薯蕷丸對(duì)乳腺癌化療小鼠免疫功能的影響*

賀昀，謝甦，李麗紅，趙大尉，張雲(yún)杰，關(guān)惠婷

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州 貴陽(yáng) 550004）

薯蕷丸對(duì)乳腺癌化療小鼠免疫功能的影響*

賀昀1，謝甦2，李麗紅2，趙大尉1，張雲(yún)杰1，關(guān)惠婷1

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州 貴陽(yáng) 550004）

目的 驗(yàn)證薯蕷丸改善乳腺癌小鼠化療后免疫功能的作用并探討其作用機(jī)制。方法將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、化療組和化療+中藥組，每組8只，注射4T1細(xì)胞懸液復(fù)制荷瘤模型，空白組除外。成瘤后予化療組、化療+中藥組注射多西他賽，注射后第2天化療+中藥組予中藥灌胃。21 d后處死小鼠，檢測(cè)小鼠血清中白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、γ-干擾素（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。結(jié)果與模型組比較，化療組及化療+中藥組IL-2、IFN-γ降低，TNF-α、IL-10升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與化療組比較，化療+中藥組IL-2、INF-γ升高，IL-10降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TNF-α有升高的趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論薯蕷丸可提高化療后乳腺癌小鼠的免疫功能。

薯蕷丸；乳腺癌小鼠；IL-2；IL-10；IFN-γ；TNF-α

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有120萬(wàn)婦女罹患乳腺癌[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重影響女性健康生活及生存質(zhì)量。目前乳腺癌有以手術(shù)治療為主結(jié)合放療、化療、內(nèi)分泌治療的一套較為成熟的治療方案[2]。其中，化療是一種重要的全身性治療手段，被廣泛應(yīng)用于臨床。但其具有細(xì)胞毒性作用，對(duì)正常細(xì)胞尤其是高度致敏的淋巴細(xì)胞也有殺傷作用，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降[3]。大量臨床研究表明中藥在提高機(jī)體免疫功能方面有確切的療效[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制BALB/c小鼠乳腺癌模型，采用化療及化療+中藥2種干預(yù)手段，檢測(cè)小鼠血清中白細(xì)胞介素2（Inter leukin-2，IL-2）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子 -α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素10（Interleukin-10，IL-10）的含量，探討薯蕷丸對(duì)化療后乳腺癌小鼠免疫功能的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康BALB/c小鼠，32只，雌性，6周齡，體重（20±2）g左右，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于臨床實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞株，購(gòu)買(mǎi)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 中藥方劑：薯蕷丸，組成如下：薯蕷20 g、甘草18 g、生曬參5 g、當(dāng)歸10 g、阿膠6 g、桂枝6 g、干地黃10 g、神曲10 g、川芎6 g、麥門(mén)冬5 g、芍藥5 g、白術(shù)5 g、杏仁5 g、柴胡6 g、桔梗5 g、茯苓5 g、干姜3 g、白蘞3 g、防風(fēng)5 g、大豆卷6 g、大棗30 g，藥材購(gòu)買(mǎi)于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。根據(jù)“人與動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表”換算小鼠的用量，一次取5 d的藥量進(jìn)行煎熬，具體煎藥步驟如下：向人工智能電煎藥砂鍋中加入300ml水，浸泡30min，將煎好的藥液濃縮至12ml左右，相當(dāng)于1.50 g生藥/ml的濃度，置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩；熕幬铮憾辔魉悾ńK奧賽康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20150101）購(gòu)買(mǎi)于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)GIBCO公司，IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京超研生物有限公司，批號(hào)：201508。

1.2 方法

1.2.1 分組 將32只BABL/c小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、化療組和化療+中藥組，每組8只。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)4T1乳腺癌細(xì)胞株，使用含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基、置37℃、5%的二氧化碳CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%～95%予以傳代。

1.2.3 復(fù)制動(dòng)物模型 取對(duì)數(shù)期的4T1乳腺癌細(xì)胞，用PBS緩沖液將細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×107個(gè)/ml，取細(xì)胞懸液0.1ml，皮下接種于小鼠左側(cè)腹部[7]，予空白組小鼠相同部位注射等量生理鹽水。7 d左右即可形成5mm×5mm左右的腫塊。

1.2.4 給藥、觀察 成瘤后第7天下午，予化療組、化療+中藥組腹腔注射多西他賽6.28mg/kg共1次（用生理鹽水補(bǔ)滿(mǎn)0.1ml）[8]，余兩組腹腔注射0.1ml生理鹽水。于注射后第2天，化療+中藥組每天上午予0.3ml中藥灌胃，其余3組予0.3ml生理鹽水灌胃，給藥周期為21 d。

1.2.5 處死、取樣 在全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，化療組及化療+中藥組各有1只老鼠因灌胃操作不當(dāng)而死亡，此外在取血過(guò)程中，化療+中藥組的1只老鼠因掙扎劇烈，導(dǎo)致取血失敗。脫臼（頸）處死小鼠（處死前天晚上予小鼠禁食）。取小鼠眼球靜脈血，固定小鼠，將眼球上方的皮膚上提，充分暴露眼球，用眼球剪迅速剪掉眼球，血滴入標(biāo)記好的離心管中，將每只小鼠的血分別裝好靜置20min后，離心（3 000 r/min 4℃10min），取血清，備用。

