血管緊張素原對動脈粥樣硬化的作用及機制

馮文偉 陳伯鈞 趙 帥 唐 詠 張為章 陳冬杰 李茂清

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510403)

血管緊張素原對動脈粥樣硬化的作用及機制

馮文偉 陳伯鈞1趙 帥1唐 詠2張為章 陳冬杰 李茂清3

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510403)

目的 探討血管緊張素原(AGT)對動脈粥樣硬化(AS)的作用機制。方法 構建AS小鼠模型，RT-PCR檢測AS小鼠斑塊組織和正常小鼠主動脈血管組織中AGT的表達水平。以人巨噬細胞RAW264.7和人主動脈平滑肌細胞(HA-VSMC)為研究對象，轉染siRNA AGT、siRNA control，實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測轉染后的AGT水平。MTT檢測細胞轉染后細胞的增殖情況，流式細胞儀檢測轉染后的細胞凋亡情況。Western印跡檢測轉染后細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平。結果 AS小鼠斑塊組織中AGT的表達水平高于正常小鼠主動脈組織(P<0.01)。siRNA AGT可以有效抑制巨噬細胞RAW264.7和人主動脈平滑肌細胞HA-VSMC中AGT的轉錄表達。轉染siRNA AGT后的巨噬細胞RAW264.7存活率與siRNA control組比較差異顯著(P<0.01)，轉染siRNA AGT后的主動脈平滑肌細胞HA-VSMC存活率與siRNA control組差異顯著(P<0.01)，抑制AGT的表達可以抑制巨噬細胞和平滑肌細胞的增殖。轉染siRNA AGT后的巨噬細胞RAW264.7凋亡率顯著高于siRNA control組(P<0.01)；轉染siRNA AGT后的主動脈平滑肌細胞HA-VSMC凋亡率顯著高于siRNA control組(P<0.01)。轉染siRNA AGT后的巨噬細胞RAW264.7和主動脈平滑肌細胞HA-VSMC中Caspase-3、Bax蛋白表達量顯著高于siRNA control組，Bcl-2蛋白表達量顯著低于siRNA control組(均P<0.01)。結論 AGT在鼠AS斑塊組織中過表達，抑制AGT可以抑制AS相關細胞增殖，促進細胞凋亡，作用機制與凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax有關。

動脈粥樣硬化；血管緊張素原；平滑肌細胞；巨噬細胞

動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生和發(fā)展與主動脈平滑肌細胞(VSMC)和巨噬細胞具有密切關系〔1〕。血管緊張素原(AGT)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)唯一的作用底物〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，AS在心血管系統(tǒng)中具有重要作用〔3〕。目前尚未見AGT在AS中的相關作用研究。本研究構建了動脈粥樣硬化小鼠模型，檢測斑塊組織中AGT的表達水平，進一步研究AGT對主動脈平滑肌細胞和巨噬細胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人巨噬細胞RAW264.7和人VSMC(HA-VSMC)購于上海昱都生物科技有限公司，14日齡的載脂蛋白E(ApoE)基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠8只為正常組，14日齡雄性小鼠8只為實驗組，均由長沙天力生物科技有限公司提供。正常組每日正常飲食，實驗組用高脂飼料飼喂，兩組小鼠均按照相關管理要求飼喂30 d。主要儀器及試劑：酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)，紫外分光光度計(美國Thermo)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，DMEM(美國Sigma)，勻漿器(上海洽姆儀器科技有限公司)，離心機(湖南恒諾醫(yī)用設備有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，F(xiàn)BS(樂清市虹橋愛科威自動化設備廠)，聚偏氟乙醇(PVDF)膜(上?？道噬锟萍加邢薰?，脫脂奶粉(雅培)，反轉錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，實時熒光定量PCR檢測試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，蛋白濃度檢測試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，PBS(上海欣百諾生物工程有限公司)，MTT(上海江萊生物科技有限公司)，PI(北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司)，Annexin-V(北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司)，胰蛋白酶(美國Sigma)，Bax多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體、Caspase-3多克隆抗體、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物標記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測AGT的表達水平 誘導的AS小鼠斷頭處死，打開胸腔，取主動脈斑塊組織，經(jīng)勻漿器勻漿后，5 000 r/min，4℃離心5 min后棄上清液，加入冰預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，5 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清液，加入Trizol裂解液充分混勻后，放置于冰上靜置5 min。加入氯仿，上下劇烈震蕩10次，放置于冰上靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，吸取上層水相層至新的EP管中，加入等體積的異丙醇充分混勻后，放置于冰上靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清液，加入濃度為75%的乙醇混勻，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，放置于超凈工作臺晾干后，加入適量的焦碳酸乙醇酯(DEPC)水溶解RNA。紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度及純度。按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成AGT的cDNA，按照實時熒光定量PCR說明書檢測AGT的表達水平，分析AGT的表達量。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人巨噬細胞RAW264.7和HA-VSMC細胞用含10% FBS的DMEM細胞生長液在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察細胞融合度為85%左右時，棄去細胞生長液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入PBS洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，加入細胞生長液，接種于細胞培養(yǎng)板中。

