苦參總堿對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

樊美玲 劉 博 王 鑫 溫富春 丁 濤 紀(jì)鳳蘭 徐惠波

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

苦參總堿對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

樊美玲 劉 博 王 鑫 溫富春 丁 濤 紀(jì)鳳蘭 徐惠波

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

目的 利用心肌缺血再灌注損傷致大鼠心肌細(xì)胞凋亡模型研究苦參總堿(TASF)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 80只雄性大鼠隨機(jī)分組，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后除空白組動(dòng)物外，其余動(dòng)物結(jié)扎左冠脈前降支30 min，再灌注6 h，通過血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，心肌病理學(xué)、電鏡、TUNEL染色及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的檢測(cè)對(duì)TASF保護(hù)心肌的作用進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果 與模型組相比，80 mg/kg TASF能夠有效降低血清中CK、LDH、AST的含量(P<0.05)，40 mg/kg TASF能夠有效降低血清中LDH、AST的含量(P<0.05)；80 mg/kg和40 mg/kg TASF能夠減少缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞；80 mg/kg TASF可以減少缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)，其機(jī)制可能與增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。結(jié)論 TASF對(duì)心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為調(diào)控Bcl-2、Bax基因表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡。

苦參總堿；缺血再灌注損傷；凋亡；心肌保護(hù)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)可通過氧自由基損傷、鈣超載等多種機(jī)制對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷，同時(shí)在此過程中，均可以引起較為嚴(yán)重的心律失常。苦參總堿(TASF)是苦參的主要活性成分之一，其藥理活性主要為抗心律失常、抗病毒，抗腫瘤等。心律寧片是TASF的中成藥制品，臨床上主要用于抗各種原因引起的心律失常的治療，對(duì)于冠心病等缺血性疾病引起的心律失常也有較好的療效〔1〕，但對(duì)于缺血再灌注過程中心肌保護(hù)等作用報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠心肌缺血再灌注致心肌細(xì)胞凋亡模型觀察TASF對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，80只，體重300～350 g，購(gòu)于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004，動(dòng)物許可證號(hào)：201500009838，201500009913，201500009998，2015000010032，201500010077，201500010697；飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)施合格證：SYXK(吉)2015-0009。

1.2 藥品 心律寧片，酒泉大得利制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：150404。地奧心血康膠囊，成都地奧制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1501065。

1.3 主要試劑與儀器 烏來糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：T20100310；肌酸激酶(CK，批號(hào)：150891)、乳酸脫氫酶(LDH，批號(hào)：160581)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號(hào)：151221)測(cè)定試劑盒，均為中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)；Bcl-2(N-19，貨號(hào)：sc-492，批號(hào)：G1315)、Bax (B-9，貨號(hào)：sc-7480，批號(hào)：H1215)、山羊抗兔IgG-HRP，山羊抗鼠(貨號(hào)：sc-2004，批號(hào)：F2215)、山羊抗鼠IgG-HRP(貨號(hào)：sc-2005，批號(hào)：H0415)；均為Santa Cruz Biotechnology Inc生產(chǎn)；In Situ Cell Death Detection Kit，Roche公司生產(chǎn)，批號(hào)：10768100。PowerLab/8S型多導(dǎo)生物記錄儀，AD Instruments公司生產(chǎn)；IMS-40型雪花形制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司生產(chǎn)；ELx800酶標(biāo)儀，BioTek Instruments,Inc生產(chǎn)；DYY-6C六一電泳儀，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；GF-D800型半自動(dòng)生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司生產(chǎn)；RM2255型高精密全自動(dòng)切片機(jī)，德國(guó)徠卡。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 雄性Wistar大鼠80只(每組10只)，隨機(jī)分為空白組、MIRI模型組、地奧心血康組(120 mg/kg)、80 mg/kg TASF組、40 mg/kg TASF組、20 mg/kg TASF組。連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后，烏來糖1.2 g/kg腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，切開氣管接人工呼吸機(jī)供開胸后進(jìn)行人工呼吸，連接八道生理記錄儀連續(xù)觀察和記錄心電圖。在胸左側(cè)第四五肋間處切開胸壁并沿胸骨左緣2 mm處切斷第四和第五肋骨，用拉鉤擠出心臟，從左心耳下方2 mm處進(jìn)針，斜穿過左冠狀動(dòng)脈前降支下心肌，從肺動(dòng)脈圓錐左緣出針，然后將心臟還回胸腔中，待恢復(fù)10～20 min，T波恢復(fù)后，將直徑2 mm、長(zhǎng)4 cm的塑料管與左冠狀動(dòng)脈前降支平行放置，用穿過冠狀動(dòng)脈的絲線將冠狀動(dòng)脈和塑料管一起接扎，造成心肌缺血，以ECGⅡ?qū)?lián)ST段明顯提高作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。心肌缺血30 min后剪斷結(jié)扎線，取下塑料管，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流6 h?？瞻捉M開胸穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，整個(gè)試驗(yàn)過程中連續(xù)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清-80℃保存，進(jìn)行CK、LDH、AST等心肌酶的檢測(cè)；取心臟，心尖用2.5%的戊二醛溶液固定進(jìn)行電鏡檢測(cè)，其余心臟分為兩份，一份10%甲醛溶液固定做病理檢查光鏡一般病理學(xué)和TUNEL染色，另一份液氮保存Western印跡法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 TASF對(duì)MIRI大鼠血清CK、LDH、AST含量的影響 與空白組相比，模型組動(dòng)物血清中的CK、LDH、AST含量顯著升高(P<0.001，P<0.01)。與模型組相比，地奧心血康120 mg/kg能夠降低MIRI大鼠血清CK的含量(P<0.01)；80 mg/kg TASF能夠降低血清中的CK、LDH、AST含量(均P<0.05)；40 mg/kg TASF能夠降低血清中的LDH、AST含量(均P<0.05)。見表1。

