柚皮苷對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

劉 微， 張 洋， 郭建超， 練鵬影， 吳敏華， 丁文婷

柚皮苷對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

劉 微， 張 洋， 郭建超， 練鵬影， 吳敏華， 丁文婷

目的 研究柚皮苷(Naringin,NRG)對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與其中。方法 柚皮苷連續(xù)灌胃7 d后進(jìn)行大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)，缺血2 h后拔出線栓進(jìn)行再灌注。24 h后TUNEL染色觀察凋亡細(xì)胞數(shù)量，蘇木精-伊紅(hematoxyli-eosin,HE)染色觀察形態(tài)學(xué)改變，免疫熒光染色分別檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和縫隙連接蛋白43 (connexin43,Cx43)。結(jié)果 同模型組相比，柚皮苷預(yù)干預(yù)后凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，細(xì)胞損傷明顯減輕。免疫染色顯示柚皮苷可以減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度，同時(shí)Cx43的表達(dá)也有所降低(P<0.05)。結(jié)論 柚皮苷預(yù)干預(yù)可有效減輕腦缺血再灌注損傷，該保護(hù)作用同降低星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)密切相關(guān)。

柚皮苷； 缺血再灌注； 星形膠質(zhì)細(xì)胞； Cx43

腦血管疾病是威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其中缺血性腦血管病發(fā)病率高達(dá)85%。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞密切參與腦缺血損傷，逐漸成為治療腦缺血損傷的重要靶點(diǎn)[1,2]。柚皮苷(Naringin,NRG)屬于黃酮類化合物，是從蕓香科植物柚中提取出的一種單體。它具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化和抗炎等保護(hù)作用，因此能起到良好的保護(hù)血管、預(yù)防冠心病的作用[3,4]。最近柚皮苷對(duì)腦缺血的保護(hù)作用受到日益關(guān)注，研究表明柚皮苷可顯著降低大鼠腦缺血再灌注損傷側(cè)腦組織含水量,顯著縮小腦梗死體積,降低腦組織MDA含量，提高SOD活性[5]。然而星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與柚皮苷對(duì)腦缺血的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，通過形態(tài)學(xué)和凋亡細(xì)胞數(shù)的觀察進(jìn)一步證實(shí)柚皮苷的保護(hù)作用，從而形成有效地補(bǔ)充。另外，通過觀察柚皮苷對(duì)缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度以及Cx43的表達(dá)，初步探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在柚皮苷保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD 大鼠，雄性，質(zhì)量250～280 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠術(shù)前12 h 禁食不禁水。

1.2 藥物與試劑 柚皮苷(Sigma公司)；TUENL檢測(cè)試劑盒(Roche公司)；GFAP和Cx43分別購自Millipore和Abcam公司。

1.3 主要儀器 冰凍切片機(jī)(Leica公司)；OLYMPUS熒光顯微鏡；Image J 2x圖像分析軟件。

1.4 動(dòng)物模型的制備和分組 采用改良的Zea-Longa 線栓法制作局灶性腦缺血大鼠模型。將大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛( 400 mg/kg) 麻醉后，仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，并在頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈。以直徑0.26 mm 市售尼龍漁線為線栓，插入頸外動(dòng)脈殘端19～22 mm，阻斷大腦中動(dòng)脈起始端，扎緊結(jié)扎線并固定線栓，缺血2 h后拔出線栓。柚皮苷溶于生理鹽水，于手術(shù)前7 d開始灌胃(80 mg/kg/d)，對(duì)照組給予同等量的生理鹽水。剔除實(shí)驗(yàn)期間死亡及模型制作不成功的大鼠，并及時(shí)予以補(bǔ)充。

1.5 HE染色 缺血再灌注24 h后各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，插管至升主動(dòng)脈，用冰冷的生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行灌注。取出大腦，依次置于15%和30%蔗糖溶液，然后進(jìn)行冠狀冰凍切片，片厚10 μm，放至-80 ℃?zhèn)溆?。行蘇木精-伊紅( HE) 染色以觀察缺血側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理改變。

1.6 TUNEL染色 采用TUNEL檢測(cè)試劑盒，按照說明書指南進(jìn)行操作。Olympus顯微鏡下觀察并照相，計(jì)算缺血側(cè)海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7 免疫組織熒光染色 腦組織冰凍切片用3% 正常羊血清封閉1 h，隨后加入GFAP 抗體( 1∶800)、Cx43(1∶400)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗3次后加入熒光二抗，室溫避光孵育2 h。漂洗完后Olympus熒光顯微鏡下觀察并照相。采用Image J 圖像分析軟件測(cè)定Cx43陽性面積，計(jì)算陽性百分比。

2 結(jié) 果

2.1 柚皮苷對(duì)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量的影響 采用TUNEL試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)量。如圖所示，同假手術(shù)組相比，缺血再灌注使海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，然而柚皮苷預(yù)干預(yù)使得凋亡細(xì)胞數(shù)量有所減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1、表1)。

