瑞舒伐他汀對ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中Sphk1/S1P/NF-κB信號通路的影響

王曉楠 周 葉 于曉紅 高 越

(杭州市第一人民醫(yī)院老年病科，浙江 杭州 310006)

瑞舒伐他汀對ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中Sphk1/S1P/NF-κB信號通路的影響

王曉楠 周 葉 于曉紅 高 越

(杭州市第一人民醫(yī)院老年病科，浙江 杭州 310006)

目的 探討經(jīng)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鞘氨醇激酶(Sphk)1、1-磷酸鞘氨醇(S1P)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65表達(dá)的變化及瑞舒伐他汀(Rt)對ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中Sphk1-S1P信號通路的影響。方法 實驗分為空白對照組，ox-LDL(50 μg/ml)處理組，Rt(0.1、1、10 μg/ml)干預(yù)組，RT-PCR檢測細(xì)胞Sphk1、S1P、 MMP-3因子水平；Western印跡檢測細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)；觀察藥物干預(yù)后細(xì)胞Sphk1、S1P、MMP-3、NF-κB p65因子的變化。MTT檢測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果 ox-LDL處理組細(xì)胞Sphk1、S1P、NF-κB p65、MMP-3的表達(dá)均顯著高于空白對照組(P<0.05)，Rt各干預(yù)組較ox-LDL處理組降低(P<0.05)。ox-LDL處理組細(xì)胞增殖明顯受抑制，Rt各干預(yù)組細(xì)胞增殖率均較ox-LDL處理組顯著上升(P<0.001)。結(jié)論 Sphk1-S1P 信號傳導(dǎo)通路的激活，導(dǎo)致下游炎癥因子NF-κB p65、MMP-3 的高表達(dá)，參與ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程，Rt可能通過抑制Sphk1/S1P 信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的與炎癥有關(guān)的血管損傷，延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程。

瑞舒伐他?。粍用}粥樣硬化；ox-LDL；Sphk1;S1P;NF-κB p65

動脈粥樣硬化(AS)是一種炎癥性疾病〔1〕，多種信號路徑對此炎癥反應(yīng)有啟動、維持及抑制作用，其病理表現(xiàn)為血管內(nèi)皮功能紊亂，單核/巨噬細(xì)胞侵入血管壁，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞去分化，增殖趨化和遷移加強；血小板激活；粥樣斑塊內(nèi)新生血管形成等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇激酶(Sphk)1、1-磷酸鞘氨醇(S1P)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65信號通路在一些伴隨炎癥性疾病中表達(dá)，在炎癥、腫瘤、阿爾茨海默病中，S1P都是重要的細(xì)胞內(nèi)靶點，它的作用比既往所了解的更復(fù)雜，對于疾病治療學(xué)的進(jìn)展有重要影響〔2〕。在該信號通路中，NF-κB扮演了重要的炎癥“中介”作用，而Sphk1-S1P信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、凋亡等過程中具有重要作用〔3,4〕，且S1P3受體可介導(dǎo)NF-κB激活和促進(jìn)黏附分子表達(dá)〔5〕。本研究旨在觀察瑞舒伐他汀(Rt)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中Sphk1/S1P/NF-κB信號通路的影響，探討其抗As的可能靶點及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)，Rt(Sigma),F12K培養(yǎng)液(Hyclone),胎牛血清(Hyclone),MTT(Sigma),0.25%胰酶(索來寶),DMSO(Sigma),SYBRGreen PCR試劑盒(Thermo F-415XL),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo #K1622),蛋白酶抑制套裝(Roche),BCA蛋白定量試劑盒(Thermo),HRP標(biāo)記的二抗(聯(lián)科生物),NF-κB p65一抗(proteintech)等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC培養(yǎng)在10%胎牛血清DMEM液中，觀察ox-LDL及Rt對HUVEC中Sphk1、S1P、NF-κB p65、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3的表達(dá)及細(xì)胞增殖率的影響。

1.2.2 實驗分組 實驗分為空白對照組，ox-LDL處理組(50 μg/ml，與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h)、不同濃度Rt組(0.1、1、10 μg/ml Rt干預(yù)1 h，再與ox-LDL 50 μg/ml與HUVEC共同培養(yǎng)24 h)。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖活性 HUVEC以5×103個/孔接種于96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜，按照質(zhì)量比1∶1分別取siRNA與DMN納米微粒輕輕混勻。室溫靜置20 min，形成磁性納米顆粒復(fù)合物，在96孔板中每孔加入100 μl新鮮培養(yǎng)液和1 μl復(fù)合物并混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中的10、100、500 mT磁場下培養(yǎng)48 h；將96孔板進(jìn)行MTT染色，λ=570 nm，測定OD值，計算各組細(xì)胞增殖率。

