染色體9p21.3多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊和神經(jīng)功能缺損的相關(guān)性探討

孫家蘭， 楊 康， 黃 澍， 胡榮郭， 傅 毅， 李龍宣

染色體9p21.3多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊和神經(jīng)功能缺損的相關(guān)性探討

孫家蘭1， 楊 康2， 黃 澍1， 胡榮郭1， 傅 毅2， 李龍宣1

目的 探討中國漢族人群急性腦梗死患者染色體9p21.3基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊、神經(jīng)功能缺損的相關(guān)性。方法 采用回顧性病例對(duì)照研究，556例急性缺血性卒中病例(無斑塊為對(duì)照組231例、單斑塊組67例、多斑塊組258例)，根據(jù)美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)進(jìn)行評(píng)分，頸動(dòng)脈超聲檢測頸動(dòng)脈斑塊。用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果 斑塊組的平均住院天數(shù)明顯多于無斑塊組(P<0.05)。頸動(dòng)脈斑塊與入院時(shí)的NIHSS評(píng)分之間呈正相關(guān)(P<0.05)。無論是在小于等于65歲還是超過65歲兩個(gè)年齡段，9p21區(qū)帶上所有6個(gè)SNPs(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)的等位基因頻率分布在無斑塊組(對(duì)照組)與斑塊組均無顯著性意義(P>0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈斑塊的存在導(dǎo)致嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損(P<0.001；OR=2.29；95%CI=1.54～3.40)。單斑組、多斑組患者對(duì)神經(jīng)功能缺損的影響分別為無斑塊組的1.87倍(95%CI，1.02～3.42；P=0.043)和2.42倍(95%CI，1.59-3.66；P<0.001)，而頸動(dòng)脈斑塊的面積大小與神經(jīng)功能缺損無明顯相關(guān)性。結(jié)論 6個(gè)9p21.3區(qū)域SNP位點(diǎn)與頸動(dòng)脈粥樣硬化之間無關(guān)聯(lián)性；急性腦梗死發(fā)病期有頸動(dòng)脈斑塊的患者有更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。

急性腦梗死； 9p21.3多態(tài)性； 頸動(dòng)脈斑塊； 神經(jīng)功能缺損

腦梗死(cerebral infarction，CI)是指各種原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙，包括動(dòng)脈粥樣硬化性腦血栓形成、腦栓塞、腔隙性腦梗死等。越來越多的研究顯示腦梗死的發(fā)生可能與特定的基因多態(tài)性有關(guān)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)9p21.3號(hào)染色體上單核苷酸多態(tài)性(SNPs)也是腦梗死的危險(xiǎn)因素[2]，是頸動(dòng)脈斑塊形態(tài)的相關(guān)因素[3]，包括出現(xiàn)有無斑塊、斑塊面積和體積。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成會(huì)增加卒中風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，我們采用病例對(duì)照研究方法研究了上海市四家醫(yī)院9p21.3基因相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊的相關(guān)性，且探討動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與入院時(shí)神經(jīng)功能缺損之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料 我們回顧性地共納入從2012年10月-2015年12月來自上海四家醫(yī)院(上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院)556例首次急性腦梗死患者(見表1)，根據(jù)中國急性腦梗死指南2010[4]。所有卒中患者經(jīng)頭部計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)/磁共振成像(MRI)。急性期腦梗死的定義如下：(1)急性局灶性或整體性神經(jīng)功能缺損的發(fā)生持續(xù)24 h或更長時(shí)間，CT或MRI有腦缺血損害的證據(jù)；(2)CT或MRI掃描無顱內(nèi)出血。除外原發(fā)性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移、硬膜下血腫、癲癇發(fā)作后癱瘓、腦外傷或全身性疾病(感染、肝臟或腎臟疾病)。高血壓被定義為使用降壓藥物或基線血壓≥140/90 mmHg。糖尿病被定義為空腹血糖≥7.0 mmol/L或使用降糖藥物。頸動(dòng)脈斑塊定義為頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)≥1.5 mm，進(jìn)行頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲檢查在普通/頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈的最大斑塊面積(mm2)是由所有頸動(dòng)脈斑塊的最大軸線長度相乘估計(jì)[5]。我們還進(jìn)行了分層分析，將556例腦梗死患者根據(jù)超聲檢測到的頸動(dòng)脈斑塊的數(shù)量分成：無斑塊組、單斑塊組或多個(gè)斑塊組。在556例患者中，無斑塊組231例(41.5%)，單斑塊組67例(12.1%)，多斑塊組258例(46.4%)。無斑塊組男性占62.8%、單斑塊組男性占65.7%、多斑塊組男性占65.1%。同時(shí)根據(jù)國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分，結(jié)果分為輕度(NIHSS≤3)和中重度(NIHSS≥4)[6,7]。所有患者均按照急性腦梗死治療指南接受治療。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的年齡分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，我們將所有腦梗死患者分為兩組：年輕組(≤65歲)和老年組(>65歲)。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究群體在各基因位點(diǎn)上的分布頻率均符合遺傳平衡，具有群體代表性，且經(jīng)LDR均檢測出野生型、純合和雜合變異型3種基因型。

