中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-9與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

張乃丹 袁成良 劉利洪 曾傳蓉

(德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 德陽 618000)

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中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-9與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

張乃丹 袁成良 劉利洪 曾傳蓉

(德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 德陽 618000)

目的 探討中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法 收治50例肺腺癌患者，免疫組化檢測患者腫瘤組織中NGAL和MMP-9的表達(dá)，分析NGAL、MMP-9與臨床預(yù)后的關(guān)系以及二者的相關(guān)性。結(jié)果 肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL平均表達(dá)量為70%，MMP-9為30%。單因素分析顯示NGAL水平、腫瘤分期均與患者總生存期(OS)相關(guān)。NGAL表達(dá)水平<70%的患者OS中位數(shù)是45.7個(gè)月(95%CI15.2～76.2個(gè)月)；NGAL表達(dá)水平≥70%的患者OS中位數(shù)是4.6個(gè)月(95%CI0.5～18.8個(gè)月；P<0.000 1)。Ⅲ期腫瘤患者 OS中位數(shù)是15.57個(gè)月(95%CI9.8～21.2)個(gè)月，Ⅳ期是9.6個(gè)月(95%CI0.8～18.4個(gè)月；P=0.002)。NGAL與MMP-9呈低度相關(guān)。MMP-9表達(dá)水平與OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 腫瘤組織中NGAL表達(dá)≥70%提示預(yù)后較差，MMP-9表達(dá)水平與預(yù)后無明顯相關(guān)。

脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；惡性腺癌；金屬基質(zhì)蛋白-9

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)參與了細(xì)胞凋亡〔1，2〕、分化、驗(yàn)證免疫應(yīng)答〔3〕、脂質(zhì)代謝和腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過程〔4，5〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9通過降解基底膜和細(xì)胞外機(jī)制參與了惡性腫瘤細(xì)胞的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移〔6〕。有研究顯示〔7〕NGAL對MMP-9有正調(diào)控作用。有研究表明，在乳腺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌和直腸癌組織中NGAL表達(dá)提示較差的預(yù)后，而在卵巢癌組織中NGAL表達(dá)提示較好的預(yù)后〔8，9〕。本研究旨在探討NGAL與MMP-9在肺腺癌患者預(yù)后判斷中的意義，分析NGAL和MMP-9在肺腺癌中的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 德陽市人民醫(yī)院2012年1月至2016年1月收治的50例肺腺癌患者，排除組織病理為非腺癌的肺癌患者以及曾接受化療和放療者。其中男27例，女23例，年齡(61.4±7.1)歲，中位年齡61歲。38例有吸煙史。患者在診斷為肺腺癌時(shí)的腫瘤分期Ⅰ期9例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期23例。Ⅱ～Ⅳ期的患者均接受鉑類細(xì)胞毒性化療治療(輔助或姑息)?；颊唠S訪(25.6±32.2)個(gè)月。所有患者肺癌組織經(jīng)手術(shù)切除后立即置于液氮中保存?zhèn)溆茫溆嗖糠钟?0%多聚甲醛固定后送病理科做組織化學(xué)檢測。治療方案都遵循國際肺癌治療原則〔3〕。