1.2.4 RT-PCR檢測 步驟遵循試劑盒說明書，純化HUVEC的RNA,配制RT反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s；引物設(shè)計：S1P正義5'-ACGCTGGACGATGGGTT-3',反義5'-CGCCGATGCTGAGGTTTA-3';MMP-3正義5'-AGTTTGCTCAGCCTATCC-3',反義5'-CTGTATGTAAGGTGGGTTT-3'；Sphk1正義5'-GTGCCCGACGAGGACTTT-3',反義5'-CACGCAACCGCTGACCAT-3' ;反應(yīng)體系：每孔板SYBR Premix Ex Taq 10 μl，PCR正義引物(10 μmol/L)1 μl，PCR反義引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 7 μl混合均勻；使用ABI7500RT-PCR儀，PCR板置于RT-PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),預(yù)變性：95℃、30 s；40個循環(huán)：95℃ 5 s、60℃ 34 s；溶解曲線：95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.2.5 Western印跡檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：HUVEC以1×105個/孔接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，取8 μg ST14高表達(dá)質(zhì)粒(10 μl)加入至490 μl無血清的Opti-MEM中，混勻；取5 μl Lipo 2000溶于495 μl無血清的Opti-MEM中，混勻，在室溫下孵育5 min；將兩種混合物在室溫下孵育20 min形成復(fù)合物；取1 ml復(fù)合物分別加入6孔板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后棄上清液并正常培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。細(xì)胞蛋白上清液的制備和濃度檢測：棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后每孔加入100 μl RIPA裂解液，收集裂解液離心后取部分上清蛋白用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。Western印跡檢測總蛋白中目的蛋白表達(dá)：行灌膠后，取各個處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度為6 μg/μl和等體積2×上樣緩沖液混合，將上樣液于100℃沸水中煮沸5 min，再冰上驟冷，3 000 r/min離心1 min；每孔加上樣液15 μl，留一孔加10 μl預(yù)染的Marker。80 V恒壓電泳，約20 min，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用110 V恒壓電泳，當(dāng)指示劑到達(dá)距凝膠下端約0.5 cm處時關(guān)閉電源，取出膠板；電泳即將結(jié)束前，預(yù)先將PVDF膜浸泡在甲醇中15 s，然后用ddH2O漂洗2 min，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，快速取出PVDF膜，放入5%BSA室溫封閉2 h；于搖床上用TBST洗膜5 min×3次；孵育袋中加入TBST稀釋的NF-κB p65和β-actin 4℃孵育過夜；TBST洗膜5 min×3次，TBST洗膜10 min×3次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)至暗處出現(xiàn)亮條帶，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組HUVEC的增殖率比較 ox-LDL處理組HUVEC增殖〔(-24.14±0.18)%〕明顯受抑制，與空白對照組〔(100.00±0.11)%〕比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與ox-LDL處理組比較，Rt 0.1 μg/ml組細(xì)胞增殖率〔(12.67±0.20)%〕顯著上升；Rt 1 μg/ml和10 μg/ml組〔(24.88±0.13)%，(22.39±0.08)%〕也明顯上升，且1 μg/ml組增殖率最大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 各組HUVEC細(xì)胞中Sphk1、S1P、MMP-3的表達(dá)量比較 與空白對照組比較，ox-LDL處理組及Rt各劑量組Sphk1、S1P、MMP-3的表達(dá)量均升高。與ox-LDL處理組比較，Rt各劑量組細(xì)胞中Sphk1、S1P、MMP-3表達(dá)減低(P<0.05)。Rt 1、10 μg/ml組較Rt 0.1 μg/ml組S1P、MMP-3表達(dá)降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞中S1P、MMP-3、 Sphk1基因的相對表達(dá)量比較

1)與空白對照組比較，2)與ox-LDL處理組比較，3)與Rt 0.1 μg/ml組比較：均P<0.05

2.3 各組HUVEC中NF-κB p65表達(dá)量比較 見圖1。與空白對照組(0.068 821)比較，ox-LDL處理組能顯著增強NF-κB p65的相對表達(dá)量(0.314 125)；與ox-LDL處理組比較，Rt各劑量組NF-κB p65的相對表達(dá)量有所下降(Rt 0.1 μg/ml組：0.152 506,Rt 1 μg/ml組：0.112 706，Rt 10 μg/ml組：0.101 093)，并且這種作用隨著Rt劑量的提高而加強。

