凡納濱對(duì)蝦堿性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表達(dá)及鹽度應(yīng)答效應(yīng)

張明明, 王 雷, 王寶杰, 劉 梅, 戰(zhàn)文斌, 蔣克勇

?

凡納濱對(duì)蝦堿性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表達(dá)及鹽度應(yīng)答效應(yīng)

張明明1, 3, 王 雷2, 3, 王寶杰2, 3, 劉 梅2, 3, 戰(zhàn)文斌1, 蔣克勇2, 3

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 山東青島 266003; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 3. 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071)

本研究通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)首次克隆得到凡納濱對(duì)蝦()堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)基因的cDNA全長(zhǎng)序列, 其中ALP基因全長(zhǎng)序列1 910 bp, 編碼536個(gè)氨基酸; ACP基因全長(zhǎng)序列1 544 bp, 編碼439個(gè)氨基酸。鹽度調(diào)控設(shè)3個(gè)鹽度組: 31(對(duì)照)、16和3。養(yǎng)殖45 d后, 熒光定量PCR測(cè)定對(duì)蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸和鰓5個(gè)組織中的ALP和ACP 基因mRNA的表達(dá)情況。RT-PCR顯示, ALP基因在5個(gè)組織中普遍表達(dá), 在肝胰腺中表達(dá)量最高(<0.05), 腸道中的表達(dá)量最低(<0.05); ACP基因在5個(gè)組織中也均表達(dá), 在肝胰腺和鰓中表達(dá)量明顯高于其他3個(gè)組織(<0.05)。鹽度應(yīng)答實(shí)驗(yàn)表明, 不同鹽度條件下, 不同組織中, ALP和ACP基因存在不同的表達(dá)模式。在胃和鰓組織中, ALP基因在31鹽度組的表達(dá)量顯著高于其他兩組(<0.05); 在肝胰腺和腸道中, ALP基因在16鹽度下的表達(dá)量明顯低于其他兩組(<0.05); 在肌肉中, ALP基因的表達(dá)與其他組織均不同, 31鹽度組表達(dá)量最高, 而16鹽度組最低(<0.05); 在肝胰腺中, ACP基因在31鹽度組的表達(dá)量明顯低于其他鹽度組(<0.05); 在肌肉和鰓兩個(gè)組織中, ACP基因在31鹽度下的表達(dá)量明顯高于其余兩個(gè)鹽度組(<0.05); 在腸道中, ACP基因的表達(dá)量在3鹽度組明顯高于其他兩組(<0.05); 而在胃中, ACP基因在3個(gè)鹽度下的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。上述結(jié)果為研究低鹽條件下凡納濱對(duì)蝦的磷酸酶基因的變化機(jī)制提供了參考。

凡納濱對(duì)蝦(); ALP基因; ACP基因; 克隆表達(dá); 鹽度

凡納濱對(duì)蝦()俗稱南美白對(duì)蝦, 原產(chǎn)地為太平洋沿岸水域[1], 是廣鹽性的優(yōu)良蝦種。凡納濱對(duì)蝦具有生長(zhǎng)迅速、出肉率高、抗病能力強(qiáng)、適于高密度養(yǎng)殖及對(duì)鹽度的適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn), 另外根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 自20世紀(jì)80年代初以來(lái)全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增加, 越來(lái)越多的消費(fèi)者把蝦作為重要的蛋白質(zhì)來(lái)源[2], 對(duì)蝦在淡水、半咸水和海水中有著大規(guī)模的養(yǎng)殖[3], 其養(yǎng)殖區(qū)域也由沿海進(jìn)一步向著內(nèi)陸延伸[4]。

