運用RP-HPLC測定油茶枯餅中皂苷類、黃酮類有效指標性成分的含量

申立峰 王亞利 李倩 劉璐 譚立 孔靜 楊元 彭平 王夢林 石任兵

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·論著·

運用RP-HPLC測定油茶枯餅中皂苷類、黃酮類有效指標性成分的含量

申立峰 王亞利 李倩 劉璐 譚立 孔靜 楊元 彭平 王夢林 石任兵

目的 基于藥物體系導向建立油茶枯餅中皂苷類和黃酮類有效指標性成分的含量測定方法。 方法 采用反相高效液相色譜方法，在酸性系統(tǒng)下同時測定油茶枯餅中皂苷類和黃酮類有效指標性成分，采用Waters×bridge C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相為乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，黃酮類檢測波長為265 nm，皂苷類檢測波長為203 nm，進樣20 μL。結果 山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、camelliasaponin B1分別在0.0876～8.76 μg、0.0885～8.85 μg、0.0872～8.72 μg范圍內與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)均為0.9999。精密度、穩(wěn)定性、重復性良好，平均加樣回收率分別為99.22%、101.50%、100.44%，RSD值分別為1.66%、1.72%、1.58%。 結論 所建方法快速、簡便、準確度高、重現(xiàn)性好、適用于油茶枯餅的含量測定與質量控制。

油茶枯餅； 黃酮； 皂苷； 反相高效液相色譜法； 含量測定

油茶camelliaoleiferaabel.是中國特有的樹種，具有清熱解毒、活血散瘀、止痛的藥用價值[1]。油茶枯餅作為油茶籽煉油后的剩余物，含有多種活性成分[2]，具有抗氧化、抗菌、殺蟲等活性[3-5]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)油茶枯餅制備物具有顯著的抗血栓、抗心肌缺血的藥效作用，并有抗癡呆的療效趨勢。筆者在研究過程中，通過藥學—藥效質量表征關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)油茶枯餅中的皂苷類、黃酮類成分為其抗血栓、抗心肌缺血和抗癡呆藥物體系構架的主要有效物質基礎。然而，目前油茶枯餅側重單類指標性成分的分析，如對油茶枯餅中山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷的含量進行測定[6-8]，對油茶皂苷中camelliasaponin B1成分分離確定等[9-10]，而未見有關油茶枯餅中皂苷類成分含量測定的報道，更缺乏油茶枯餅藥物質量整體評價的方法。因此，筆者基于課題組所建立的藥物體系的中藥質量評價模式[11-15]，建立了同時測定油茶枯餅皂苷類和黃酮類有效指標性成分含量的方法，并應用于油茶枯餅及其系列制備物藥物質量表征。本文以藥物體系為導向，關注油茶枯餅主要有效物質基礎，建立其藥物質量評價方法，為油茶枯餅作為自然健康產品與藥物資源的質量控制及開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料

1.1 藥物與試劑

山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷(下文以黃酮a代替，自制，批號：20160110)、山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷(下文以黃酮b代替，自制，批號：20160111)、camelliasaponin B1(自制，批號：20160316)，對照品純度均≥98%，色譜級乙腈購自Fisher Scientific公司；分析純甲醇購自北京化工廠；分析純磷酸購自北京化學試劑公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；其余試劑也均為分析純。

3批油茶(江西：20150721、河南：20150726、湖北：20150716)枯餅均由湖南潤農生態(tài)茶油有限公司提供，現(xiàn)存放于北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥化學系。

1.2 儀器

Waters e2695自動進樣高效液相色譜儀，2996PDA檢測器，Empower工作站； Sartorius-BT25S型1/100000電子分析天平；Sartorious BT 124S型1/10000電子分析天平；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 油茶枯餅有效指標性成分含量測定方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別取黃酮a對照品、黃酮b對照品、camelliasaponin B1對照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成每1 mL含黃酮a 87.6 μg、黃酮b 88.5 μg、camelliasaponin B187.2 μg的溶液，即得混合對照品溶液。2.1.2 供試品溶液的配制 取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入125倍量50% 甲醇，加熱回流兩次，每次1小時，濾過，用50%甲醇多次洗滌濾紙和殘渣，合并濾液與洗滌液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加50% 甲醇溶解并轉移至100 mL量瓶中，用50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適應性 酸性系統(tǒng)：Waters×bridge C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，洗脫梯度(0～8分鐘，10%～15.5% A；8～16分鐘，15.5% A；16～35分鐘，15.5%～37.4% A；35～61分鐘，37.4% A，61～70分鐘，37.4%～45% A，70～85分鐘，45% A，85～90分鐘，45%～60% A)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃[16-17]，黃酮類成分檢測波長為265 nm，皂苷類成分檢測波長為203 nm，進樣20 μL。在上述酸性系統(tǒng)下，3種有效指標性成分在對應檢測波長下分離度良好，樣品和對照品有效指標性成分保留時間一致。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1的混合對照品溶液1、20、40、60、80、100 μL注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積；以峰面積積分值為縱坐標，對照品進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到回歸方程，黃酮a：Y=1368862.44X-20520.36(r=0.9999，n=6)；黃酮b：Y=1454138.15X-42323.95(r=0.9999，n=6)；camelliasaponin B1：Y=412609.80X+30214.56，(r=0.9999，n=6)。結果表明黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1分別在0.0876～8.76 μg、0.0885～8.85 μg、0.0872～8.72 μg范圍內與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.1.5 精密度考察 分別精密吸取同一供試品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應性”項下方法進行測定，測定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1面積，計算RSD值分別為0.24%、0.29%、1.32%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 分別精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于制備后0小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應性”項下方法進行測定，測定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1峰面積，計算RSD值分別為0.24%、0.26%、1.15%、0.85%、1.52%，得出供試品溶液在24小時內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性考察 取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，6份，精密稱定，按“2.1.2供試品溶液的配制”項下方法，制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液20 μL，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應性”項下方法進行測定，測定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1面積，計算得到平均含量分別為1.22%、1.40%、1.17%、0.0016%、0.0019%，RSD值分別為2.63%、2.84%、2.24%、1.64%、2.02%，說明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率考察 取本品粉末(過四號篩)約0.25 g，6份，精密稱定，分別加入對照品，按“2.1.2供試品溶液的配制”項下方法，制備供試品溶液，精密吸取試品溶液20 μL，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應性”項下方法進行測定，測定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1峰面積，計算回收率和RSD值，結果見表1，說明該方法加樣回收率合格，符合定量分析要求。