1.2 方法 所有被檢者禁食12 h，晨起空腹抽取靜脈血5 ml，在EDTA抗凝管中混勻，其中，2 ml用作DNA提?。涣? ml靜脈血分離作血清血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)測定，并記錄血壓和相關(guān)臨床資料。采用酚氯仿法提取全血基因組DNA，通過引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express、Oligo進(jìn)行引物構(gòu)建(見表1)，再經(jīng)PCR-LDR檢測并進(jìn)行基因SNPs分型。多重PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)總體積為20 μl。擴(kuò)增步驟：95 ℃預(yù)變性120 s，然后按94 ℃ 30 s、50 ℃ 90 s、65 ℃ 60 s共35循環(huán)，最后65 ℃延長至10 min；循環(huán)結(jié)束后，取2 μl反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)。多重LDR反應(yīng)：LDR反應(yīng)總體積為10 μl。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性120 s，然后按94 ℃ 15 s、50 ℃ 25 s共40循環(huán)。后各取1 μl LDR連接產(chǎn)物與1 μl ABI GS-500 ROX熒光標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)和1 μl去離子甲酰胺上樣液混合，95 ℃加熱變性2 min，置于冰水混合物上急速冷卻。LDR產(chǎn)物測序電泳并分析：使用PRISM 3730型DNA測序儀，于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中進(jìn)行3000V毛細(xì)管電泳2.5 h；采用GENESCANTM672軟件、Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集并進(jìn)行SNPs位點(diǎn)的基因分型。PCR產(chǎn)物核苷酸序列測定：隨機(jī)選取上述染色體9p21.3片段6個(gè)位點(diǎn)的野生型、純合和雜合變異型PCR產(chǎn)物各2例，由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司直接測序驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(Vrsion 18.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，先行單因素分析篩查可能的危險(xiǎn)因素變量再引入多因素分析。計(jì)量資料的比較采用正態(tài)分布性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)于正態(tài)分布資料，使用t檢驗(yàn)；對(duì)于偏態(tài)分布資料，使用Mann-WhitneyU法檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算等位基因和基因型頻率。再通過多元Logistic回歸模型，分析校正年齡、性別、高血壓等暴露因素后的比值比(odds ratio，OR)及95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)，對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的位點(diǎn)建立遺傳模型分析易感性并探討基因交互作用。統(tǒng)計(jì)效能，α雙側(cè)=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 有斑塊組患者空腹血糖和收縮壓數(shù)據(jù)值較高 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。但是3組之間的高血壓和血脂數(shù)據(jù)無顯著差異性(P>0.05)。入院時(shí)，斑塊組比無斑塊組有較高的NIHSS評(píng)分，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(4.75±5.14 vs 3.10±4.37，P<0.05)，但單個(gè)和多個(gè)斑塊組之間的NIHSS評(píng)分(4.78±5.28 vs 4.74±5.12)無顯著差異。斑塊組的平均住院天數(shù)明顯多于無斑塊組(P<0.05)。頸動(dòng)脈斑塊與入院時(shí)的NIHSS評(píng)分之間的呈正相關(guān)(P<0.05)(見表2)。

2.2 無論是在小于等于65歲還是超過65歲兩個(gè)年齡段，9p21區(qū)帶上所有6個(gè)SNPs(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)的等位基因頻率分布在無斑塊組(對(duì)照組)與斑塊組均無顯著性意義(P>0.05)(見表3)。

2.3 為了排除多種危險(xiǎn)因素和卒中亞型的影響 我們采用Logistic回歸方法研究斑塊對(duì)入院時(shí)神經(jīng)功能缺損的影響，發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈斑塊的存在導(dǎo)致嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損(P<0.001；OR=2.29；95%CI=1.54～3.40)。單斑組、多斑組患者對(duì)神經(jīng)功能缺損的影響分別為無斑塊組的1.87倍(95%CI，1.02～3.42；P=0.043)和2.42倍(95%CI，1.59～3.66；P<0.001)(見表4)。

表1 6個(gè)位點(diǎn)的基因庫序列號(hào)、引物序列和PCR長度

表2 腦梗死患者中無斑塊組、單個(gè)斑塊組和多個(gè)斑塊組的一般資料

表3 急性腦梗死患者9p21基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊的關(guān)系

表4 急性腦梗塞患者神經(jīng)功能缺損與頸動(dòng)脈斑塊的關(guān)系

3 討 論

rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207這6個(gè)位點(diǎn)集中在9號(hào)染色體長臂21.3區(qū)域一段長約100 kb的DNA序列內(nèi)，與兩個(gè)已知的抑癌基因-細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子2A和2B(cyclin-dependent kinase inhibitors 2A and 2B，CDKN2A and CDKN2B)處于同一連鎖不平衡結(jié)構(gòu)域中。CDKN2A和CDKN2B分別編碼CDK4(INK4)家族中的p16INK4a和pl5INK4b及一個(gè)與家族抑制子完全無關(guān)的蛋白p14ARF，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、衰老及凋亡都起著重要作用，并能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，可能與既往造成AS的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的發(fā)生機(jī)制有所不同[8]。

