人骨髓間充質(zhì)干細胞過表達白細胞介素-34對THP-1細胞的調(diào)節(jié)作用

高雪明，張順，許兆軍，單艷，王子鴻，蔡挺，江雪

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人骨髓間充質(zhì)干細胞過表達白細胞介素-34對THP-1細胞的調(diào)節(jié)作用

高雪明*，張順*，許兆軍，單艷，王子鴻，蔡挺，江雪

寧波市第二醫(yī)院，浙江寧波 315010

構(gòu)建人IL-34真核表達載體并將其轉(zhuǎn)染到人骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察高表達IL-34的骨髓間充質(zhì)干細胞對THP-1細胞的影響。PCR擴增IL-34 DNA，并將其克隆到真核表達載體pIRES2-EGFP；將構(gòu)建成功的重組體轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細胞，Western blotting和ELISA分析IL-34在細胞中的表達；用高表達IL-34的骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液來培養(yǎng)THP-1細胞，Real-time PCR分析THP-1細胞中IL-10和TNFα的表達變化。經(jīng)雙酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建了pIRES2-EGFP-IL-34重組體；轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細胞的IL-34可以促進THP-1細胞表達IL-10和TNFα。結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細胞表達分泌的IL-34對THP-1有調(diào)節(jié)作用。

人骨髓間充質(zhì)干細胞，白細胞介素-34，THP-1細胞，白細胞介素-10，腫瘤壞死因子-α

近十幾年來，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 可以促進慢性創(chuàng)傷愈合，并且已經(jīng)應用于臨床試驗，同時研究者發(fā)現(xiàn)MSCs也可以促進燒傷和放射損傷創(chuàng)面愈合[1-4]。MSCs作用于傷口，可以加速傷口愈合并促進肉芽組織和血管形成[5]。MSCs在促進傷口愈合過程中并不是通過分化并替代損傷的組織來修復創(chuàng)面，而是通過分泌可溶性細胞因子來調(diào)節(jié)多種細胞應答皮膚損傷。MSCs通過分泌細胞因子和生長因子促進血管再生、減少細胞死亡量并促進創(chuàng)面處疤痕形成[6]。MSCs也可以分泌免疫抑制因子來抑制免疫細胞增殖，如T細胞、B細胞和NK細胞。外源性MSCs能夠促進傷口愈合、肉芽組織形成和新血管形成；進一步研究發(fā)現(xiàn)MSCs通過分泌細胞因子調(diào)節(jié)巨噬細胞、角質(zhì)細胞、真皮成纖維細胞和上皮細胞，進而促進傷口愈合[5]。

盡管已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以募集巨噬細胞到達創(chuàng)面處[7]，但是兩種細胞之間的作用關系并不清楚。研究者利用牙齦間充質(zhì)干細胞研究發(fā)現(xiàn)，在體外MSCs與巨噬細胞共培養(yǎng)可以促進巨噬細胞分化為具有抗炎作用的M2型巨噬細胞，這些巨噬細胞具有較強的吞噬功能，并且可以分泌抗炎因子以及抑制促炎因子的表達[8]。有學者用骨髓間充質(zhì)干細胞進行研究得到相同的效果[9-11]。在MSCs-巨噬細胞共培養(yǎng)體系中抑制白細胞介素6 (Interleukin-6，IL-6) 和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF) 的活性可以抑制M2巨噬細胞的形成，這說明MSCs分泌的這些細胞因子在調(diào)節(jié)巨噬細胞表型過程中有重要作用。

