8周游泳運動對糖尿病大鼠模型主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

黃玫梅 尚畫雨 夏 志 蘇全生

(成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)系，四川 成都 610041)

8周游泳運動對糖尿病大鼠模型主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

黃玫梅 尚畫雨1夏 志2蘇全生

(成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)系，四川 成都 610041)

目的 探討長期游泳運動對2型糖尿病(T2DM)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。方法 8周齡雄性Wistar大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)注射制備成T2DM大鼠模型后，隨機(jī)分為空白對照組(C組)、單純運動組(CE組)、糖尿病對照組(DM組)、糖尿病運動組(DME組)。CE組、DME組進(jìn)行8 w游泳訓(xùn)練(6 d/w)，第1周前3 d練習(xí)時間分別為20、30和45 min，第4天起每天持續(xù)游泳60 min。運動8 w后測定各組血漿中血管性假性血友病因子(vWF)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)，以及胸主動脈中二酯酰甘油(DAG)、蛋白激酶C(PKC)的水平。結(jié)果 與DM組相比，DME組的血漿vWF、PAI-1含量以及胸主動脈中PKC活性均明顯降低(P<0.05)，而DAG水平也有所降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 8 w游泳運動可降低vWF、PAI-1水平，減輕DM造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，對內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少組織DAG的合成、抑制PKC途徑的激活有關(guān)。

有氧運動；2型糖尿病；血管性假性血友病因子；纖溶酶原激活物抑制劑；蛋白激酶C

動脈粥樣硬化、冠心病〔1〕等是導(dǎo)致糖尿病(DM)高致殘率和病死率的主要原因，血管病變成為DM最主要的慢性并發(fā)癥〔2〕。其中，2型糖尿病(T2DM)發(fā)生冠心病的風(fēng)險是非糖尿病人群的2～4倍〔3〕。由于內(nèi)皮功能紊亂是DM血管并發(fā)癥的始動因素和最重要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)〔4〕，因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是防治DM血管并發(fā)癥的關(guān)鍵。近年研究顯示，有四條病理性通路與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展緊密相關(guān)：多元醇途徑；己糖胺途徑；糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)形成途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑〔5〕。目前，大多數(shù)研究都是從AGEs通路去研究藥物對血管的保護(hù)機(jī)制，尚未見報道從二酯酰甘油(DAG)-PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度研究長期游泳運動在DM大血管病變發(fā)病中的干預(yù)作用。本研究擬通過復(fù)制T2DM大鼠模型，觀察8 w游泳運動后大鼠血漿中內(nèi)皮依賴性調(diào)節(jié)蛋白和胸主動脈組織中DAG-PKC系統(tǒng)的變化，探討其對T2DM大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取8周齡雄性Wistar大鼠，體重200～230 g，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，自由攝食、飲水，室溫22℃～25℃；高糖高脂飼料配方〔6〕：10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鈉，66.5%基礎(chǔ)飼料。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自成都三鷹生物技術(shù)有限公司；血糖儀購自美國強(qiáng)生公司；高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，超低溫冰箱購自日本Sanyo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DM模型的制備與分組 45只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)抽取14只分為空白對照組(C組，n=7)和單純運動組(CE組，n=7)，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余31只給予高糖高脂喂養(yǎng)7 w后(期間死亡5只)，禁食不禁水12 h給予一次性腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L，pH4.2的枸櫞酸緩沖液中)30 mg/kg，同時C和CE組腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。72 h后用血糖儀檢測非禁食血糖>16.7 mmol/L者作為T2DM大鼠〔7〕，成功20只，隨機(jī)分為DM對照組(DM組，n=10)、DM+運動組(DME組，n=10)。

1.2.2 運動方案 采用改進(jìn)的Ploug等〔8〕游泳訓(xùn)練方案，池(100 cm×70 cm×60 cm)水深50 cm，水溫(30±2)℃。先進(jìn)行2次適應(yīng)性游泳練習(xí)，10 min/次。第1周前3 d訓(xùn)練時間分別為20 min、30 min和45 min，第4天起每天持續(xù)游泳60 min，每周運動6 d，共訓(xùn)練8 w。CE組和DME組進(jìn)行訓(xùn)練，C組和DM組不予運動。

