多奈哌齊與左卡尼汀治療癡呆模型大鼠的療效比較

申東方 田曉彥 宋榮蓉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

多奈哌齊與左卡尼汀治療癡呆模型大鼠的療效比較

申東方 田曉彥1宋榮蓉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的 比較左卡尼汀和多奈哌齊對腦室注射鏈脲佐菌素(STZ)致癡呆大鼠的治療作用。方法 健康SD雄性大鼠32只，隨機分為對照組、模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組(n=8)。模型組和治療組在手術(shù)的第1、3天分別向兩側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射STZ 3 mg/kg，對照組給予相同體積的檸檬酸緩沖液。左卡尼汀組于手術(shù)10 d前給予左卡尼汀20 mg·kg-1·d-1灌胃，術(shù)后持續(xù)90 d，多奈哌齊組給予多奈哌齊0.45 mg·kg-1·d-1灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水。術(shù)后第10、90天Morris水迷宮試驗，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。術(shù)后8 w處死大鼠取海馬送電鏡觀察神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果 術(shù)后10 d水迷宮測試，與對照組比較，模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組的潛伏期延長，過平臺次數(shù)下降(P<0.01)。術(shù)后治療90 d，與模型組比較，多奈哌齊組的潛伏期縮短，過平臺次數(shù)增加(P<0.01)，左卡尼汀組潛伏期縮短(P<0.05)，過平臺次數(shù)無明顯增加(P>0.05)。左卡尼汀組與多奈哌齊組比較各指標差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，兩治療組電鏡下觀察大鼠海馬細胞結(jié)構(gòu)細胞凋亡程度輕，以多奈哌齊治療組明顯。結(jié)論 左卡尼汀與多奈哌齊都能減輕AD模型鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，從而起到改善臨床癥狀的作用，左卡尼汀效果不如多奈哌齊。

阿爾茨海默??；左卡尼汀；多奈哌齊；神經(jīng)元凋亡

預(yù)計2050年以后，全球的阿爾茨海默病(AD)患病率將是目前的4倍〔1〕，但其病因迄今不明。抗膽堿酯酶藥物是美國食品與藥品管理局(FDA)最先批準使用治療本病的藥物，多奈哌齊用于治療AD病人，已被證明有效，但只能使患者的認知水平下降減輕，卻并不能減慢疾病的變性進程。本實驗比較左卡尼汀與多奈哌齊對AD大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠32只，2.5～3個月齡，體重200～250 g。由北京通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。大鼠隨機分為對照組、模型組、多奈哌齊組、左卡尼汀組，每組8只。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 左卡尼汀(東北制藥總廠)，多奈哌齊(法國PFIZEK·PGM公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，枸櫞酸鈉溶液(武漢博士德生物工程有限公司)，10%水合氯醛，大鼠立體定位儀(江西醫(yī)療器械研究所)，Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

1.3 模型制作方法

1.3.1 動物的篩選與分組 在實驗前先將大鼠進行水迷宮初篩，測量大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)與記憶的獲取能力。通過初篩，去除先天癡呆(潛伏期平均值>50 s)和游泳姿勢不良者，將合格大鼠32只隨機分為對照組，模型組和多奈哌齊組、左卡尼汀組，每組各8只。

1.3.2 動物模型的制作 水迷宮測試48 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，參考包新民《大鼠腦立體定向圖譜》〔2〕，將大鼠的頭固定于立體定位儀上，剪去局部毛發(fā)，消毒后沿矢狀線切開皮膚，切口長約1.5 cm，將骨膜向兩側(cè)推開暴露顱骨，在前囟后1.5 mm、矢狀縫側(cè)方1.5 mm處鉆孔，微量進樣器垂直進入，深度距離腦表面3.5 mm，將STZ溶于檸檬酸緩沖液中(pH4.4)，緩慢注入模型組、多奈哌齊組、左卡尼汀組大鼠。在手術(shù)的第1、3天分別向兩側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射，每次每側(cè)注入約10 μl(3 mg/kg)。對照組大鼠腦室內(nèi)注射相同體積的檸檬酸緩沖液。每側(cè)注入時間為5 min，留針5 min，緩慢出針。無菌骨蠟封閉鉆孔，術(shù)區(qū)滴慶大霉素，縫合消毒。術(shù)后大鼠除給予普通飼料及自來水喂養(yǎng)外，牛奶灌胃4 d，青霉素肌注(1次/d，注射5 d)以防止感染。