雖然MSCs可以趨化巨噬細胞并促進巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換，但是對于其中的具體機制尚不完全清楚。特別是近年來發(fā)現(xiàn)白細胞介素34 (Interleukin-34，IL-34)，它作為一個新的細胞因子，和巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF)以及GM-CSF都可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能。M-CSF和IL-34有共同的受體CSF-1R，這兩個因子都可以誘導單核細胞分化為IL-10(高)IL-12(低)免疫調(diào)節(jié)巨噬細胞，這種細胞與卵巢癌中的腫瘤相關巨噬細胞類似。M-CSF誘導型巨噬細胞(M-CSF-Mφ)、IL-34誘導型巨噬細胞 (IL-34-Mφ) 和腫瘤相關巨噬細胞都可以促進CD4(+)T細胞分化為CCR4(+)CCR6(+)CD161(+)Th17細胞，而GM-CSF誘導型巨噬細胞可以促進其分化為Th1細胞；膜型IL-1α可以調(diào)節(jié)記憶T細胞分化為Th17細胞，M-CSF、IL-34誘導型巨噬細胞和腫瘤相關巨噬細胞都可以表達膜型IL-1α[12]。因此證明巨噬細胞通過促進CD4(+)T細胞極化來調(diào)節(jié)免疫應答。研究發(fā)現(xiàn)IL-34蛋白可以刺激單核細胞分化為CD14(高)CD163 (高)CD1a(-) 巨噬細胞；受LPS刺激后，IL-34-Mφ轉(zhuǎn)變?yōu)镮L-10(高)IL-12(低) M2表型，同時共刺激分子CD80和CD86表達降低，因此IL-34-Mφ對T細胞的激活作用欠佳，具有潛在的免疫抑制作用；IL-34-Mφ和M-CSF-Mφ的表型及功能相似，但是IL-34-Mφ的形成是通過CSF-1R介導的，而不依賴于M-CSF，IL-6可以促進該細胞形成；IFNγ和GM-CSF都可以抑制IL-34誘導單核細胞分化為免疫抑制型巨噬細胞，此外，IFNγ還可以促進IL-34-Mφ轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖哒{(diào)節(jié)型Mφ[13]。

為了研究IL-34在人骨髓間充質(zhì)干細胞 (hBM-MSCs) 調(diào)節(jié)巨噬細胞功能過程中的作用，特別是hBM-MSCs高表達IL-34對單核巨噬細胞的影響，我們構(gòu)建IL-34真核表達載體pIRES2-EGFP-IL-34，然后將該載體轉(zhuǎn)染到hBM-MSCs中，利用轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-IL-34的BM-MSCs上清液培養(yǎng)THP-1細胞，Real-time PCR分析白細胞介素-10 (IL-10) 和腫瘤壞死因子α (TNFα) 在THP-1細胞中的表達變化。研究結(jié)果將為進一步探究IL-34對單核/巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓組織標本取自于寧波市第二醫(yī)院風濕免疫科病人，實驗開展前已經(jīng)取得病人同意，并經(jīng)寧波市倫理委員會批準；THP-1細胞購自上海中科院細胞庫。pIRES2-EGFP和大腸桿菌DH5α購自上海Invitrogen公司。pcDNA3.1-IL-34為本實驗室保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司。PrimeScriptTMRT Master Mix、Prime ATAR Max DNA polymerase、RⅠ、HⅠ、DL2000 DNA marker、SYBR?TM(Tli RNase H Plus) 和DNA Ligation Kit Ver.2.1購自TaKaRa公司。Gel Extraction Kit、Endo-Free Plasmid Mini Kit和Plasmid Mini Kit Ⅰ購自OMEGA公司。NanoFectin Transfection Reagent購自上海依科賽生物制品有限公司。抗生素、胎牛血清，胰酶和分化培養(yǎng)基購自GIBCO公司。干細胞培養(yǎng)基購自Sciencell公司。流式抗體購自優(yōu)寧維生物科技有限公司。油紅O、甲苯胺藍和茜素紅購自Solarbio公司。SANTA CRUZ 鼠抗人IL-34單克隆抗體 (sc-517217)。WB試劑購自上海生工生物有限公司。ELISA試劑盒購自上海橋杜生物有限公司 (REN001)。細菌培養(yǎng)基購自OXOID公司。實驗過程中用到的所有引物由華大測序公司合成 (表1)。

表1 Real-time PCR引物序列

1.3 pIRES2-EGFP-IL-34質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用Primer 5設計一對IL-34特異性引物，上游引物：5′-CCGGCCACCATGCCCC GGGCTT-3′，引物序列含有一個R I酶切位點和一個Kozak序列；下游引物：5′-CGCT CAGGGCAAGAGGCCCTCGC-3′，引物序列含有1個HⅠ酶切位點。

以本實驗室保存的pcDNA3.1-IL-34質(zhì)粒為模板，用上述引物擴增出IL-34表達序列，利用RⅠ和HⅠ將目的基因和pIRES2-EGFP空載體分別進行酶切，待酶切結(jié)束后，進行電泳回收；將回收的IL-34基因和pIRES2-EGFP大片段進行連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌株；將轉(zhuǎn)化后的DH5α菌株涂布于含有卡那霉素的平板，37 ℃培養(yǎng)12–16 h，觀察菌落生長狀態(tài)，并挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，挑取經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌落并接種到含抗生素的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，然后進行酶切鑒定，送華大公司進行測序鑒定。