1.2 免疫組化檢測 免疫組化采用標(biāo)準(zhǔn)的抗生素蛋白標(biāo)記過氧化物酶法，樣本組織先經(jīng)石蠟包埋后切成4 μm厚切片，組織切片經(jīng)脫蠟處理后置于3% H2O2內(nèi)滅活內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)檸檬酸抗原修復(fù)液修復(fù)后自然冷卻，NGAL抗體按1∶100稀釋(〔NGAL，GTX63306〕 Clone：EPR5084，品牌：GeneTex?)；MMP-9抗體按1∶200稀釋〔MMP-9-GTX100458〕 Clone：NCl，品牌：GeneTex?Dilution 1∶200)，滴加一抗后4℃冰箱過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3 min/次，后滴加聚合物輔助劑，室溫孵育30 min后再用PBS沖洗3次，2 min/次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫下孵育30 min；PBS沖洗3次，2 min/次，滴加DAB顯色10～15 min，PBS沖洗干凈終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染3 min，乙醇梯度脫水，放入透明二甲苯中10 s，中性樹脂封片。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 所有切片均由本院1位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生雙盲觀察。作為NGAL陽性參照的是子宮頸內(nèi)膜腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中強(qiáng)陽性染色片，作為MMP-9陽性參照的是肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中強(qiáng)陽性染色片，陰性對照采用的一抗滴加PBS的切片。NGAL和MMP-9的表達(dá)以胞質(zhì)中的棕黃色染色為陽性。根據(jù)棕黃色著色深淺以及陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分，采用0～計(jì)分法(0，陰性；+弱陽性；強(qiáng)陽性)。

1.4 預(yù)后結(jié)果分析 無進(jìn)展生存期(PFS)是指從隨機(jī)化到病人出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間，總生存期(OS)是指從隨機(jī)化開始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。NGAL、MMP-9表達(dá)與患者PFS關(guān)系的數(shù)據(jù)以表格形式列出；NGAL、MMP-9表達(dá)與OS關(guān)系以生存曲線形式表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)、Dunettt-t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 NGAL和MMP-9蛋白表達(dá) 50例患者中，48例有NGAL蛋白表達(dá)，38例有MMP-9蛋白表達(dá)，見圖1。NGAL表達(dá)陰性者組織中，MMP-9的表達(dá)也為陰性。大部分患者腫瘤組織中NGAL表達(dá)強(qiáng)度為(39例，78%)，MMP-9表達(dá)強(qiáng)度為(19例，38%)。患者腫瘤組織中平均NGAL和MMP-9表達(dá)百分比為70%和30%。NGAL表達(dá)<70%(n=11)患者，MMP-9表達(dá)的均值為(22.3±27)%；NGAL表達(dá)≥70 %(n=38)患者，MMP-9表達(dá)的均值為(52.1±39)%。相關(guān)分析結(jié)果顯示，肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL和MMP-9表達(dá)水平呈較弱相關(guān)性(P=0.007，r=0.48)，見圖2。

圖1 肺腺癌患者腫瘤組織NGAL、MMP-9蛋白表達(dá)(×400)

圖2 腫瘤組織中NGAL與MMP-9蛋白相關(guān)性分析

2.2 NGAL、MMP-9表達(dá)與PFS 未得到Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者PFS的相關(guān)數(shù)據(jù)。Ⅲ～Ⅳ期患者PFS中位數(shù)為10.8個(gè)月(95%CI5.9～15.7個(gè)月)。NGAL表達(dá)<70%提示具有較好PFS；NGAL表達(dá)≥70%提示PFS較差。MMP-9表達(dá)與PFS無明顯相關(guān)，見表1。

2.3 NGAL、MMP-9表達(dá)與OS 50例肺腺癌患者OS中位數(shù)是17個(gè)月(95%CI：4.7～29.2個(gè)月)。單因素分析顯示，患者肺癌確診時(shí)的分期和NGAL表達(dá)水平是影響OS的直接因素。Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者OS的相關(guān)數(shù)據(jù)未獲得；Ⅲ期患者OS中位數(shù)15.57個(gè)月(95%CI：9.8～21.2個(gè)月)，Ⅳ期患者OS中位數(shù)9.6個(gè)月(95%CI：0.8～18.4個(gè)月，P=0.002)。NGAL表達(dá)<70%中位OS 45.7個(gè)月(95%CI：15.2～76.2個(gè)月)；NGAL表達(dá)≥70%中位OS 4.6個(gè)月(95%CI：0.5～18.8個(gè)月；P<0.000 1)。MMP-9表達(dá)<30%中位OS 36個(gè)月(95%CI：1.92～70.1個(gè)月)，MMP-9表達(dá)≥30%中位OS 15個(gè)月(95%CI：7.3～22.7個(gè)月)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.568)。見圖3。