1.2.6 指標(biāo)檢測(cè) ELISA檢測(cè)各組IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)。取血清，備用。洗液洗酶孔板，設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔，每孔加樣本稀釋液40μl，再加待測(cè)樣品10μl，封板膜封板，37℃溫育30min，洗板，每孔加酶標(biāo)試劑50μl（空白孔除外），封板，37℃溫育30 min，洗板，每孔先加A顯色劑50μl，再加B顯色劑50μl，震蕩混勻，37℃避光顯色15min，加終止液50μl。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（OD值）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α的濃度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS.19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織HE染色結(jié)果

病理切片顯示：癌細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，核大，核仁染色深，核漿比率大，分裂活躍，呈實(shí)性片狀彌漫性分布，少數(shù)呈腺腔樣（由紅色箭頭所示），浸入周?chē)M織及橫紋肌，部分伴壞死。提示：腫塊為癌變組織，復(fù)制模型成功。見(jiàn)圖1、2。

2.2 IL-2、TNF-α及IFN-γ含量的表達(dá)

如表1所示：與空白組比較，模型組IL-2（P=0.015）、IFN-γ（P=0.027）、TNF-α（P=0.000）含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，化療組及化療+中藥組IL-2（P=0.000和0.002）、IFN-γ（P=0.000和0.032）含量降低，TNF-α（P=0.002和0.001）含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與化療組比較，化療+中藥組IL-2（P=0.011）、IFN-γ（P=0.044）含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α（P=0.563）含量有升高的趨勢(shì)但不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明小鼠在罹患乳腺癌后，免疫功能下降，予以化療單獨(dú)治療后，小鼠免疫功能進(jìn)一步下降，加用中藥治療能有效地提高小鼠免疫功能，而TNF-α含量的升高可能與多西他賽能作用于腫瘤壞死因子受體，促進(jìn)TNF-α有關(guān)。

圖1 小鼠腫瘤組織染色結(jié)果 （HE染色×100）

圖2 小鼠腫瘤組織染色結(jié)果 （HE染色×200）

表1 各組小鼠血清IL-2、TNF-α、INF-γ含量的表達(dá) （pg/ml，±s）

表1 各組小鼠血清IL-2、TNF-α、INF-γ含量的表達(dá) （pg/ml，±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與化療組比較，P＜0.05

組別IL-2IFN-γTNF-α空白組（n=8） 31.48±1.12 1 570.08±179.11 581.53±110.27模型組（n=8） 29.56±1.591） 1 363.32±187.251） 353.58±93.471）化療組（n=7） 24.76±1.531）2） 941.91±161.731）2） 531.77±107.982）化療+中藥組（n=6）F值P值26.94±1.441）2）3）31.022 0.000 1 148.62±169.071）2）3）17.660 0.000 564.75±88.752）8.366 0.001

2.3 IL-10含量的表達(dá)

如表2所示：與空白組比較，模型組IL-10（P=0.026）的含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，化療組及化療+中藥組IL-10（P=0.000和0.013）含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與化療組比較，化療+中藥組IL-10（P=0.039）的含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果說(shuō)明小鼠在罹患乳腺癌后，血清中IL-10的含量升高，免疫功能下降，化療進(jìn)一步加重此趨勢(shì)，在服用中藥治療后能有效地降低小鼠血清IL-10的含量，從而改善小鼠的免疫功能。

表2 各組小鼠血清IL-10含量的表達(dá) （pg/ml，±s）

表2 各組小鼠血清IL-10含量的表達(dá) （pg/ml，±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與化療組比較，P＜0.05

組別IL-10空白組（n=8） 643.39±65.87模型組（n=8） 732.13±89.301）化療組（n=7） 911.51±72.461）2）化療+中藥組（n=6）F值P值840.36±67.701）2）3）20.747 0.000

3 討論

乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤[9]，越來(lái)越多的研究者認(rèn)識(shí)到機(jī)體免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展與有著密切的關(guān)系。機(jī)體抗腫瘤免疫主要是以細(xì)胞免疫為主，尤以T細(xì)胞最為重要[10]。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫而增加機(jī)體抗腫瘤的免疫效應(yīng)。其中IL-2、IFN-γ都可激活單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞殺瘤活性的分泌，從而加強(qiáng)了機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)[11]；TNF-α可直接殺傷或抑制某些腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞DNA斷裂，細(xì)胞萎縮死亡，而達(dá)到抗腫瘤的效果；Th2細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL-10等免疫抑制性細(xì)胞因子，并直接拮抗IL-2、IFN-γ、TNF-α等Th1型細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞免疫起抑制性作用[12-13]。有研究表明[13-14]，乳腺癌患者血清中Th2型細(xì)胞因子IL-10呈高表達(dá)，Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α呈低表達(dá)，而化療會(huì)加重這一趨勢(shì)。IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10含量的高低與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。故本實(shí)驗(yàn)選用這幾個(gè)指標(biāo)觀察中藥是否能改善乳腺癌小鼠化療后免疫功能。

