燈盞細(xì)辛注射液對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔炎癥反應(yīng)的影響

蘇 懿， 蔡海榮， 黃永蓮， 黃鉅明

燈盞細(xì)辛注射液對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔炎癥反應(yīng)的影響

蘇 懿1， 蔡海榮1， 黃永蓮2， 黃鉅明3

目的 觀察燈盞細(xì)辛注射液對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔炎癥反應(yīng)的抑制作用，探討其抑制動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。方法 健康SD雄性家兔隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，模型組采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合耳緣靜脈注射小牛血清白蛋白方法建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，飼養(yǎng)10 w后，隨機(jī)抽取6只進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)，明確動(dòng)脈粥樣斑塊形成。然后把模型組隨機(jī)分為高脂組(100 g/d)和燈盞細(xì)辛組[5 ml/(kg·d)腹腔注射]。實(shí)驗(yàn)10 w、18 w取血清，ELISA法測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的水平，組織形態(tài)學(xué)方法分析動(dòng)脈粥樣硬化斑塊情況。結(jié)果 第10周，高脂組和燈盞細(xì)辛組血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯高于對(duì)照組，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊明顯形成;第18周，燈盞細(xì)辛組血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯低于高脂組，動(dòng)脈粥樣斑塊明顯減輕。結(jié)論 燈盞細(xì)辛注射液具有抑制、延緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的作用，可能與降低TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1的分泌有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化； 家兔； 燈盞細(xì)辛注射液； 炎癥反應(yīng)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一組稱為動(dòng)脈硬化的血管病中常見(jiàn)而最重要的一種，其最主要的病理特征是動(dòng)脈管壁增厚變硬，失去彈性和官腔縮小，最終發(fā)展為腦梗死、心肌梗死等心腦血管疾病，預(yù)后不佳。心腦血管疾病具有發(fā)病率高、致死率高、致殘率高的特點(diǎn)，已經(jīng)成為我國(guó)乃至全球死亡的主要原因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，積極干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)防治心腦血管疾病具有重要的意義。動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學(xué)“瘀血”、“痰濁”等范疇[2]，燈盞細(xì)辛注射液由燈盞細(xì)辛提取而成，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的作用，臨床廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病，療效顯著。研究結(jié)果表明，燈盞細(xì)辛注射液可以降低腦梗死的死亡率[3]、冠心病的死亡率[4]，改善不穩(wěn)定型心絞痛的療效和癥狀[5，6]，但其機(jī)制尚未闡明。為探討燈盞細(xì)辛注射抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用和機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了家兔動(dòng)脈粥樣硬化模型[7～9]，并用燈盞細(xì)辛注射液進(jìn)行干預(yù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 健康新西蘭雄性家兔36只，體重在2.5～3.0 Kg之間，平均體重為(2.7±0.5)Kg，由廣州花都東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[許可證號(hào)為SYXK(粵)2014-0023]。小牛血清白蛋白(廣州瑞舒生物科技有限公司)，燈盞細(xì)辛注射液(云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20090641)，普通飼料(廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，高脂飼料(膽固醇2%、豬油5%、0.2%丙基硫氧嘧啶、蛋黃5%、89.8%的普通飼料，由廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心養(yǎng)殖場(chǎng)配制生產(chǎn))。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化模型建立 所有家兔均在造模前給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后隨機(jī)分為對(duì)照組(n=12)、模型組(n=12)和燈盞組(n=12)，每只分籠喂養(yǎng)。模型組和燈盞組在分組后第一天經(jīng)耳緣靜脈注射小牛血清白蛋白溶液(250 mg/Kg+生理鹽水10 ml)，而對(duì)照組一次性經(jīng)耳緣靜脈注射等量的生理鹽水10 ml。隨后對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)(100 g/d)，模型組和燈盞組給予高脂飼料喂養(yǎng)，兩組日進(jìn)食量相等(100 g/d)，共喂養(yǎng)10 w。10 w后每組隨機(jī)選取家兔2只，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞致死后取髂外動(dòng)脈2 cm后經(jīng)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察明確動(dòng)脈斑塊形成。隨后，對(duì)照組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)(100 g/d)、模型組和燈盞組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)(100 g/d)，同時(shí)燈盞組經(jīng)腹腔注射燈盞細(xì)辛注射液(5 ml/kg/d)，而對(duì)照組和模型組經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5 ml/kg/d)。繼續(xù)共喂養(yǎng)8 w。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 采血前禁食不禁飲10 h，分別在實(shí)驗(yàn)前、10 w、18 w經(jīng)家兔耳緣靜脈取血，運(yùn)用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平(由金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行檢測(cè))。