1.2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法 實驗期間記錄大鼠一般情況及行為改變，定時稱重。分別于STZ注射前、運動8 w后禁食12 h測量各組大鼠血糖(FBG)、血清胰島素(FINS)。使用血糖儀測定FBG，ELISA測定血清FINS；胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。運動8 w后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后取下腔靜脈血，EDTA抗凝，4℃，3 000 r/min離心10 min，血漿分裝入1.5 ml EP管，-80℃凍存，用于檢測血漿血管性假性血友病因子(vWF)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)含量，然后迅速開胸腹腔，取出主動脈，做主動脈組織勻漿，檢測主動脈DAG含量以及PKC活性。ELISA測定血漿中vWF、PAI-1和胸主動脈DAG的含量以及PKC活性，測定方法均嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實驗期間由于環(huán)境和飲食改變、DM慢性疾病狀態(tài)和感染等原因?qū)е麓笫笏劳?。C組、CE組、DM組、DME組最終進(jìn)入統(tǒng)計的有效樣本量分別為6、6、7、6只。DM大鼠活動減少，體毛無光澤，多食、多飲、多尿，明顯消瘦。

2.2 各組體重的比較 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，普通飼料喂養(yǎng)大鼠體重(242.00±34.52)g,與高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重(233.30±24.87)g,無顯著差異(P>0.05)。隨著實驗的進(jìn)行，C組和CE組大鼠體重逐漸增加，DM組和DME組體重逐漸減輕，各組間無明顯差異(P>0.05)。8 w運動后，C組與CE組體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，DM組體重顯著低于C、CE組(P<0.01)；DME組體重也明顯低于C、CE組(P<0.05)，較DM組增加并不顯著(P>0.05)。見表1。

2.3 各組血糖比較 實驗期間C組和CE組的血糖均為正常水平，且組間無明顯差異(P>0.05)。在STZ注射前、開始運動前及運動后，DM和DME組的血糖水平均明顯高于C組和CE組(P<0.01或P<0.05)。開始運動前，DM組和DME組血糖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。8 w運動后，DME組的血糖較DM組明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組不同時間點體重的比較±s，g)

與C組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與CE組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.4 各組血清FINS和HOMA-IR的比較 實驗期間C組和CE組的血清FINS和HOMA-IR均未有明顯變化，且組間無顯著差異(P>0.05)。STZ注射前，DM組和DME組的血清FINS和HOMA-IR均差異不顯著(P>0.05)，仍明顯高于C組和CE組(P<0.05或P<0.01)。8 w運動后，DM組的血清FINS顯著低于C、CE組(P<0.01)，HOMA-IR顯著高于C、CE組(P<0.01)；與DM組相比，DME組的血清FINS顯著升高(P<0.01)，HOMA-IR水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組不同時間點血糖的比較

與C組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與CE組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；與DM組比較:5)P<0.05，下表同

表3 各組不同時間點FINS及HOMA-IR的比較

2.5 各組血漿vWF和PAI-1的比較 8 w運動后，C組和CE組vWF、PAI-1的水平無明顯差異(P>0.05)。DM組vWF、PAI-1的含量均顯著高于C組和CE組(P<0.01)；與DM組相比，DME組vWF、PAI-1的水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組血漿vWF、PAI-1的比較

2.6 各組胸主動脈中DAG和PKC的比較 8 w運動后，C組和CE組DAG、PKC的水平無明顯差異(P>0.05)；DM組的DAG含量明顯高于CE組(P<0.05)，PKC活性也顯著高于C、CE組(P<0.01)；而DME組的DAG、PKC水平升高不顯著(P>0.05)。DME組與DM組相比，雖然DAG水平差異并不顯著(P>0.05)，但仍表現(xiàn)出了下降的趨勢，同時PKC的活性明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組DAG、PKC的比較