許多研究證實(shí)染色體9p21.3的基因多態(tài)性對(duì)腦梗死的作用[9]。同樣，也有幾項(xiàng)研究已經(jīng)驗(yàn)證了9p21.3基因突變與頸動(dòng)脈斑塊的相關(guān)性。有文獻(xiàn)報(bào)道，老年患者(>65歲)中rs1333049的C等位基因增加頸動(dòng)脈斑塊風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.24倍(95%CI，1.13～1.36；P<0.001)[10]。Lin等還發(fā)現(xiàn)rs2383207的G等位基因比C等位基因明顯增加頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度(P=0.007)，但只限男性而不是女性[11]。然而急性腦梗死患者9p21.3基因多態(tài)性和頸動(dòng)脈斑塊之間的關(guān)系目前尚不清楚。本研究中，9p21.3區(qū)域6個(gè)SNP位點(diǎn)與頸動(dòng)脈粥樣硬化之間無關(guān)聯(lián)性。我們還發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死發(fā)病期有頸動(dòng)脈斑塊的患者有更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。

我們的研究表明頸動(dòng)脈斑塊與急性腦梗死發(fā)病時(shí)的神經(jīng)功能缺損有關(guān)。另一項(xiàng)研究顯示頸動(dòng)脈狹窄的程度是預(yù)測腦梗死癥狀的唯一依據(jù)[12]。在我們的結(jié)果中，頸動(dòng)脈斑塊與急性腦梗死的嚴(yán)重程度有關(guān)。然而，斑塊面積大小對(duì)急性腦梗死嚴(yán)重程度沒有預(yù)測價(jià)值。

總之，我們探討了9p21.3區(qū)域的基因多態(tài)性(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)這6個(gè)位點(diǎn)在急性腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化中的風(fēng)險(xiǎn)作用，急性腦梗死發(fā)作時(shí)頸動(dòng)脈斑塊與神經(jīng)功能缺損有關(guān)，頸動(dòng)脈斑塊的面積大小與神經(jīng)功能缺損無明顯相關(guān)性。但結(jié)論僅局限于小范圍四家醫(yī)院的人群和樣本的病例對(duì)照研究，以后應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行相關(guān)前瞻性研究。

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Carotid plaques are associated with variants on Chromosome 9p21.3and neurological dysfunction in acute ischemic stroke

SUNJialan,YANGKang,HUANGShu,etal.

(DeptmentofNeurology,GongliHospital,PudongNewArea,Shanghai200135,China)

Objective To investigate the relationship between chromosome 9p21.3 gene polymorphism and carotid plaques,the correlation with nerve function defect in Chinese han population with acute cerebral infarction.Methods A retrospective case-control study was conducted,including 556 cases of acute ischemic stroke (no plaque for the control group,231 cases,single plaque group,67 cases,plaque group,258 cases),Risk factors,the national institutes of health stroke scale (NIHSS) score at admission were obtained,and carotid ultrasonography was performed to detect carotid plaques.SPSS19.0 software was used for statistical data.Results The average hospitalization days of plaque group was obviously more than no plaque group (P< 0.05).Carotid plaques were positively correlated with NIHSS score on admission to hospital (P< 0.05).In groups both less than or equal to 65 years old and over 65 years old,9 p21zones on all six SNPs (rs10757278 rs1333049 rs2383206,rs1537378,rs4977574 and rs2383207) allele frequency distribution in the absence of plaque group (control group) and plaque group had no significant (P> 0.05).Also found that the presence of carotid plaques lead to severe neurologic deficits (P<0.001;OR=0.001;95%CI,1.54～3.40).Single spot,spot group’s influence on nerve function defect in patients respectively was 1.87 times (95% CI,1.02-3.42;P=1.02) and 2.42 times (95%CI,1.59～3.66;P< 0.001) risk factors than no plaque group.However,the area size of carotid plaques has no obvious correlation with neural function defect.Conclusions Six 9p21.3 regional SNP loci had no correlation with carotid plaques.The onset of acute cerebral infarction patients with carotid plaques have more severe neurologic deficits.

Acute cerebral infarction; 9p21.3 gene polymorphism; Carotid plaques; Neurological dysfunction

1003-2754(2017)04-0295-04

2016-12-20；

2017-03-30

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新基金(PKJ2013-Y01)；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研資金(201540157)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領(lǐng)先人才培養(yǎng)計(jì)劃(PWR12014-05)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助(PWZx2014-08)；上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(ZK2015B16)；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(15ZR1437200)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81571203)

(1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院神經(jīng)科,上海 200135； 2.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)科，上海 200025)

李龍宣，E-mail:Longxuanlee2006@yahoo.com

R743.3

A