鹽度是對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中重要的環(huán)境因子[5], 影響對(duì)蝦的滲透壓調(diào)節(jié)和能量收支等方面。有研究認(rèn)為凡納濱對(duì)蝦的等滲點(diǎn)在25附近[6]。目前的文獻(xiàn)研究得到的最適生長(zhǎng)鹽度并不一致, Samocha[7]等研究認(rèn)為凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的最適鹽度在2~8, Bray[8]等研究認(rèn)為最適生長(zhǎng)鹽度在5~15; Ponce-Palafox[9]等研究認(rèn)為最適生長(zhǎng)鹽度在33~40。朱春華[10]研究認(rèn)為鹽度14~22是凡納濱對(duì)蝦的最適生長(zhǎng)鹽度, 環(huán)境鹽度為18時(shí)生長(zhǎng)速度最快, 也有研究認(rèn)為15~25是凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的理想鹽度范圍[4]。

磷酸酶(phosphatase)是一種正磷酸單酯酶, 能夠催化各種含磷化合物的水解反應(yīng), 根據(jù)他們起催化作用的最適pH不同, 可分為堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP), 它們是動(dòng)物體內(nèi)解毒體系的重要組成, 并且在動(dòng)物機(jī)體的骨化過(guò)程以及在磷化物和其他一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中都起著重要作用[11]。ALP廣泛存在于人體動(dòng)物、植物和微生物中, 是生物代謝的重要酶類(lèi), 在堿性條件下的水解反應(yīng)外, 還可以參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng), 參與對(duì)蝦體內(nèi)能量的收支平衡。ACP來(lái)自于顆粒細(xì)胞的顆粒體, 是巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶, 是溶酶體的重要組成部分[12], 作為生物體內(nèi)重要的代謝酶和免疫酶, 主要參與磷酸酯的代謝, 與細(xì)胞的消化代謝[13]、自溶過(guò)程和免疫調(diào)節(jié)[14]有關(guān)。

目前, 對(duì)鹽度影響凡納濱對(duì)蝦ALP和ACP的研究多集中在鹽度突變和鹽度的長(zhǎng)期效應(yīng)對(duì)ALP和ACP酶活力的影響, 而鹽度的長(zhǎng)期效應(yīng)對(duì)于ALP基因和ACP基因表達(dá)的影響研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究鹽度的長(zhǎng)期效應(yīng)對(duì)不同組織中ALP基因和ACP基因表達(dá)的影響, 旨在為凡納濱對(duì)蝦適應(yīng)低鹽度養(yǎng)殖的磷酸酶類(lèi)分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦取自膠南養(yǎng)殖場(chǎng), 原養(yǎng)殖環(huán)境鹽度為31, 無(wú)外傷, 體色正常, 規(guī)格一致, 體長(zhǎng)平均在8 cm左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)鹽度梯度, 分別是3、16和31, 以正常海水31作為對(duì)照組, 在1.5 m3養(yǎng)殖循環(huán)水箱中進(jìn)行。每缸放養(yǎng)90尾對(duì)蝦, 每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行組。低鹽度組用正常海水和淡水進(jìn)行調(diào)節(jié), 以每天3的速率降低至16和3鹽度后正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn), 養(yǎng)殖周期45 d, 試驗(yàn)期間水溫范圍為22~28℃, 每天換水1次, 換水量1/3, 吸污1次, 投餌2次。

1.3 樣品采集

各組在設(shè)定的鹽度中養(yǎng)殖45 d后取樣, 每組取對(duì)蝦3尾。分別取對(duì)蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸、鰓5個(gè)組織, 放于1 mL RNAguard中, 上述樣品放于–80℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA提取和cDNA克隆

1.4.1 RNA的提取

取對(duì)照組31鹽度組的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺, 利用上海飛捷生物技術(shù)有限公司總RNA極速抽提試劑盒提取總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.4.2 目的片段的克隆