表1 肺腺癌患者PFS分析

圖3 NGAL、MMP-9蛋白表達(dá)與OS分析

3 討 論

目前國內(nèi)外關(guān)于使用組織病理學(xué)指標(biāo)判斷肺癌患者臨床預(yù)后的研究仍然存在諸多爭論，且目前的研究并沒有涉及腫瘤轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后判斷〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL蛋白表達(dá)是肺腺癌獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能作為判斷肺癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。

NGAL是載脂蛋白家族成員，該家族共有50多種成員，NGAL氨基酸序列和DNA內(nèi)含子和外顯子的排列與其他成員有著高度保守性，因此NGAL具有結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)疏水基團(tuán)(如脂肪酸、前列腺素、花生四烯酸、類視黃醇類物質(zhì)等)的功能，在免疫調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中具有重要意義〔5〕。NGAL通過將惡性腫瘤細(xì)胞外鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)內(nèi)，在腫瘤的增殖、分化和發(fā)展中具有促進(jìn)作用〔11〕。有研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子、神經(jīng)轉(zhuǎn)換因子、PMA、視黃酸、糖皮質(zhì)激素等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的因子均具有促進(jìn)NGAL合成和釋放的功能〔12〕。

NGAL是中性粒細(xì)胞來源的92 kD的MMP-9的共價(jià)鍵蛋白。通過形成NGAL/MMP-9二聚體，NGAL可以保護(hù)MMP-9不受蛋白酶的降解，從而MMP-9在細(xì)胞基質(zhì)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的明膠分解作用〔13〕。MMP-9的活性增強(qiáng)也是NGAL過表達(dá)時(shí)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的原因之一〔7〕。NGAL/MMP-9復(fù)合物在腫瘤組織高表達(dá)多提示膀胱癌、腦瘤、乳腺癌、食管癌、胃癌和惡性血液癌預(yù)較差〔13〕。

本研究結(jié)果提示患者臨床OS較差，且NGAL表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系獨(dú)立于腫瘤分期，而且提示NGAL對肺腺癌患者OS的影響是獨(dú)立作用的并不依賴于MMP-9的交互作用。Zhang等〔14〕研究表明，在直腸癌中NGAL與MMP-9的表達(dá)提示直腸癌患者臨床預(yù)后較好，而本研究結(jié)果顯示NGAL表達(dá)提示肺腺癌患者臨床預(yù)后較差，對此認(rèn)為NGAL在肺腺癌組織的調(diào)控作用主要依賴于鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，降低細(xì)胞間E鈣黏附素聚集，從而促進(jìn)了新生癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移〔15〕，用鐵離子螯合劑類藥物阻斷NGAL蛋白的表達(dá)可能成為治療肺腺癌的潛在靶點(diǎn)。已有研究證明在動物模型上通過減少鐵離子的儲存和包括NGAL在內(nèi)的鐵離子運(yùn)載體的表達(dá)，可以有效阻斷腫瘤細(xì)胞增殖〔16〕。

本研究結(jié)果表明，肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL蛋白表達(dá)是獨(dú)立于腫瘤分期的，提示患者臨床預(yù)后的新指標(biāo)，腫瘤組織中NGAL蛋白表達(dá)≥70%多提示患者預(yù)后較差。肺腺癌患者腫瘤組織中MMP-9蛋白表達(dá)與患者臨床預(yù)后以及與NGAL蛋白表達(dá)之間無明顯相關(guān)，提示NGAL在肺腺癌患者腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有獨(dú)立的分子機(jī)制。

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〔2016-12-19修回〕

(編輯 李相軍)

張乃丹(1984-)，女，主管技師，主要從事臨床免疫學(xué)診斷研究。

R730.261

A

1005-9202(2017)08-1935-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.049