2.2 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌組織一般病理學(xué)的影響 空白組心臟組織結(jié)構(gòu)正常，結(jié)構(gòu)清晰，未見纖維結(jié)締組織增生，未發(fā)現(xiàn)異常，未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組心臟可見心肌纖維間質(zhì)水腫，心肌間質(zhì)疏松，少量局部心肌間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。局部心肌可見肌凝、肌溶解，心肌壞死，心肌間質(zhì)內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)出血。地奧心血康組內(nèi)心肌細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出血減少，心肌細(xì)胞局部染色不均。80 mg/kg TASF組心肌細(xì)胞間質(zhì)出血減少，少見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，效果優(yōu)于地奧心血康組。40 mg/kg TASF組心肌細(xì)胞少見染色不均，總體效果與之相似。20 mg/kg TASF組心肌細(xì)胞可見心肌細(xì)胞壞死，心肌可見多處染色不均，可見輕微炎細(xì)胞滲出，間質(zhì)出血，顯示TASF各組病理結(jié)果表現(xiàn)優(yōu)于模型組。見圖1。

2.3 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 在電鏡下觀察，空白組心肌細(xì)胞排列整齊，閏盤正常，肌絲束，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，線粒體縱行排列在肌絲束之間。與空白組相比，模型組的心肌細(xì)胞呈高度不規(guī)則形，周圍肌絲大部分消失，肌節(jié)結(jié)構(gòu)不清；線粒體增生腫脹，空化嚴(yán)重?？梢娔Ｐ徒M的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷比較嚴(yán)重。地奧心血康組心肌細(xì)胞肌節(jié)明暗帶清晰，局部線粒體增多，致密，個(gè)別線粒體嵴斷裂，基質(zhì)空化，并有脂滴夾雜在肌絲中。 80 mg/kg TASF組肌絲束上肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，局部線粒體增多且致密，表現(xiàn)與地奧心血康組類似。40 mg/kg TASF組肌絲束排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰可辨，線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量正常，表現(xiàn)較為接近空白組。20 mg/kg TASF組肌絲束排列紊亂、斷裂，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)不清，明帶消失，Z線增粗，線粒體大量增生，腫脹，空化嚴(yán)重，表現(xiàn)類似于模型組。見圖2。

表1 TASF對(duì)MIRI大鼠血清CK、LDH、AST含量及心肌細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較：1)P<0.01，2)P<0.001；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

圖1 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌病理學(xué)的影響 (HE，×400)

圖2 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響(×10 000)