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞致死后，立即開(kāi)服取左側(cè)髂外動(dòng)脈2 cm，先2.5%戊二醛，磷酸液緩沖液沖洗，1%鋨酸固定，石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件

2 結(jié) 果

2.1 血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平的變化 10 w時(shí)，對(duì)照組家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯低于模型組和燈盞組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.05)；模型組和燈盞組之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。18 w時(shí)，對(duì)照組血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平低于模型組和燈盞組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.05)；模型組家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯高于燈盞組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 各組病理形態(tài)學(xué)改變 家兔髂外動(dòng)脈病理切片結(jié)果示：18 w時(shí)，對(duì)照組家兔可見(jiàn)血管內(nèi)膜的內(nèi)彈性膜、中膜的彈力纖維和外膜的疏松結(jié)締組織。高脂組家兔可見(jiàn)中膜平滑肌細(xì)胞增生明顯，管壁明顯增厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞下聚集了大量泡沫細(xì)胞，形成一個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。燈盞細(xì)辛組圖中血管內(nèi)皮細(xì)胞下有少量泡沫細(xì)胞形成，中膜平滑肌細(xì)胞增生，平滑肌細(xì)胞中可見(jiàn)脂肪小泡，未見(jiàn)明顯斑塊形成，AS病變較高脂組明顯減輕(見(jiàn)圖1)。

2.2.2 各組組織超微結(jié)構(gòu)改變 家兔髂外動(dòng)脈病理組織超微結(jié)構(gòu)結(jié)果示：18 w時(shí)，對(duì)照組圖中可見(jiàn)一橫切的平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞核呈橢圓形，胞漿中可見(jiàn)密體和線粒體等結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)明顯病理改變。高脂組家兔可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞核周圍有大量脂滴小泡，在細(xì)胞膜下可見(jiàn)吞飲小泡，胞漿中可見(jiàn)密體等結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核外形不規(guī)則，核中常染色質(zhì)較多，異染色質(zhì)聚集在核膜周邊，在細(xì)胞周圍可見(jiàn)增生的膠原纖維，AS病變明顯。

燈盞細(xì)辛組圖中可見(jiàn)一平滑肌細(xì)胞，胞漿中可見(jiàn)線粒體和密體等結(jié)構(gòu)，有少量脂滴小泡，細(xì)胞和周圍平滑肌細(xì)胞聯(lián)系不太緊密，結(jié)締組織增生輕微。AS病變較高脂組明顯減輕(見(jiàn)圖2)。

表1 各組家兔TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平的變化

與對(duì)照組相比*P<0.05；與高脂組相比#P<0.05

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，主要累及大動(dòng)脈(如主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和髂動(dòng)脈)和中動(dòng)脈(如冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈)，初期血管壁出現(xiàn)脂質(zhì)條紋，并發(fā)展為纖維斑塊，最終發(fā)展為心腦血管疾病。AS是一種由多種因素引起的疾病[10]，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)較多，而得到較大范圍認(rèn)可的是損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)。損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)[11～13]認(rèn)為各種危險(xiǎn)因素對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮的損傷和脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜層的聚集，導(dǎo)致動(dòng)脈壁的炎癥反應(yīng)，逐漸形成粥樣斑塊。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展和最終形成不穩(wěn)定斑塊的基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)可以分為急性炎癥反應(yīng)和慢性炎癥反應(yīng)。