用TransScript ? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA后–20℃冰箱保存。參照近緣蝦類(lèi)ALP和ACP核苷酸序列, 用Primer Premier5設(shè)計(jì)性引物(表1)。片段克隆PCR反應(yīng): 94 ℃預(yù)變性5 min; 94℃ 30 s, 退火溫度30 s, 72℃ 60 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物; Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析獲得目的條帶, 目的片段產(chǎn)物利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0進(jìn)行凝膠回收; 連接pEASY-T1載體; 轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞; 氨芐抗性固體培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng); 挑菌, 以氨芐抗性液體培養(yǎng)基培養(yǎng); 菌體PCR檢測(cè); 陽(yáng)性菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.4.3 基因全長(zhǎng)的克隆

3′RACE: 以3′CDS為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板, 利用克隆得到的目的片段和Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1), 利用特異性引物和UPM、NUP進(jìn)行巢式PCR(Nested-PCR)。電泳, DNA片段回收, 連接, 轉(zhuǎn)化, 測(cè)序方法同前。5′RACE: 5′RACE實(shí)驗(yàn)參考孫姝娟等[15]的方法, 并對(duì)部分細(xì)節(jié)進(jìn)行了改動(dòng)。以oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板, 利用克隆得到的目的片段和Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。在合成的cDNA末端加上polyC尾, 用接頭引物oligo(dG)-adaptor分別和基因特異性引物進(jìn)行Nested-PCR。電泳, DNA片段回收, 連接, 轉(zhuǎn)化, 測(cè)序方法同前。

1.5 基因序列分析

用ORF Finder (Open Reading Frame Finder)(http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)預(yù)測(cè)ORF和翻譯的蛋白序列。Prot-param (http: //web.expasy.org/protparam/)用于預(yù)測(cè)翻譯蛋白的理化特征分析。SingalP3.0Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/SingalP)尋找基因可能存在的信號(hào)肽序列, 使用NetPhos2.0 Server (http: // www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn), 使用NetNGlyc1.0 Server (http: //www.cbs.dtu.dk /services/ NetNGlyc/)預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn), Prosite(http: //prosite. expasy.org/)和采用SMART (http: //smart.embl-heidelberg. de/)用于預(yù)測(cè)蛋白功能結(jié)構(gòu)域。Swiss-model模型用于預(yù)測(cè)蛋白的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)(http: //swissmodel.expasy. org)。BioEdit(http: //www.mbio.Ncsu.edu/BioEdit)軟件用于氨基酸的多序列比對(duì)。分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建用MEGA4.0軟件。

表1 ALP和ACP基因克隆和熒光定量引物

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)ALP和ACP的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)。以β-actin為內(nèi)參基因, 檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦在不同鹽度不同組織中ALP和ACP的表達(dá)水平。用TaKaRa SYBR Green Premix Ex TaqTM||試劑盒。在羅氏熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng), 實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。熒光定量采用兩步法, PCR程序: 94℃30s; 94℃5s, 退火30s, 40個(gè)循環(huán); 溶解。用2–ΔΔCt法處理各基因熒光定量所得數(shù)據(jù), 并分析擴(kuò)增效率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 進(jìn)行Duncan’s多重比較, 當(dāng)<0.05時(shí), 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及序列分析

2.1.1 凡納濱對(duì)蝦ALP基因全長(zhǎng)克隆及序列分析

克隆得到凡納濱對(duì)蝦ALP cDNA全長(zhǎng)序列1 910 bp(GenBank登錄號(hào): R534873.1), 包括156 bp的非編碼區(qū)(Untranslated Region, URT), 143 bp的3’URT和1611的ORF。該基因編碼536個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為58.67 kDa, 等電點(diǎn)為5.02, 含有12個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及12個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)糖基化位點(diǎn)。SMART預(yù)測(cè)凡納濱對(duì)蝦ALP的結(jié)構(gòu)域, 結(jié)果顯示, 第88~526位置的氨基酸為ALP的核心結(jié)構(gòu)域alkPPc(Alkaline phosphatase homologues), alkPPc是ALP蛋白家族所共有的結(jié)構(gòu)域(圖1A)。