2.2 不同批次油茶枯餅有效指標性成分含量測定結果

取不同產地油茶枯餅粉末(過四號篩)約 0.5 g，精密稱定，按“2.1.2供試品溶液的配制”項下方法，制備供試品溶液，精密吸取試品溶液20 μL，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應性”項下方法進行測定，測定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1峰面積，計算各自含量，結果見表2。

表1 3種成分加樣回收率(n=6)

表2 3批油茶枯餅有效指標性成分的平均含量(n=3，%)

3 討論

本文基于自然藥學觀藥物體系導向[18-21]，發(fā)現(xiàn)油茶枯餅抗血栓、抗心肌缺血和抗癡呆藥物體系構架的主要有效物質基礎為皂苷類和黃酮類，并首次建立同時測定其有效指標性成分含量的方法。在選擇流動相時，考察了乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸溶劑系統(tǒng)，結果表明：以乙腈-磷酸(0.05%)為流動相時色譜峰峰形和分離效果較好，分離度大于1.5，因此選用乙腈-磷酸(0.05%)為測定方法的流動相，同時在不同波長下檢測黃酮類(265 nm)和皂苷類(203 nm)成分。本文建立了同時測定皂苷和黃酮類成分的方法，縮短了檢測時限，有助于油茶枯餅的整體性、系統(tǒng)性研究，能直觀地反映油茶枯餅化學成分的特征[22]，且本方法已成功應用于油茶枯餅及其系列制備物的藥物質量表征之中，從而為油茶枯餅的質量控制與開發(fā)應用奠定了藥學質量評價方法學基礎。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Simultaneous determination of saponins，flavonoids in oil-tea camellia defatted cake by reversed phase high performance liquid chromatography

SHENLifeng，WANGYali，LIQian，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalUniversityofMedicalSciences，Beijing100069，China

Corresponingauthor:SHIRenbing,E-mail:Shirb@126.com

Objective To establish a HPLC method for the determination of index components of flavonoids and saponins in oil-tea camellia defatted cake based on drug system.Methods Reversed phase high performance liquid chromatography was used for determination of index components of flavonoids and saponins in acid system at the same time， Waters×bridge C18(4.6×250mm, 5μm) chromatographic column was used；moving phase was acetonitrile and 0.05% phosphoric acid water，gradient elution，flow rate was 1 mL/min, column temperature was 30℃. The detection wavelength of flavonoids was 265 nm. The detection wavelength of saponins was 203nm, the injection volume was 20μL. Results The kaempferol 3-O-[2-O-β-D-xylose -6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside, kaempferol3-O-[2-O-β-D- galactosel-6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside and camelliasaponin B1showed a good linear relationship with peak area respectively in 0.0876～8.76 mg/mL, 0.0885～8.85 mg/mL, 0.0872～8.72 mg/mL, and the correlation coefficient was 0.9999. Precision, stability and repeatability were reached the requirements. The average recoveries were 99.22%, 101.50%, 100.44%, and RSD were 1.66%, 1.72%, 1.58%, respectively. Conclusion The method is quick, simple, accurate and reproducible, and can be used for the quality control and content determination of oil-tea camellia defatted cake.

Oil-tea camellia defatted cake； Flavonoids; Saponins； Reversed phase high performance liquid chromatography； Content determination

國家“十二五”科技支撐計劃(2012BAI29B06)；北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊資助項目(2011-CXTD-12)

100069 北京，首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院[申立峰(碩士研究生)、李倩(碩士研究生)、王夢林 (碩士研究生)]；北京中醫(yī)藥大學中藥學院國家中醫(yī)藥管理局中藥經典名方有效物質發(fā)現(xiàn)重點實驗室[王亞利(碩士研究生)、劉璐(碩士研究生)、譚立(碩士研究生)、孔靜(碩士研究生)、石任兵]；北京市教委中藥質量控制技術工程中心(石任兵)；河南省食品藥品檢驗所中藥室(楊元)；北京同仁堂研究院(彭平)

申立峰(1991- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中藥(復方)有效物質基礎研究與藥物創(chuàng)新。E-mail：13366927181@163.com

石任兵(1957- )，博士，教授，博士生導師。研究方向：中藥(復方)有效物質基礎研究與藥物創(chuàng)新。E-mail：shirb@126.com

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.001

2017-01-06)