1.2.3 細胞轉染 取對數(shù)生長期的人巨噬細胞RAW264.7和HA-VSMC，棄細胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min，加入細胞生長液，調整每毫升細胞懸浮液中含有細胞個數(shù)為3×105個，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。為了提高轉染效率，在轉染前1 h將細胞生長液換成不含F(xiàn)BS的不完全培養(yǎng)基。分別取siRNA AGT、siRNA control與不完全培養(yǎng)液混合為A液，于室溫靜置5 min；轉染試劑與不完全培養(yǎng)基混合后為B液；分別取A液和B液混合后室溫靜置20 min后，加入細胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 RT-PCR檢測細胞中AGT的表達水平 轉染siRNA AGT、siRNA control后的RAW264.7和HA-VSMC細胞經(jīng)培養(yǎng)48 h后，提取其細胞的RNA，反轉錄合成AGT的cDNA，RT-PCR檢測分析細胞中AGT的表達水平，方法同1.2.2。

1.2.5 (MTT)檢測細胞增殖 取處于對數(shù)生長期的RAW264.7和HA-VSMC細胞，加入胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，在細胞沉淀中加入細胞培養(yǎng)液，調整細胞濃度為2×104個/ml，接種細胞至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸浮液200 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h，棄上清液，加入150 μl的二氨基亞砜(DMSO)溶液，緩慢震蕩10 min，觀察結晶完全溶解后，放置于酶標儀上檢測各孔的吸光度，波長為490 nm，計算細胞存活率。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取處于對數(shù)生長期轉染后的RAW264.7和HA-VSMC細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，棄消化液，調整細胞濃度為每毫升中含有2×106個細胞，1 000 r/min離心10 min，加入冰預冷的PBS洗滌細胞2次，加入體積為200 μl的Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl碘化丙啶(PI)和5 μl膜鏈蛋白(Annexin-V)充分混勻后，在室溫下靜置15 min，加入體積為300 μl的緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7 Western印跡檢測細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達水平 取對數(shù)生長期轉染后的RAW264.7和HA-VSMC，棄細胞生長液，按照細胞蛋白提取試劑盒說明書提取細胞中的總蛋白，用蛋白濃度測定試劑盒說明書測定提取的蛋白的濃度及純度。蛋白樣品與loading buffer充分混勻后，放置于100℃煮沸5 min。取變性后的蛋白樣品50 μl，加入上樣孔中，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后，調整電壓為120 V直至電泳結束。取出蛋白凝膠，按照濾紙、PVDF膜、蛋白凝膠、濾紙順序放置，轉膜電流為30 mA，4℃轉膜過夜。5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗和二抗孵育后，在暗室中曝光，分析蛋白表達含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 AS小鼠組織中AGT的表達水平 AS小鼠斑塊組織中AGT的表達水平(2.14±0.22)與正常小鼠主動脈組織AGT的水平(1.01±0.68)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 轉染后細胞中AGT表達結果 轉染后的RAW264.7 siRNA AGT組中AGT的表達水平(0.23±0.12)明顯低于siRNA control組(1.00±0.85)(P<0.01)；轉染后的HA-VSMC siRNA AGT組AGT的表達水平(0.32±0.04)明顯低于siRNA control組(1.05±0.88)(P<0.01)，siRNA AGT可以有效抑制RAW264.7和HA-VSMC中AGT的轉錄表達。

2.3 MTT檢測轉染后細胞增殖情況 轉染siRNA AGT后RAW264.7存活率〔(0.34±0.04)%〕與siRNA control組〔(0.99±0.08)%〕比較差異顯著(P<0.01)，轉染siRNA AGT后的HA-VSMC存活率〔(0.28±0.03)%〕與siRNA control組〔(1.00±0.07)%〕差異顯著(P<0.01)，抑制AGT的表達可以抑制巨噬細胞和平滑肌細胞的增殖。