2.1.2 凡納濱對(duì)蝦ACP基因全長(zhǎng)克隆及序列分析

克隆得到凡納濱對(duì)蝦ACP cDNA全長(zhǎng)序列1 544 bp (GenBank登錄號(hào): KR676 449.1), 包括63 bp的非編碼區(qū)(Untranslated Region, URT), 161 bp的3′URT和1427的ORF。該基因編碼439個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為50.73 kDa, 等電點(diǎn)為5.15, 含有7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及8個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)糖基化位點(diǎn)。SMART和NCBI預(yù)測(cè)凡納濱對(duì)蝦ACP的結(jié)構(gòu)域, 結(jié)果顯示, 第230~429位置的氨基酸為ACP的結(jié)構(gòu)域MPP_PAPs (purple acid phosphatases of the metallophosphatase superfamily)(圖1B)。

2.2 空間結(jié)構(gòu)模擬

采用SWISS-MODEL軟件的同源建模方法, 分別將ALP蛋白序列和ACP蛋白序列與軟件搜索得到的模(PDB code: 1shq.1和PDB code: 2qfr.1), 人工進(jìn)行聯(lián)配, 以ALP和ACP推導(dǎo)的氨基酸構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)(圖2), ALP有42個(gè)α-螺旋, 58個(gè)β-折疊和111個(gè)β-轉(zhuǎn)角, ACP有8個(gè)α-螺旋, 30個(gè)β-折疊和50個(gè)β-轉(zhuǎn)角。

上面大寫(xiě)字母為核苷酸序列, 下面字母為對(duì)應(yīng)的編碼的氨基酸序列; 起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAG)用加粗標(biāo)示; 絲氨酸、酪氨酸以及蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)分別用“□, =, _”標(biāo)示; alkPPc(ALP的結(jié)構(gòu)域)以及MPP_PAPS(ACP的結(jié)構(gòu)域)用灰色底紋標(biāo)示

Capital letters separated by spacesrepresent the coding sequence, with the nucleotide sequence above. The initiation codon(ATG) and the stop codon(TGA) arecharacterized in bold. Potential phosphorylation sitesof the Ser, Tyr and Thr are indicated by “□, =, _” respectively.The alkPPc domain and MPP_PAPS are shaded

2.3 多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

使用BioEdit軟件將已推導(dǎo)的ALP和ACP氨基酸序列和其他物種的ALP和ACP進(jìn)行多序列比對(duì)。經(jīng)過(guò)比對(duì)可知: 凡納濱對(duì)蝦ALP與濕木白蟻()、北方長(zhǎng)額對(duì)蝦()的ALP氨基酸序列的一致性相對(duì)較高,可達(dá)到44%、46%, 與斑馬魚(yú)()、小鼠()、人()的一致性相對(duì)較低分別為37%、36%、36%(圖3); 凡納濱對(duì)蝦ACP氨基酸序列與致倦庫(kù)蚊()的ACP氨基酸序列的一致性較高可達(dá)到54%, 與果蠅()、小鼠、人的氨基酸序列一致性較低分別為12%、9%、8%(圖4)。

根據(jù)NCBI上已有的ALP和ACP氨基酸序列, 利用MEGA4.0軟件, 以鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明, 在無(wú)脊椎動(dòng)物里, 凡納濱對(duì)蝦ALP與北方長(zhǎng)額對(duì)蝦ALP遺傳距離較近聚成一支, 并且它們與濕木白蟻聚成了節(jié)肢動(dòng)物獨(dú)立的一支, 其他物種和凡納濱對(duì)蝦ALP距離較遠(yuǎn)(圖5)。凡納濱對(duì)蝦ACP與羅氏沼蝦()ACP遺傳距離較近聚成了一支, 并且它們與致倦庫(kù)蚊聚成了一支, 其他物種和凡納濱對(duì)蝦ACP距離較遠(yuǎn)(圖6)。