1.3.3 各組大鼠的處置 多奈哌齊組：大鼠于手術(shù)前給予多奈哌齊0.45 mg·kg-1·d-1灌胃10 d，于側(cè)腦室注射STZ術(shù)后再持續(xù)多奈哌齊灌胃治療90 d。左卡尼汀組：大鼠于手術(shù)前給予左卡尼汀20 mg·kg-1·d-1灌胃10 d，于側(cè)腦室注射STZ術(shù)后再持續(xù)左卡尼汀灌胃治療90 d。模型組：大鼠于手術(shù)前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側(cè)腦室注射STZ后再持續(xù)生理鹽水灌胃持續(xù)90 d。對照組：大鼠于手術(shù)前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側(cè)腦室注射與治療組等量檸檬酸平衡液術(shù)后再持續(xù)生理鹽水灌胃90 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力觀察 分別于術(shù)后第10、90天進行水迷宮試驗，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1.4.2 電鏡觀察 術(shù)后90 d處死大鼠取腦海馬部位，HE染色及送電鏡觀察神經(jīng)元凋亡情況。HE染色：將石蠟切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，二甲苯(Ⅰ)15 min→二甲苯(Ⅱ)15 min→二甲苯(Ⅲ)15 min→100%乙醇10 min→100%乙醇10 min→95%乙醇10 min→90%乙醇10 min→75%乙醇10 min→蒸餾水沖洗兩遍→蘇木素染色10～15 min→伊紅復(fù)染→透明、干燥→中性樹膠封片。送電鏡觀察神經(jīng)元凋亡情況。電鏡用固定液(本校電鏡室提供)固定過夜，PBS漂洗，丙酮脫水，1%四氧鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察。PBS漂洗2次，2.5%的戊二醛固定后送哈爾濱醫(yī)科大學(xué)電鏡室觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計軟件包進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化 術(shù)前對照組、模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組的潛伏期及過平臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05)。術(shù)后第10天，而模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組潛伏期較對照組明顯延長(P<0.01)，過平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01)。表明STZ側(cè)腦室注射10 d后大鼠認知功能明顯下降。術(shù)后給予藥物治療90 d，多奈哌齊組、左卡尼汀組與模型組潛伏期差異顯著(P<0.01,P<0.05)；左卡尼汀組與多奈哌齊組比較差異顯著(P<0.05)，表明多奈哌齊及左卡尼汀組均減短潛伏期，多奈哌齊組更明顯。多奈哌齊組過平臺次數(shù)與模型組差異顯著(P<0.01)；左卡尼汀組與模型組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明多奈哌齊組增加過平臺次數(shù)，左卡尼汀組則不明顯，表明多奈哌齊治療改善大鼠認知功能，而左卡尼汀的治療作用則不如多奈哌齊。見表1，表2。

表1 不同時期大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與多奈哌齊組比較：4)P<0.05，下表同

表2 大鼠過平臺次數(shù),次)

2.2 組織學(xué)改變 ①HE染色：對照組大鼠海馬形態(tài)完整，神經(jīng)元數(shù)量多，細胞排列整齊，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)正常，染色正常。術(shù)后模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)異常，神經(jīng)元細胞明顯減少，錐體細胞帶紊亂、變稀、中斷，可見許多細胞體積縮小，胞核固縮，出現(xiàn)較多凋亡細胞。多奈哌齊、左卡尼汀組較模型組細胞數(shù)增多，細胞結(jié)構(gòu)較完整，其中，多奈哌齊組優(yōu)于左卡尼汀組,見圖1。②電鏡下細胞學(xué)結(jié)果：模型組海馬細胞皺縮，表面微絨毛消失，線粒體空泡變，核周板層體崩解成髓樣變，其他細胞器消失。而多奈哌齊組細胞表面微絨毛較豐富，細胞器結(jié)構(gòu)和膜結(jié)構(gòu)較完整。左卡尼汀組細胞表面絨毛可見，核周體及線粒體明顯減少，見圖2。

圖1 各組海馬細胞HE染色(×400)

圖2 各組海馬細胞學(xué)改變(×11 500)