1～5:空白對照組、ox-LDL處理組、Rt 0.1 μg/ml組、Rt 1 μg/ml組、Rt 10 μg/ml組圖1 各組細(xì)胞NF-κB p65的Western印跡結(jié)果

3 討 論

AS是一種慢性心血管疾病，高脂血癥、糖尿病，高血壓、吸煙等多種因素均可導(dǎo)致其發(fā)生，其發(fā)病機(jī)制是以脂質(zhì)浸潤學(xué)說和損傷反應(yīng)學(xué)說為基礎(chǔ)的炎癥理論〔6〕。AS 是脂質(zhì)積累于動脈內(nèi)壁而形成的局部斑塊的病理變化過程，主要經(jīng)由炎癥反應(yīng)介導(dǎo)，并伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生。多種炎癥因子之間的相互作用參與了AS的發(fā)生、發(fā)展、斑塊破裂、血栓形成的全過程。

Sphk1 是近年來發(fā)現(xiàn)的鞘脂代謝平衡的重要限速酶，Sphk1 催化反應(yīng)的產(chǎn)物S1P 是一個同時具有細(xì)胞內(nèi)第二信使和細(xì)胞外第一信使雙重功能的脂類生物活性分子。S1P促AS功能表現(xiàn)為：(1)由S1P3受體介導(dǎo)NF-κB激活和促進(jìn)黏附分子表達(dá)〔5〕；(2)S1P協(xié)同凝血酶促進(jìn)EC3組織因子表達(dá)〔7〕。冠脈阻塞患者血清S1P濃度升高，血清S1P水平升高是臨床冠脈狹窄發(fā)生和嚴(yán)重程度的強指針〔8〕。Alvarez等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)S1P 通過特異性結(jié)合在TRAF2的N-末端RING功能域上，最終激活NF-κB 信號通路。同時有研究發(fā)現(xiàn)在AS部位和纖維斑塊部位均發(fā)現(xiàn)了激活的NF-κB，而正常的血管很少或沒有NF-κB表達(dá)，證明NF-κB 在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用〔10,11〕。NF-κB可以調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，并可介導(dǎo)MMPs等的產(chǎn)生。它是細(xì)胞因子、黏附分子和生長因子間重要的聯(lián)絡(luò)因子，可導(dǎo)致硬化斑塊的形成、生長和斑塊破裂。本研究表明，Sphk1-S1P 信號通路被異常激活可能參與了AS的病理進(jìn)程。他汀類藥物屬于膽固醇生物合成抑制劑，具有降低ox-LDL 的作用，還具備減弱氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)的程度，提高內(nèi)皮細(xì)胞功能，穩(wěn)定動脈粥樣斑塊等〔12〕。多項臨床研究證實〔13，14〕，他汀類藥物具有多重的抗感染作用而并非單一的調(diào)脂功能。Rt通過抑制炎性趨化因子、黏附分子和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，降低C反應(yīng)蛋白(CRP)表達(dá)水平，參與改善AS的病理過程。大量研究顯示，Rt通過多方面作用發(fā)揮抗感染效應(yīng)：(1)能下調(diào)CD40L；(2)亦能通過上調(diào)單核細(xì)胞過氧化物酶體增殖激活受體(PPAR)-γ，進(jìn)而下調(diào)MMP-9的表達(dá)，改善炎性反應(yīng)；(3)可干預(yù)COX-2及前列腺素的合成〔15〕;(4)通過影響循環(huán)中單核細(xì)胞的TLR-4、CD14表達(dá)水平而下調(diào)CRP〔16〕。4.抑制INF-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表面主要組織相容抗原(MHC)Ⅱ的表達(dá)，并能抑制巨噬細(xì)胞表面刺激信號的表達(dá)〔17〕；(5)Sironi等〔18〕表明，在腦卒中模型大鼠中，使用Rt干預(yù)可降低MCP-1、TGF-β、IL-1、P-選擇素的表達(dá)水平，從而抑制炎癥反應(yīng)；(6)另外，CCR2可被Rt下調(diào)，減輕炎性反應(yīng)對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。

本研究結(jié)果顯示Rt可通過抑制Sphk1/S1P/NF-κB信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而穩(wěn)定AS斑塊，延緩AS斑塊的進(jìn)展。同時也說明了他汀類藥物對抗AS炎性反應(yīng)是通過多種途徑實現(xiàn)的。

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〔2016-12-17修回〕

(編輯 滕欣航)

杭州市衛(wèi)生科技計劃項目(2013A17)

高 越(1967-)，男，教授，主要從事老年病研究。

王曉楠(1974-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事老年心血管病研究。

R54

A

1005-9202(2017)08-1897-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.032