左側(cè)物種名稱及相應(yīng)的登錄號(hào)分別為: 凡納濱對(duì)蝦(ALC78852.1); 北方長(zhǎng)額對(duì)蝦(CAC35697.1); 斑馬魚(yú)(AFU97155); 小鼠(CAA31775); 人(AAH09647); 濕木白蟻(KDR12134.1)。ALP核心結(jié)構(gòu)用方框標(biāo)示, 酶活性中心區(qū)域用“▲”標(biāo)示, 保守的Cys用黑體加陰影標(biāo)示, N糖基化位點(diǎn)下劃線標(biāo)示。可能的Mg結(jié)合位點(diǎn)用“■”表示, Ca結(jié)合位點(diǎn)用“□”標(biāo)示, Zn1+結(jié)合位點(diǎn)用“●”標(biāo)示。Bioedit比對(duì)后相同氨基酸殘基用“*”標(biāo)示, 相似的氨基酸殘基分別用“:”或“.”標(biāo)示

Species are listed on the left in the figure and given here with their Genbank Accession numbers:(ALC78852.1);(CAC35697.1);(AFU97155);(CAA31775);(AAH09647); and(KDR12134.1). Boxed aminoacids correspond to the ALP domain. Cysteins are shaded in black. The active site is marked with “▲”. The putative N-glycosylation sites are underlined. Residues predicted to bind to magnesium “■”, to calcium “□” and to Zn1+“●” are indicated. Identical “*” and similar “:” or “.” residues identified by the ClustalW program are indicated

左側(cè)物種名稱及相應(yīng)的登錄號(hào)分別為: 凡納濱對(duì)蝦(ALC78849.1); 人(NP_149059.1); 果蠅(BAF47908.1); 小鼠(NP_001181963.1); 致倦庫(kù)蚊(XP_001851362.1); 凡納濱對(duì)蝦ACP的核心結(jié)構(gòu)域用方框標(biāo)示, 保守的Cys用黑體加陰影標(biāo)示, N糖基化位點(diǎn)下劃線標(biāo)示。金屬離子結(jié)合位點(diǎn)用“■”標(biāo)示。Bioedit比對(duì)后相同氨基酸殘基用“*”標(biāo)示, 相似的氨基酸殘基分別用“:”或“.”標(biāo)示

Species are listed on the left in the figure and given here with their Genbank Accession numbers:(ALC78849.1),(NP_149059.1),(BAF47908.1),(NP_001181963.1), and(XP_001851362.1).Boxed aminoacids correspond to the ACP domain. Cysteins are shaded in black. The putative N-glycosylation sites are underlined. Residues predicted to bind to metal ions “■” are indicated. Identical “*” and similar “:” or “.” residues identified by the ClustalW program are indicated

2.4 ALP基因以及ACP基因mRNA組織表達(dá)模式

凡納濱對(duì)蝦ALP和ACP在各組織中的表達(dá)結(jié)果分別如圖7A和圖7B所示。在5個(gè)組織中均檢測(cè)到ALP基因mRNA且組織分布存在差異, ALP在肝胰腺中表達(dá)量最高, 且明顯高于其他組織(<0.05), 在腸中表達(dá)量最低, 且明顯低于其他組織(<0.05), 在肌肉、鰓和胃組織中未產(chǎn)生明顯差異。同樣, 在5個(gè)組織中也均檢測(cè)到了ACP 基因mRNA表達(dá), ACP基因在肝胰腺和鰓中表達(dá)量較高, 且明顯高于其他組織(<0.05), 在肌肉、胃和腸中表達(dá)量較低, 并且未產(chǎn)生顯著性差異。

