在HBV分型和耐藥突變的檢測(cè)中具有較高的準(zhǔn)確度及靈敏度，能夠?yàn)榕R床抗病毒藥物的選擇提供可靠的參考。

[關(guān)鍵詞] 基因芯片；乙肝病毒分型；耐藥突變；準(zhǔn)確度；靈敏度

中圖分類號(hào)：R446.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2017）04-062-03

DOI：10.11876/mimt201704025

安全、有效的抗病毒治療對(duì)于延緩乙型病毒性肝炎病情進(jìn)展具有重要意義[1]。然而，HBV包括多種基因型，不同基因型耐藥特點(diǎn)存在差異，耐藥嚴(yán)重影響了抗病毒治療效果[2]。當(dāng)前臨床明確HBV耐藥突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)為DNA直接測(cè)序法，但存在成本高、耗時(shí)久等弊端，無(wú)法滿足快速診斷、大規(guī)模推廣要求[3]。本研究就基因芯片檢測(cè)HBV分型及耐藥突變的準(zhǔn)確度及靈敏度進(jìn)行分析，旨在評(píng)估該技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以我院2014年5月—2016年9月參照2010年全國(guó)傳染病與寄生蟲病學(xué)術(shù)會(huì)議擬定的《病毒性肝炎防治方案》確診的乙型病毒性肝炎患者為研究對(duì)象。入組患者乙肝表面抗原（HBsAg）及HBV DNA檢測(cè)均為陽(yáng)性（HBV DNA≥1×103 IU/mL），排除合并其他類型肝炎及免疫性肝病、膽汁型肝硬化患者及基因芯片檢測(cè)無(wú)信號(hào)者[4]共351例入選。其中男189例，女162例，年齡17～71歲，平均年齡（48.42±10.58）歲。351例患者均有長(zhǎng)期（≥48周）核苷類抗病毒藥物使用史，其中208例接受拉米夫定治療，143例接受阿德福韋酯治療。本研究已征得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 抽取患者入組次日空腹靜脈血4 mL，分裝于4支抗凝管內(nèi)，分別用于基因芯片法HBV基因分型、耐藥突變檢測(cè)及基因測(cè)序法HBV基因分型、耐藥突變檢測(cè)。

1.2.2 標(biāo)本檢測(cè) 基因芯片：HBV基因分型及耐藥突變檢測(cè)試劑均購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，使用Biomctra基因擴(kuò)增儀及FYY-3型分子雜交儀（興化市分析儀器廠），操作均嚴(yán)格按照試劑使用說(shuō)明書。擴(kuò)增循環(huán)條件：95℃ 10 min→94℃ 34 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s，重復(fù)循環(huán)50次。結(jié)果分析使用光學(xué)掃描儀[5]。HBV膜條探針排列順序設(shè)計(jì)見表1?；驕y(cè)序：取第二次聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物，委托華大基因公司完成基因測(cè)序。

1.2.3 結(jié)果分析 根據(jù)基因芯片、基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果，分析患者HBV分型及耐藥突變，以基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算基因芯片檢測(cè)HBV分型及耐藥突變的準(zhǔn)確度、靈敏度及特異性[6]。此外，為驗(yàn)證基因芯片對(duì)HBV分型和耐藥檢測(cè)的準(zhǔn)確性，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法確認(rèn)標(biāo)本載量并制成104、103、102 copies/mL濃度，分析基因芯片的最低檢出限[7]。

2 結(jié)果

基因芯片與基因測(cè)序檢測(cè)HBV分型結(jié)果完全一致，均為B型211例、C型53例、B+C型87例?；蛐酒瑴?zhǔn)確度100%。

351例患者中有126例患者耐藥基因突變耐藥，基因芯片與基因測(cè)序檢測(cè)HBV耐藥突變結(jié)果相同，具體見表2，準(zhǔn)確度為100%。

以基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)HBV分型和耐藥突變的靈敏度及特異性均為100%；基因芯片檢測(cè)HBV分型和耐藥的最低檢出限為103 copies/mL。

3 討論

核苷類似物是臨床治療病毒性乙型肝炎的常用方案，其口服給藥方便、病毒抑制作用較強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)已得到廣泛認(rèn)可，且可用于肝功能失代償者，但該類抗病毒藥物HBeAg轉(zhuǎn)換率偏低，療效持久性不足，會(huì)導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[8-9]。HBV耐藥突變的發(fā)生，可造成HBV DNA再次升高、轉(zhuǎn)氨酶反彈等，對(duì)治療效果造成不良影響 [10]。與此同時(shí)，不同HBV基因型對(duì)干擾素的應(yīng)答、疾病進(jìn)程的影響存在差異[11]，因此，在明確HBV耐藥突變的同時(shí)，了解HBV分型對(duì)于指導(dǎo)治療方案的選擇亦有著重要意義。

當(dāng)前臨床判斷HBV分型與耐藥突變主要依據(jù)基因測(cè)序技術(shù)，目前該技術(shù)耗時(shí)久、操作煩瑣且成本高昂 [12]。作為一種新型生物芯片技術(shù)，基因芯片檢測(cè)主要根據(jù)分子間特異性相互作用的原理，通過(guò)集成于硅芯片或玻璃芯片內(nèi)微型生化分析系統(tǒng)，全面了解基因及其他生物組分信息，具有準(zhǔn)確、快速、信息量大的優(yōu)勢(shì)[13]。與傳統(tǒng)檢測(cè)手段相比，基因芯片技術(shù)具有無(wú)污染、成本低、自動(dòng)化、微型化等特點(diǎn)，且可檢測(cè)已知突變位點(diǎn)，故在HBV分型和耐藥突變方面有著良好的應(yīng)用前景[14]。

為明確基因芯片技術(shù)檢測(cè)HBV分型與耐藥突變的價(jià)值，本研究結(jié)果表明，基因芯片與測(cè)序在HBV分型和耐藥突變的檢測(cè)準(zhǔn)確度方面具有一致性，這主要得益于HBV耐藥變異基本為單堿基變異，而寡核苷酸基因芯片技術(shù)在單次檢測(cè)中即可明確與HBV耐藥性相關(guān)的單堿基變異，一般不會(huì)導(dǎo)致誤判或漏檢[15-16]。

本研究篩選過(guò)程中8例患者因基因芯片無(wú)信號(hào)而未入組，無(wú)信號(hào)的原因可能是由于DNA拷貝數(shù)低于基因芯片的最低極限。在靈敏度的分析中，最低檢出限亦為重要指標(biāo)。本研究制成不同階梯濃度的標(biāo)本，就基因芯片技術(shù)的最低檢出限進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，該技術(shù)最低檢出限可達(dá)103 copies/mL，顯現(xiàn)出其在檢測(cè)靈敏度方面較高的價(jià)值。

需要注意的是，由于基因芯片技術(shù)僅可檢測(cè)已知位點(diǎn)的耐藥變異，無(wú)法發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)并針對(duì)性設(shè)計(jì)引物與探針，故在了解易突變區(qū)域完整序列、發(fā)現(xiàn)新的耐藥突變位點(diǎn)方面存在不足[18]。隨著臨床對(duì)于HBV耐藥突變研究的不斷深入，以及更多新的耐藥位點(diǎn)的探索，基因芯片技術(shù)在HBV耐藥突變檢測(cè)環(huán)節(jié)的應(yīng)用價(jià)值有望得到顯著提高，但仍無(wú)法完全取代基因測(cè)序技術(shù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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第一作者：程瑞斌，大專，檢驗(yàn)主管技師，研究方向：檢驗(yàn)臨床，Email：chengruibin@sina.com。