3 討 論

近年來，研究表明，高血糖、高胰島素環(huán)境、氧化應(yīng)激及慢性炎癥等均會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙，血液中的一系列內(nèi)皮依賴性調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控失衡從而產(chǎn)生各種血管并發(fā)癥〔9〕。這些內(nèi)皮調(diào)節(jié)蛋白主要包括vWF、PAI-1等。研究指出，適宜的有氧運動，能有效改善局部血流動力學(xué)，增加神經(jīng)血流灌注，改善微循環(huán)，提高體內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平，減輕炎癥反應(yīng)〔10〕。這為有氧運動防治DM并發(fā)癥提供了理論依據(jù)。

本實驗采用高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射制備T2DM模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建立的T2DM大鼠模型是成功的，與國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果一致〔11～13〕。

有資料顯示〔14〕，當(dāng)血管內(nèi)皮受損時，內(nèi)皮細(xì)胞中的vWF釋放入血，與凝血因子Ⅷ結(jié)合成為載體，促進(jìn)血小板黏附并聚集于受損的血管內(nèi)皮下，啟動血栓形成的第一步。因此，血漿中的vWF升高被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能異常的標(biāo)志〔15〕。PAI-1是機(jī)體纖溶系統(tǒng)的主要生理抑制劑，其濃度增高可引起血液中纖溶作用減弱，纖維蛋白沉積，促進(jìn)血管基底膜增厚，從而加速動脈粥樣硬化及血栓形成〔16〕。臨床研究表明，T2DM患者血液處于高凝狀態(tài)，vWF 水平明顯高于健康成年人〔17〕；而患者血漿PAI-1水平升高造成纖溶活性降低是導(dǎo)致DM高凝狀態(tài)的主要因素之一〔18〕。本實驗提示8 w游泳運動能減輕T2DM大鼠內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加抗凝和纖溶能力，延緩血管病變進(jìn)程，與Montero等〔19〕報道的長期運動訓(xùn)練可以改善T2DM患者血管內(nèi)皮功能的結(jié)果一致。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠8 w時DAG-PKC通路的確處于慢性激活狀態(tài)，這與PKC途徑發(fā)病學(xué)說是吻合的。PKC通常以無活性形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)受到外界刺激時移位至細(xì)胞膜而被DAG和鈣激活〔20〕。研究表明，DM患者及動物的多種組織(如主動脈、腎小球、心臟等)中DAG含量增加〔5，21〕，其合成主要來源于從頭合成途徑，即高血糖經(jīng)酵解產(chǎn)生中間產(chǎn)物，逐步?；铣蒁AG〔22〕。細(xì)胞內(nèi)DAG的合成與釋放引起PKC的激活，造成血管基底膜增厚、通透性增加、內(nèi)皮功能異常等，這是誘發(fā)DM多種血管并發(fā)癥至關(guān)重要的一步〔5，22～24〕。Loganathan等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)8 w運動干預(yù)可以使DM大鼠心肌纖維化程度明顯減輕，同時心肌DAG含量顯著下降，而PKC-βⅡ蛋白表達(dá)及活性均無明顯變化，提示長期運動訓(xùn)練對DM大鼠心臟功能的保護(hù)作用與抑制其心肌DAG水平升高有關(guān)。Smith等〔26〕也報道，DM大鼠在8 w有氧運動后骨骼肌DAG、FAT/CD36、神經(jīng)酰胺的水平均顯著下降，從而改善IR。本研究結(jié)果表明，8 w游泳運動能通過減少細(xì)胞內(nèi)DAG合成及抑制PKC途徑的激活而減輕T2DM大鼠血管內(nèi)皮損傷。綜上所述，8 w游泳運動可降低T2DM大鼠FBG水平，改善IR，降低vWF、PAI-1水平，增加抗凝和纖溶能力，減輕DM造成的血管內(nèi)皮損傷，對內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少細(xì)胞內(nèi)DAG的合成、抑制PKC途徑的激活有關(guān)。

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〔2015-12-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

蘇全生(1958-)，男，教授，主要從事運動性疲勞的機(jī)制與恢復(fù)研究。

黃玫梅(1985-)，女，碩士，助教，主要從事運動干預(yù)與健康促進(jìn)研究。

R363

A

1005-9202(2017)08-1849-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.012

1 成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院 2 井岡山大學(xué)體育學(xué)院