2.4 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡TUNEL染色的影響 與空白組相比，模型組心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.001)。與模型組相比，120 mg/kg地奧心血康和80 mg/kg TASF能夠明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。見表1，圖3。

圖3 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的 影響 (TUNEL，×400)

2.5 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組的Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，80 mg/kg TASF能明顯增加Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)。120 mg/kg 地奧心血康和40 mg/kg TASF有一定增加的趨勢(shì)；120 mg/kg地奧心血康、80 mg/kg和40 mg/kg TASF組能降低心肌中Bax蛋白的表達(dá)(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。見圖4，表2。

1～6:空白組、模型組、地奧心血康組、80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg TASF組圖4 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌組織Bcl-2和Bax表達(dá)的影響表2 TASF對(duì)MIRI大鼠心肌組織Bcl-2和 Bax表達(dá)相對(duì)灰度的影響

組別Bcl-2Bax空白組100.0±0.00100.0±0.00模型組75.0±11.191)131.8±5.902)地奧心血康組97.1±18.44102.9±7.084)80mg/kgTASF組127.4±26.263)101.9±4.754)40mg/kgTASF組117.3±28.84110.2±13.733)20mg/kgTASF組110.2±32.30130.6±21.10

3 討 論

急性心肌缺血是冠心病的主要病理生理表現(xiàn)，表現(xiàn)為心肌組織、器官供血中斷，一定時(shí)間內(nèi)再恢復(fù)血供，缺血組織、器官不僅功能沒有恢復(fù)，反而使功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步加重。MIRI是急性心肌梗死后再灌注治療中常出現(xiàn)的病理過程，目前認(rèn)為其造成心肌損傷的機(jī)制主要是能量代謝障礙、活性氧增加，鈣超載等引起心肌細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的障礙最終影響心臟的泵血功能〔2,3〕。此外，在心肌缺血和再灌注的過程中，可引起心臟電生理活動(dòng)的異常，導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常，是冠心病患者死亡的主要原因之一。

TASF是中藥苦參的主要活性成分之一，目前已分離出的生物堿多達(dá)20多種，其中具有藥理活性的主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐胺堿、槐定堿。其主要的藥用活性成分苦參堿及氧化苦參堿均有抗心律失常的作用，且具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用。TASF目前已被開發(fā)成多種劑型的中成藥并在臨床上用于抗心律失常、抗腫瘤、抗炎的治療。心律寧片是TASF的中成藥制品，臨床上主要用于抗各種原因引起的心律失常的治療，對(duì)于冠心病等缺血性疾病引起的心律失常也有較好的療效，但對(duì)于缺血再灌注過程中心肌保護(hù)等作用報(bào)道較少。CK、LDH和AST是反映心肌細(xì)胞損傷的一般性指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示TASF具有在MIRI中保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。通過光鏡觀察心肌的大體結(jié)構(gòu)及電鏡直接觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也提供了TASF保護(hù)心肌細(xì)胞的證據(jù)。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)多種細(xì)胞凋亡的過程有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識(shí)，但是迄今為止凋亡過程確切機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為其與多種基因表達(dá)有關(guān)，如Bcl-2家族、caspase家族等〔4～8〕。MIRI與細(xì)胞凋亡也有著密切的關(guān)系，MIRI過程中可導(dǎo)致Fas/FasL系統(tǒng)、抑癌基因P53、MAPK、PI3K/PKB、JAK/STAT等多種信號(hào)通路的異常，啟動(dòng)心肌細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起心肌細(xì)胞凋亡〔9〕。大量心肌細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致心功能障礙。Bcl-2和Bax是目前比較公認(rèn)的一對(duì)調(diào)控凋亡的基因，Bcl-2的表達(dá)抑制凋亡，而Bax表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究結(jié)果顯示，TASF能夠增加MIRI動(dòng)物模型心肌中Bcl-2蛋白的表達(dá)，并抑制Bax蛋白的表達(dá)，提示其抑制心肌細(xì)胞凋亡可能與調(diào)控Bcl-2和Bax基因的表達(dá)有關(guān)。

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〔2016-12-31修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20140522040JH)

徐惠波(1963-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事心腦血管藥理研究。

樊美玲(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科基礎(chǔ)與臨床研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1840-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.008