2.2 柚皮苷對(duì)海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變的影響 同假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)元受損嚴(yán)重：神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、排列不規(guī)則，胞漿呈嗜酸性變，胞核固縮、破裂、溶解等。與之相比，柚皮苷組神經(jīng)元損傷有所減輕(見圖2)。

2.3 柚皮苷對(duì)海馬CA1區(qū)GFAP染色的影響 同假手術(shù)組相比，模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯被激活：細(xì)胞體積變大，突起變粗，GFAP熒光染色強(qiáng)度明顯增加；而柚皮苷組星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活較模型組減輕(見圖3)。

2.4 柚皮苷對(duì)海馬CA1區(qū)Cx43表達(dá)的影響 同假手術(shù)組相比，缺血再灌注使海馬CA1區(qū)Cx43表達(dá)增加(P<0.05)，經(jīng)柚皮苷干預(yù)后Cx43表達(dá)明顯偏低(P<0.05)，提示柚皮苷預(yù)干預(yù)對(duì)缺血再灌注損傷導(dǎo)致的Cx43升高有一定的抑制作用(見圖4、表1)。

表1 大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)和Cx43陽性 百分比統(tǒng)計(jì)

與假手術(shù)相比*P<0.05；與模型組相比#P<0.05

3 討 論

腦缺血具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，對(duì)國民健康造成極大的威脅，已成為嚴(yán)重的社會(huì)-醫(yī)學(xué)-經(jīng)濟(jì)問題，因此，有關(guān)腦缺血預(yù)防和治療的基礎(chǔ)研究具有重大的公共健康意義。最近的研究表明柚皮苷可作為缺血性卒中高風(fēng)險(xiǎn)患者潛在的神經(jīng)保護(hù)劑。有文獻(xiàn)報(bào)道柚皮苷可明顯改善腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)損傷、減小腦梗死體積和水腫[6]，在本實(shí)驗(yàn)中通過TUNEL和HE染色我們觀察到柚皮苷預(yù)干預(yù)可減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，減輕神經(jīng)細(xì)胞受損狀態(tài)，從形態(tài)學(xué)上補(bǔ)充了柚皮苷對(duì)腦缺血的預(yù)保護(hù)作用。以前的文獻(xiàn)表明，柚皮苷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能同下調(diào)NOD2、RIP2、NF-κB和MMP-9的表達(dá)，降低髓過氧化物酶、一氧化氮，抑制炎癥以及上調(diào)抗氧化狀態(tài)有關(guān)[6,7]。為了進(jìn)一步明確柚皮苷對(duì)腦缺血的保護(hù)作用是否有涉及星形膠質(zhì)細(xì)胞，我們首先通過免疫熒光染色觀察柚皮苷預(yù)干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的表達(dá)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，它可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度。本實(shí)驗(yàn)研究顯示柚皮苷可減輕缺血再灌注損傷對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞參與柚皮苷的預(yù)保護(hù)作用?？p隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，是治療缺血性卒中藥物的重要靶點(diǎn)[8,9]?？p隙連接(gap junction,GJ)可介導(dǎo)電子耦合,允許<1.2 kD和直徑<1.5 nm的小分子快速傳播，為細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞提供了直接通路。腦缺血早期，缺血中心區(qū)的自由基、無氧代謝產(chǎn)物、興奮性氨基酸以及凋亡啟動(dòng)信號(hào)等通過星形膠質(zhì)細(xì)胞GJ向中心區(qū)周圍、血供相對(duì)減少的半暗帶(ischemic penumbra，IP)和遠(yuǎn)離缺血中心的腦組織傳播[10]。同時(shí)，由于缺血中心區(qū)細(xì)胞能量很快耗竭，缺血周圍如半暗帶區(qū)細(xì)胞內(nèi)的ATP、葡萄糖、谷胱甘肽以及神經(jīng)營養(yǎng)因子等營養(yǎng)物質(zhì)通過GJ 順著濃度差流向梗死中心區(qū)垂死的細(xì)胞內(nèi)[11,12]。缺血損傷比較嚴(yán)重(如缺血2 h，目前臨床上腦缺血從發(fā)生到治療的時(shí)間往往較長，90%都在2 h以上)時(shí)，傷害性因子的擴(kuò)散作用大于有益因子的擴(kuò)散作用，腦缺血急性期縫隙連接往往會(huì)有擴(kuò)大損傷的作用[13,14]。我們的實(shí)驗(yàn)表明柚皮苷可降低腦缺血再灌注后Cx43的表達(dá)，提示柚皮苷可通過下調(diào)Cx43減少自由基、無氧代謝產(chǎn)物、興奮性氨基酸以及凋亡啟動(dòng)信號(hào)的擴(kuò)散從而發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，星形膠質(zhì)細(xì)胞在柚皮苷減輕腦缺血損傷過程中發(fā)揮重要作用，該研究為探討柚皮苷抗腦缺血損傷作用機(jī)制和臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Choudhury GR,Ding S.Reactive astrocytes and therapeutic potential in focal ischemic stroke[J].Neurobiol Dis,2016,85:234-244.