1.4 hBM-MSCs分離培養(yǎng)及鑒定

用PBS緩沖液與骨髓組織液1∶1混合，緩慢顛倒均勻，向干凈無菌的15 mL離心管中加入3 mL Ficoll分離液，然后再向離心管中緩慢加入稀釋后的骨髓液6 mL，2 000 r/min離心15 min，將中間層的白色細胞輕輕吸取并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，用PBS緩沖液清洗細胞2次，最后用Sciencell完全干細胞培養(yǎng)基將細胞混合吹散，接種到培養(yǎng)皿中。CO2濃度為5%，37 ℃培養(yǎng)，12–24 h觀察細胞生長情況，同時更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細胞，每間隔3 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞匯合度達到80%時，進行細胞傳代。

當細胞培養(yǎng)至第3或4代，消化并收集細胞，進行流式分析鑒定以及分化鑒定。取部分細胞，分別孵育CD90、CD105、CD73、CD79a、CD34、CD11b、CD19、CD14、CD45和HLA-DR抗體，上機檢測細胞表面標記性分子的表達情況；CD90、CD105和CD73在細胞表面陽性表達，而其他的標記分子則陰性表達。另外再取一部分細胞，分成3組，分別進行成脂、成軟骨和成骨分化培養(yǎng)，培養(yǎng)后分別用油紅O、甲苯胺藍和茜素紅進行染色鑒定。

1.5 IL-34基因在hBM-MSC中的表達分析

復蘇培養(yǎng)hBM-MSC細胞，當細胞密度達到90%時，將細胞轉(zhuǎn)接到6孔板中。分別用LPS (100 ng/mL) 和TNFα (100 ng/mL) 刺激培養(yǎng)hBM-MSC。培養(yǎng)6 h、24 h和48 h后提取細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR分析hBM-MSC細胞中IL-34表達變化。

1.6 pIRES2-EGFP-IL-34轉(zhuǎn)染hBM-MSCs及表達

提取無內(nèi)毒素pIRES2-EGFP-IL-34和pIRES2- EGFP質(zhì)粒。復蘇hBM-MSCs，培養(yǎng)匯合度至80%傳代，細胞換液，2 h后按照NanoFectin Transfection Reagent說明書操作，將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至hBM-MSCs。培養(yǎng)24 h后，觀察熒光蛋白在細胞中的表達情況。培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液備用，提取細胞總蛋白，Western blotting檢測IL-34蛋白在hBM-MSCs中的表達情況。實驗所使用的一抗為SANTA CRUZ鼠抗人IL-34單克隆抗體 (sc-517217)，抗體使用濃度為1∶500；二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG，使用濃度為1∶8 000；ECL顯色拍照。利用收集到的細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA實驗，檢測IL-34蛋白在培養(yǎng)液中的濃度。

1.7 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-IL-34的hBM-MSCs培養(yǎng)上清液對THP-1細胞的影響

用上述收集的兩種上清液 (pIRES2-EGFP- hIL-34+hBM-MSCs和pIRES2-EGFP+hBM-MSCs) 分別培養(yǎng)THP-1細胞，分別在24 h和48 h收集THP-1細胞并提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后Real-time PCR檢測兩組THP-1細胞中IL-10和TNFα的表達變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-34真核表達載體構(gòu)建

pIRES2-EGFP載體 (圖1A) 用來構(gòu)建IL-34基因真核表達載體。在pIRES2-EGFP載體的多克隆位點 (MCS) 和增強型綠色熒光蛋白 (EGFP) 編碼區(qū)之間含有一段腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進入序列 (IRES)，因此可以使MCS中插入的外源基因和EGFP在同一條mRNA上進行翻譯。在pIRES2-EGFP載體中還含有卡那霉素和新霉素編碼基因，用于克隆篩選和穩(wěn)定細胞表達株篩選。

圖1 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-IL-34構(gòu)建結(jié)果

通過PCR特異性擴增出IL-34基因編碼序列726 bp，然后與pIRES2-EGFP載體分別進行R I和H I雙酶切，將IL-34基因片段與pIRES2-EGFP載體連接 (圖1B)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，涂布在含有卡那霉素的平板篩選陽性克隆。菌落PCR可以擴增出一條約750 bp的片段 (圖1C)；重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可以形成兩條片段，小片段大小約為750 bp (圖1D)；將重組質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果與GenBank中的IL-34序列 (GenBank Accession No. NM_152456.2) 對比完全匹配。