乳腺癌在中醫(yī)學(xué)中屬于“乳巖”“乳癖”范疇[15]，歷代醫(yī)家認(rèn)為乳腺癌發(fā)生以正氣不足，氣血虧虛為本，風(fēng)邪痰毒瘀阻于乳絡(luò)而發(fā)病，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。“癌毒”為有形之邪其發(fā)展進(jìn)一步耗氣傷血。而化療作為“藥毒”之邪，在祛邪的同時(shí)又會(huì)加重臟腑機(jī)能及氣血陰陽(yáng)的損傷。在機(jī)體本虛、癌毒、藥毒這三重因素的疊加之下機(jī)體始終處于一個(gè)臟腑功能受損、氣血陰陽(yáng)失衡的狀態(tài)。機(jī)體氣血陰陽(yáng)的失調(diào)及臟腑虧損又進(jìn)一步導(dǎo)致有形之邪氣滯、痰凝、血瘀、毒蘊(yùn)的積聚。因而乳腺癌患者在化療后呈現(xiàn)出正氣不足、氣血虧虛、虛實(shí)夾雜、易感外邪的復(fù)雜病因病機(jī)。這一病機(jī)主線始終貫穿在乳腺癌化療患者的病程中。此時(shí)單純補(bǔ)虛又恐留邪，單純攻邪又恐虛不受補(bǔ)，薯蕷丸作為復(fù)方大法的典范，其理法方藥切合了乳腺癌化療后患者所呈現(xiàn)出來(lái)復(fù)雜的病因病機(jī)。薯蕷丸出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》是治虛勞的主方[16]，其以薯蕷為君，立足脾胃；其方含四君子、四物湯、理中湯及桂枝、柴胡、防風(fēng)以祛三陽(yáng)之外邪，桔梗、白蘞、杏仁調(diào)暢氣機(jī)使氣血生化有源、氣機(jī)升降有條，營(yíng)衛(wèi)調(diào)和，外邪得散。在臨床的應(yīng)中，因?yàn)榛熀蠡颊弑憩F(xiàn)出來(lái)的證型復(fù)雜、選方用藥太多而忽略了乳腺癌患者化療后這一復(fù)雜的病機(jī)主線，從而造成臨床選方用藥的雜亂無(wú)章，療效不一，影響中醫(yī)藥對(duì)乳腺癌相關(guān)治療的臨床研究，而將薯蕷丸作為針對(duì)乳腺癌患者化療后復(fù)雜病機(jī)的一個(gè)主方進(jìn)行加減，有利于凝練出針對(duì)乳腺癌化療患者的有效方劑。

本實(shí)驗(yàn)研究表明薯蕷丸可通過(guò)提高血清IL-2、IFN-γ含量及降低IL-10含量有效地改善化療后乳腺癌小鼠免疫功能，為臨床治療乳腺癌化療免疫功能低下患者提供用藥依據(jù)。

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（張蕾 編輯）

Effect of Dioscorea pills on immunity ofm ice receiving chemotherapy for breast cancer*

Yun He1,Su Xie2,Li-hong Li2,Da-weiZhao1,Yun-jie Zhang1,Hui-tingGuan1
(1.Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China;2.The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China)

ObjectiveTo observe the effect of Dioscorea pills on the immunity ofmice with breast cancer after chemotherapy and itsmechanism of action.MethodsBALB/c mice were randomly divided into blank group,model group,chemotherapy group and chemotherapy plus TCM group with 8 mice in each group.Except the blank group, 24mice in other groupswere subcutaneously injected with 4T1 breast cancer cell suspension at the left abdomen to build a tumor-bearing mouse model.After tumor formation,the chemotherapy group and the chemotherapy plus TCM group were intraperitoneally injected with Docetaxel.Two days later,the chemotherapy plus TCM group was given Dioscorea pills by gavage,while the other three groups were given equal quantity of normal saline.Allmice were sacrificed 21 days after treatment.The serum levels of IL-2,IL-10,IFN-γand TNF-αwere measured.ResultsCompared with the model group,the levels of IL-2 and IFN-γof the chemotherapy group and the chemotherapy plus TCM group were significantly decreased,while the levels of TNF-αand IL-10 were significantly increased(P＜0.05).Compared with the chemotherapy group,the levels of IL-2 and INF-γof the chemotherapy plus TCM group were greatly increased,while the level of IL-10 was significantly decreased(P＜0.05);the level of TNF-αwas slightly increased without significant difference(P＞0.05).ConclusionsDioscorea pills can improve the immunity ofmicewith breast cancer after chemotherapy.

Dioscorea pill;mouse with breast cancer;IL-2;IL-10;IFN-γ;TNF-α

R-332；R 737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.002

1005-8982（2017）07-0005-04

2016-08-10

貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題基金（No：QZYY-2015-155）；貴州省科技廳聯(lián)合基金（黔科合LH字[2014]7110）

謝甦，Tel：13985506996，E-mail：972254428@qq.com