[2]Verkhratsky A,Rodriguez JJ,Parpura V.Astroglia in neurological diseases[J].Future Neurol,2013,8(2):149-158.

[3]游 瓊，吳 鏗.柚皮苷的心血管藥理作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010,31(22)：3006-3008.

[4]劉 丹.柚皮苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的抗氧化作用[J].藥物研究，2013,32(3)：275-277.

[5]邢曉輝，朱 漢，陳一敏，等.柚皮苷對(duì)大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用[J].中國中醫(yī)藥資訊，2009,1(6)：7-8.

[6]Bai X,Zhang X,Chen L,et al.Protective effect of naringenin in experimental ischemic stroke:down-regulated NOD2,RIP2,NF-κB,MMP-9 and up-regulated claudin-5 expression[J].Neurochem Res,2014,39(8):1405-1415.

[7]Raza SS,Khan MM,Ahmad A,et al.Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke[J].Neuroscience,2013,230:157-171.

[8]Schulz R,Grge PM,Grbe A,et al.Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury,cardioprotection and neuroprotection[J].Pharmacol Ther,2015,153:90-106.

[9]Xie HY,Cui Y,Deng F,et al.Connexin:a potential novel target for protecting the central nervous system[J].Neural Regen Res,2015,10(4):659-666.

[10]Chew SS,Johnson CS,Green CR,et al.Role of connexin43 in central nervous system injury [J].Exp Neurol,2010,225(2):250-261.

[11]Ding W,Zhou L,Liu W,et al.Opposite effects of the gap junction blocker octanol on focal cerebral ischemia occluded for different durations [J].Mol Med Rep,2014,9(6):2485-2490.

[12]Krysko DV,Leybaert L,Vandenabeele P,et al.Gap junctions and the propagation of cell survival and cell death signals[J].Apoptosis,2005,10(3):459-469.

[13]Deng ZH,Liao J,Zhang JY,et al.Inhibition of the connexin 43 elevation may be involved in the neuroprotective activity of leptin against brain ischemic injury[J].Cell Mol Neurobiol,2014,34(6):871-879.

[14]Li X,Zhao H,Tan X,et al.Inhibition of connexin43 improves functional recovery after ischemic brain injury in neonatal rats[J].Glia,2015,63(9):1553-1567.

A:假手術(shù)組 B:模型組 C:柚皮苷組

圖1 柚皮苷可降低大鼠腦缺血再灌注24 h后的凋亡細(xì)胞數(shù)量(×400)

A：假手術(shù)組 B：模型組 C：柚皮苷組

圖2 柚皮苷可減輕大鼠腦缺血再灌注24 h后的細(xì)胞損傷(×400)

A：假手術(shù)組 B：模型組 C：柚皮苷組

圖3 柚皮苷減輕大鼠腦缺血再灌注24 h星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活(×400)

A：假手術(shù)組 B：模型組 C：柚皮苷組

圖4 柚皮苷減輕大鼠腦缺血再灌注24 h 后海馬CA1區(qū)Cx43的表達(dá)(×400)

The protective effect of naringin on cerebral ischemia reperfusion injury

LIUWei,ZHANGYang,GUOJianchao,etal.

(CollegeofFundamentalMedicalScience,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Objective To study the protective effects of naringin on rats with focal cerebral ischemia and reperfusion and whether astrocyte participates in this effect.Methods Naringin group was pretreated intragastricly for consecutive 7 days before ischemia.Middle cerebral artery was occluded for 2 h and then reperfused for 24 h.The number of apoptotic cells was detected by TUNEL staining,and pathological changes were observed by hematoxyli-eosin (HE) staining.Immunofluorescent staining was used to observe astrocytic marker (glial fibrillary detection acidic protein,GFAP) and connexin43 (Cx43).Results Compared with ischemia group,pretreatment with naringin reduced the number of apoptotic cells (P<0.05),and significantly attenuated cell injury.Immunofluorescent staining showed that naringin attenuated astrocytic activation,and decreased the expression of Cx43 (P<0.05).Conclusion Naringin pretreatment can effectively attenuated cerebral ischemia reperfusion injury,and the protective effects are closely related with Cx43 in astrocytes.

Naringin; Ischemia reperfusion; Astrocytes; Cx43

1003-2754(2017)04-0292-03

2016-12-09；

2017-03-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81202817,81673772)；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)項(xiàng)目(No.Yq2013041)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(No.20124425120011)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

劉 微，E-mail:weiliu1980@yahoo.com

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