2.2 hBM-MSCs分離培養(yǎng)及鑒定

利用Ficoll分離液從骨髓組織中分離單核細胞，然后接種在細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后換液，觀察細胞形態(tài)，hBM-MSCs為成纖維狀。細胞培養(yǎng)生長至匯合度為80%時，進行傳代，細胞培養(yǎng)至第3代用于流式鑒定以及多向分化鑒定。分別檢測細胞上CD90、CD105、CD73、CD79a、CD34、CD11b、CD19、CD14、CD45和HLA-DR標記性分子的表達情況，分別檢測細胞向脂肪、成骨和軟骨分化的能力。結(jié)果顯示我們分離出的細胞90%以上表達CD90、CD105和CD73，而CD79a、CD34、CD11b、CD19、CD14、CD45和HLA-DR幾乎不表達 (圖2A)，并且該細胞可以向脂肪、成骨和軟骨分化 (圖2B)，這說明我們成功地分離出hBM-MSCs。

2.3 IL-34基因在hBM-MSCs中的表達分析

分別用LPS和TNFα刺激培養(yǎng)hBM-MSCs，在培養(yǎng)6 h、24 h和48 h后提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR分析細菌脂多糖 (LPS) 和TNFα在不同時間對hBM-MSCs表達IL-34的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同時間段LPS可以顯著抑制IL-34的mRNA的表達；而TNFα可以明顯刺激IL-34 mRNA表達 (圖3)。

2.4 pIRES2-EGFP-IL-34在hBM-MSCs中的表達

將pIRES2-EGFP-IL-34轉(zhuǎn)染hBM-MSCs后，24 h觀察細胞中有綠色熒光表達 (圖4A，B)；經(jīng)Western blotting鑒定，pIRES2-EGFP-IL-34可以在hBM-MSCs中高表達IL-34蛋白質(zhì)；我們利用SANTA CRUZ鼠抗人單克隆抗體 (sc-517217) 1∶500濃度4 ℃過夜孵育以及成像儀曝光檢測在未轉(zhuǎn)染的hBM-MSCs中也有微量的IL-34蛋白 (圖4C)。ELISA結(jié)果證明hBM-MSCs可以表達并分泌IL-34，重組載體pIRES2-EGFP- IL-34可以在hBM-MSCs中高表達IL-34并分泌到細胞外 (圖4D)。

2.5 hBM-MSCs高表達IL-34促進THP-1細胞表達IL-10和TNFα

用轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-IL-34的hBM-MSCs的細胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)THP-1細胞，然后提取總RNA，Real-time PCR分析IL-10和TNFα的表達變化。與對照組相比，高表達IL-34的hBM-MSCs上清液培養(yǎng)THP-1細胞48 h后可以明顯地刺激THP-1表達IL-10和TNFα (圖5)。結(jié)果說明我們不僅成功地克隆了IL-34真核表達載體，同時該載體可以在hBM-MSCs中表達具有活性的IL-34蛋白。

圖2 hBM-MSCs表面標記物流式細胞術鑒定和三系分化結(jié)果

圖3 Real-time PCR分析IL-34在hBM-MSCs中的表達分析

圖4 pIRES2-EGFP-IL-34在hBM-MSCs細胞中的表達

圖5 hBM-MSCs過表達IL-34促進THP-1細胞表達IL-10 (A) 和TNFα (B)

3 討論

IL-34是一個新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，它與M-CSF沒有同源序列，但是它們有共同的受體CSF-1R，這兩種細胞因子的生物學功能相似但不完全相同[14]。IL-34可以通過與受體CSF-1R結(jié)合來調(diào)節(jié)單核細胞和巨噬細胞的增殖、分化及生存[12–13,15]。研究證明，IL-34不僅參與調(diào)節(jié)細胞生物活性，而且在多種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中也起重要作用[16–17]。IL-34在很多組織中都有表達，多種炎癥因子都可以誘導IL-34表達。Kawabe等[18]發(fā)現(xiàn)TNFα可以刺激牙周膜細胞表達IL-34和M-CSF。Ciccia等[17]用TNFα刺激MC3T3-E1細胞15 min后，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，同時IL-34的表達量升高；利用NF-κB抑制劑CAPE可以明顯抑制TNFα誘導IL-34表達，因此證明TNFα是通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導IL-34的表達。Bostr?m等[19]發(fā)現(xiàn)IL-34在牙齦成纖維細胞中表達，TNFα和IL-1β刺激牙齦成纖維細胞，通過調(diào)節(jié)NF-κB和JNK信號分子使IL-34 mRNA表達量增高。