在動(dòng)脈粥樣硬化的早期[14]，高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖等心腦血管疾病的危險(xiǎn)因子損傷血管內(nèi)皮，致血清低密度脂蛋白進(jìn)入并滯留在動(dòng)脈內(nèi)膜，進(jìn)而被氧化修飾。氧化LDL分子誘導(dǎo)內(nèi)皮表達(dá)分泌粘附因子并刺激單核細(xì)胞聚集到內(nèi)膜，然后單核細(xì)胞在MCP-1的趨化作用下進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)壁并分化成巨噬細(xì)胞，稀釋細(xì)胞吞噬氧化LDL形成泡沫細(xì)胞。同時(shí)各種因素包括血流切應(yīng)力的湍流、糖化終末產(chǎn)物、一氧化氮、免疫復(fù)合物等引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，刺激巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥介質(zhì)和生長(zhǎng)因子，包括腫瘤壞死因子、白介素，促進(jìn)斑塊的生長(zhǎng)和炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。

在動(dòng)脈粥樣斑塊的晚期階段，血管內(nèi)皮中白細(xì)胞介素含量豐富，其可以活化巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致血管慢性修復(fù)反應(yīng)[15]。當(dāng)血液循環(huán)中各種炎癥介質(zhì)明顯增多，可以加快斑塊的進(jìn)程，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，MMP可以降解纖維帽，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定、斑塊碎裂，同時(shí)炎癥因子可以激活凝血進(jìn)程，促進(jìn)血小板等聚集，致斑塊破裂、血栓形成，最終發(fā)生為腦卒中、冠心病等心腦血管疾病[16,17]。

TNF-α 具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)巨噬細(xì)胞生成、誘導(dǎo)粘附因子分泌、促進(jìn)血管新生、血栓形成、使斑塊不穩(wěn)定等作用，是AS病變過(guò)程中重要的炎癥因子[18]。MCP-1具有活化巨噬細(xì)胞等炎癥反映細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)AS形成的作用。CRP可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，刺激其表達(dá)炎癥因子和抑制其修復(fù)，從而促進(jìn)AS形成。IL-6可以導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞遷移形成巨噬細(xì)胞，激活凝血功能促進(jìn)血栓形成，誘導(dǎo)AS形成高脂喂養(yǎng)聯(lián)合靜脈注射小牛血清白蛋白是建立AS經(jīng)典的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚19]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合耳緣靜脈注射小牛血清白蛋白可以使家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平升高，并形成動(dòng)脈粥樣斑塊，升高成功建立了AS模型。而燈盞細(xì)辛注射液可以降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平，并且可以使血管內(nèi)壁的纖維斑塊縮小，延緩AS斑塊的進(jìn)展。

綜上所述，燈盞細(xì)辛注射液可能通過(guò)降低血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

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The effects of Dengzhanxixin injection on inflammation in atherosclerosis rabbit Model

SUYi，CAIHairong，HUANGYonglian，etal.

(FoshanHospitalofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)oshan528000,China)

Objective To observe the effects of Dengzhanxixin injection on inflammation in experimental atherosclerosis rabbits and explore its possible mechanism.Methods The healthy male SD rabbits were randomly divided into normal control group and the model group.The model group established an atherosclerosis model by feeding high-fat diet plus injecting bovine serum albumin in rabbits.Then twenty rabbites of the model group were randomly divided into high-cholesterol group (100 g/d) and the Dengzhanxixin group[5 ml/(kg·d) by intraperitoneal injection].The plaque of left iliac artery was performed with histomorphometry analysis.Serum TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1 were detected with standard enzymatic assays.Results At 10 weeks,the levels of TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1 in the high-cholesterol group and the Dengzhanxixin group were significantly higher than those in the control group,tatherosclerotic plaques was formed.At 18 weeks,the levels of TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1 in the Dengzhanxixin group were significantly lower than those in the high-cholesterol group,and the plaques were reduced significantly.Conclusion The study suggests that Dengzhanxixin injection could decrease atherosclerosis in atherosclerotic rabbit model by decreasing the secretion of TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1.

Atherosclerosis； Rabbits； Dengzhanxixin injection； Inflammation

A：對(duì)照組 B：高脂組 C：燈盞細(xì)辛組

A：對(duì)照組 B：高脂組 C：燈盞細(xì)辛組

1003-2754(2017)04-0342-04

2016-12-13；

2017-01-30

(1.佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518172；3.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800)

蔡海榮，E-mail：chr153426@126.com

R743.1

A