2.4 流式細胞儀檢測轉染后的細胞凋亡情況 轉染siRNA AGT后的RAW264.7凋亡率〔(0.53±0.07)%〕顯著高于siRNA control組〔(0.14±0.06)%〕(P<0.01)；轉染siRNA AGT后的HA-VSMC凋亡率〔(0.62±0.06)%〕顯著高于siRNA control組〔(0.18±0.04)%〕(P<0.01)；抑制AGT的表達可以促進巨噬細胞和主動脈平滑肌細胞的凋亡。

2.5 Western印跡檢測轉染后細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax表達水平 轉染siRNA AGT后RAW264.7中Caspase-3、Bax蛋白表達量(0.29±0.05，0.36±0.06)顯著高于siRNA control組(0.14±0.03，0.25±0.07)，Bcl-2蛋白表達量(0.08±0.01)顯著低于siRNA control組(0.28±0.04)(均P<0.01)；轉染siRNA AGT后的HA-VSMC中Caspase-3、Bax蛋白表達量(0.31±0.08，0.45±0.07)顯著高于siRNA control組(0.13±0.02，0.24±0.09)，Bcl-2蛋白表達量(0.15±0.09)顯著低于siRNA control組(0.36±0.08)(均P<0.01)。抑制AGT的表達可以抑制Bcl-2的表達，促進Caspase-3、Bax表達。見圖1，圖2。

圖1 Western印跡檢測巨噬細胞RAW264.7中蛋白表達

圖2 Western印跡檢測HA-VSMC中蛋白表達

3 討 論

AS是最為常見的心血管系統(tǒng)疾病〔4〕。AS會引起血管壁增厚使管腔變窄，增加血管壓力，進而引起高血壓的發(fā)生。平滑肌細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的聚集增生是AS形成的必要條件。

RAS廣泛存在于人體的心臟、腎臟、腎上腺、血管等組織系統(tǒng)中，在心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定和正常發(fā)育以及血壓調節(jié)、維持體液平衡等方面發(fā)揮重要作用〔6〕。傳統(tǒng)觀念認為，腎素和AGT的主要來源為腎臟，研究表明，AGT和腎素在骨骼肌、血管平滑肌、心肌、腦等多種組織器官中均有表達〔7〕。RAS在心血管系統(tǒng)中存在局部循環(huán)，這種局部循環(huán)可以調節(jié)心血管系統(tǒng)的活動，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在人體內，AGT是一種糖基化的球蛋白，由452個氨基酸組成，是RAS的作用底物，在腎素的作用下可以分解為血管緊張素Ⅰ，從而引起一系列的鏈式反應〔8〕。本研究結果說明抑制AGT的表達可

以抑制VSMC和巨噬細胞的增殖。

細胞凋亡是一種正常情況下的細胞死亡，是細胞維持生命機體活動的重要功能。細胞凋亡受多種基因的嚴格調控，是一種程序性的細胞死亡，是細胞維持機體內環(huán)境穩(wěn)定的重要途徑〔9〕。Bcl-2蛋白家族與細胞的凋亡具有密切關系，根據(jù)其在細胞凋亡中的作用可以分為兩類，一類是可以促進細胞凋亡的蛋白稱為促凋亡蛋白，主要有Bax，還有一類在細胞凋亡過程中發(fā)揮抑制作用的蛋白如Bcl-2蛋白〔10〕。細胞凋亡時，促凋亡蛋白增多，抑凋亡蛋白減少。Caspase-3作為Caspase蛋白家族中的成員之一，是細胞凋亡進入不可逆階段的標志之一〔11〕。本研究結果說明AGT可以促進巨噬細胞和平滑肌細胞的增殖，抑制細胞凋亡，作用機制與Bcl-2、Bax和Caspase-3有關。

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〔2016-12-12修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東建設中醫(yī)藥強省立項資助項目(20151114)

陳伯鈞(1962-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病臨床與基礎研究。

馮文偉(1979-)，男，2015級碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西結合治療心血管疾病臨床與基礎研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)08-1871-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.021

1 廣東省中醫(yī)院大學城醫(yī)院急診科

2 廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院心血管科

3 梅州市殘聯(lián)康復醫(yī)院康復科