Eda等[20]用IL-1β、IL-6、IL-17和TNFα 4種炎癥因子分別刺激成骨細胞后，只有IL-1β和TNFα可以顯著誘導細胞表達IL-34 mRNA；IL-1β和TNFα可以激活細胞內(nèi)MAPKs通路 (p44/42 MAPK、p38、JNK和NF-κB等信號分子)；JNK抑制劑可以顯著抑制IL-1β和TNFα誘導IL-34 mRNA表達，而MEK-1/2抑制劑不能抑制IL-34 mRNA表達，令人驚奇的是，兩種抑制劑同時作用可以更明顯地抑制IL-34 mRNA表達；IL-1β和TNFα也可以誘導成骨細胞表達M-CSF mRNA，p38、JNK和MEK-1/2抑制劑對其表達并沒有影響，但是NF-κB抑制劑可以顯著抑制M-CSF mRNA表達。上述結(jié)果說明炎癥性因子IL-1β和TNFα是通過JNK和P44/42 MAPK信號通路誘導成骨細胞表達IL-34，而不是通過P38通路；p38和JNK等信號分子并不參與誘導M-CSF表達。我們的研究結(jié)果也證實了TNFα可以促進IL-34的表達；在本研究結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)LPS可以顯著抑制IL-34表達，但是作用機制尚不清楚。有研究表明LPS與炎癥細胞 (包括單核/巨噬細胞) 上的受體結(jié)合后，可啟動一系列快速反應，最終導致p38 MAPK的激活，進而作用于下游的激酶、轉(zhuǎn)錄因子等靶蛋白[21-25]。但是根據(jù)已知結(jié)果證明IL-34表達并不受p38途徑調(diào)控，LPS對IL-34的具體調(diào)控機制有待進一步深入研究。

為了探究IL-34在hBM-MSCs調(diào)節(jié)巨噬細胞表型過程中的作用機制，我們首先將IL-34基因克隆到pIRES2-EGFP載體中，并在hBM-MSCs中表達IL-34蛋白質(zhì)。我們利用轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-IL-34的hBM-MSCs培養(yǎng)上清液培養(yǎng)THP-1細胞，結(jié)果證明pIRES2-EGFP-IL-34載體可以在hBM-MSCs中表達具有生物活性的IL-34蛋白質(zhì)，在此過程中，IL-34蛋白可以促進THP-1細胞表達IL-10和TNFα。IL-34可以通過ERK促進腸固有層單核細胞表達TNFα[26]，但是對于IL-34促進IL-10表達的作用機制還不清楚。綜上所述，我們成功地構(gòu)建了IL-34在hBM-MSCs中的表達體系，這為后續(xù)研究hBM-MSCs對巨噬細胞表型的調(diào)節(jié)作用奠定了基礎。

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(本文責編 郝麗芳)

Effects of interleukin-34 expressed by human bone marrow derived mesenchymal stem cells on THP-1 cells

Xueming Gao*, Shun Zhang*, Zhaojun Xu, Yan Shan, Zihong Wang, Ting Cai, and Xue Jiang

Ningbo No.2 Hospital, Ningbo 315010, Zhejiang, China

To construct recombinant eukaryotic expression plasmid vector of human IL-34 gene, and to study the effects of IL-34 expressed by human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) on THP-1 cells. Full-length IL-34 encoding sequence was amplified by PCR. And this fragment was cloned into the plasmid pIRES2-EGFP. Western blotting and ELISA were used to analyze the expression of IL-34 in hBM-MSCs. THP-1 cells were cultured with hBM-MSCs medium containing IL-34 protein. Real-time PCR detected the effects of IL-34 on the expression of IL-10 and TNFα in THP-1 cells. Restrictive enzyme analysis and sequencing demonstrated that IL-34 eukaryotic expression vector was successfully constructed. IL-34 protein expressed by hBM-MSCs could promote IL-10 and TNFα expression in THP-1 cells. Those results show that IL-34 expressed by hBM-MSCs has regulating effect on THP-1 cells.

human bone marrow derived mesen chymal stem cells, IL-34, THP-1 cells, IL-10, TNFα

Supported by: Ningbo Municipal Natural Science Foundation (No. 2016A610139), Project of Scientific Innovation Team of Ningbo (No. 2011B82016).

寧波市自然科學基金(No. 2016A610139)，寧波科技創(chuàng)新團隊項目(No. 2011B82016) 資助。

August 30, 2016; Accepted:January 18, 2017

Zhaojun Xu. Tel: +86-574-83870439; E-mail: zhaojunxuguest@163.com

* These authors contributed equally to this study.

網(wǎng)絡出版時間：2017-02-16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170216.1024.001.html