3 討 論

AD是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，主要表現(xiàn)為持續(xù)進行性認知功能障礙而無緩解，其病理特征為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬錐體細胞空泡變性及神經(jīng)元缺失。隨著神經(jīng)元的缺失，各種神經(jīng)遞質(zhì)也隨之缺乏，其中最早也最明顯的是乙酰膽堿。膽堿能受體除與大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)外，還與神經(jīng)保護作用有關(guān)〔3〕。這也是目前AD治療獲得有限療效的重要基礎(chǔ)。

多奈哌齊是一種具有高度選擇性、可逆性的膽堿酯酶抑制劑，通過抑制膽堿酯酶而抑制乙酰膽堿降解并提高活性，改善神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞功能。左卡尼汀是哺乳動物能量代謝中需要的內(nèi)源性物質(zhì)，在機體能量代謝中必不可少，可促進脂類、葡萄糖以及氨基酸的代謝而改善機體能量供應(yīng)，其中以促進脂肪的氧化代謝作用最為突出〔4，5〕。左卡尼汀與肌肉細胞、心肌細胞的能量代謝有關(guān)，對于各種組織缺血缺氧，左卡尼汀通過增加能量產(chǎn)生而提高組織器官的功能。左卡尼汀在治療心血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、糖尿病并發(fā)癥、突發(fā)性聾、慢性阻塞性肺疾病、減輕腫瘤化療藥物所致神經(jīng)毒性和血液學(xué)毒性等方面取得了較好療效〔6～8〕。

小劑量STZ側(cè)腦室注射是目前國內(nèi)外使用較多的制備癡呆動物模型的方法〔9，10〕。本實驗結(jié)果表明側(cè)腦室注射STZ制造大鼠癡呆模型可靠性好，穩(wěn)定性高。多奈哌齊治療改善大鼠認知功能，左卡尼汀治療療效果不如多奈哌齊。

左卡尼汀對大鼠認知功能有一定的改善，我們認為這可能與左卡尼汀促進脂類、葡萄糖以及氨基酸的代謝而改善神經(jīng)元的能量供應(yīng)，通過增加能量產(chǎn)生而提高神經(jīng)元細胞的功能，其次，左卡尼汀還是一種優(yōu)良的抗氧化劑，可增加自由基清除酶活性而對抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護神經(jīng)元細胞膜功能，從而對神經(jīng)元到保護性作用。在本實驗中，左卡尼汀有一定的神經(jīng)元保護作用，但不及多奈哌齊。本實驗樣本量小，下一步可進行大樣本的研究以驗證其作用。

1 吳 江.神經(jīng)病學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：331.

2 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜(Ⅲ)〔M〕.北京：人民出版社，1991：12-8.

3 Dajas-Bailador F，Wonnacott S.Nicotinic acetylcholine receptors and the regulation of neuronal signaling〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2004；25：317-24.

4 Ramana KV.Aldose reductase：new insights for an old enzyme〔J〕.Biomol Concepts，2011；2(1-2)：103-14.

6 杜繼東.左卡尼汀的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀〔J〕.天津藥學(xué)，2013；25(3):548.

7 DiNicolantonio JJ，Lavie CJ，F(xiàn)ares H，etal.L-carnitine in the secondary prevention of cardiovascular disease：systematic review and meta-analysis〔J〕.Mayo Clin Proc，2013；88(6)：544-51.

8 Vidal-Casariego A，Burgos-Peláez R，Martínez-Faedo C.Metabolic effects of L-carnitine on type 2 diabetes mellitus：systematic review and meta-analysis〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes,2013；121(4)：234-8.

9 Nataniel Lester-Coll，Enrique J Rivera.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes：relevance to sporadic Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimer Dis，2006;9(1)：13-33.

10 Lannert H,Hoyer S.Intracerebroventricular administration of streptozotocin causes long-term diminutions in learning and memory abilities and in cerebral energy metabolism in adult rats〔J〕.Behav Neurosci,1998;112(5):1199-208.

〔2015-12-20修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

黑龍江省自然基金資助項目(No.0200869)

宋榮蓉(1965-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事阿爾茨海默病、帕金森病的研究。

申東方(1984-)，女，博士在讀，主治醫(yī)師，主要從事阿爾茨海默病、帕金森病的研究。

R749

A

1005-9202(2017)08-1888-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.028

1 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院老年病科