2.5 鹽度調(diào)控ALP和ACP表達(dá)規(guī)律

由圖8A可知, 在不同鹽度下, ALP基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律不同。在胃和鰓中, 31鹽度組ALP基因的表達(dá)量均顯著高于16和3鹽度組(<0.05), 16鹽度組和3鹽度組之間差異不明顯; 在肝胰腺和腸道中, 16鹽度組ALP基因的表達(dá)量均明顯低于31和3鹽度組<0.05), 而31和3鹽度組之間未產(chǎn)生明顯差異。在肌肉中的表達(dá)規(guī)律與其他組織均不同, 31鹽度組表達(dá)量最高, 其次是3鹽度組, 而16鹽度組表達(dá)量最低, 且3組之間存在顯著性差異(<0.05)。

由圖8B可知, 在不同鹽度下, ACP基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律也不相同。在肝胰腺中, 31鹽度組ACP基因的表達(dá)量明顯低于16和3鹽度組(<0.05), 而16和3鹽度組之間沒(méi)有明顯差異; 在肌肉和鰓中, 31鹽度組ACP基因的表達(dá)量最高, 明顯高于16和3鹽度組(<0.05), 16和3兩組之間差異不明顯; 在腸道中, 3組鹽度組ACP基因的表達(dá)量明顯高于其余兩個(gè)鹽度組(<0.05), 其余兩個(gè)鹽度組之間沒(méi)有顯著性差異; 而在胃中, 3個(gè)鹽度組之間ACP基因的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。

. 凡納濱對(duì)蝦;. 斑馬魚(yú);. 人;. 大黃魚(yú);. 小鼠;. 大西洋鮭;. 濕木白蟻;. 牛;. 獼猴;. 北方長(zhǎng)額對(duì)蝦;. 合浦珠母貝;. 非洲爪蟾

. 凡納濱對(duì)蝦;. 人;. 密西西比鱷;. 致倦庫(kù)蚊;. 家鼠;. 家牛;. 羅氏沼蝦;. 馬氏珠母貝;. 非洲爪蟾

不同字母表示結(jié)果之間存在顯著性差異(<0.05)

Different letters indicate a significant difference(<0.05)

同一組織之間不相同字母表示存在顯著性差異(<0.05)

Different letters from the same group indicate a significant difference(<0.05)

3 討論

3.1 凡納濱對(duì)蝦ALP和ACP結(jié)構(gòu)及組織分布

磷酸酶作為生物體內(nèi)廣泛存在的單酯水解酶, 在人、鼠、牛等方面的研究較為廣泛。磷酸酶基因的研究在人和鼠中的報(bào)道較為豐富, 但是在水生動(dòng)物中的研究較多集中于組織學(xué)、酶的生化性質(zhì)等方面, 關(guān)于基因的表達(dá)和調(diào)控的報(bào)道還不多[16]。本實(shí)驗(yàn)采用RACE的方法[17]克隆出凡納濱對(duì)蝦ALP和ACP基因的全長(zhǎng)cDNA序列。ALP基因(GenBank登錄號(hào): R534873.1)共編碼536個(gè)氨基酸, 其編碼的氨基酸序列和濕木白蟻、北方長(zhǎng)額對(duì)蝦等ALP氨基酸有一定的相似性(45%~47%), 多重比對(duì)結(jié)果表明, 不同物種的ALP具有較高的相似性, 具有多個(gè)與Mg離子和Zn離子的結(jié)合位點(diǎn), 并且具有ALP家族共有的alkPPC結(jié)構(gòu)域和ALP家族的保守序列[18]。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明, 凡納濱對(duì)蝦ALP和羅氏沼蝦ALP聚為一支, 比和濕木白蟻這類(lèi)節(jié)肢動(dòng)物的親緣關(guān)系更進(jìn)一步。另外本實(shí)驗(yàn)克隆得到的ACP基因(GenBank登錄號(hào): KR676449.1)共編碼439個(gè)氨基酸, 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)以β-折疊為主, 僅含有少量的α-螺旋。從NCBI查找其他物種的ACP氨基酸序列, 多重比對(duì)結(jié)果顯示, 其編碼的氨基酸序列和致倦庫(kù)蚊、羅氏沼蝦等有較高的相似性(54%~57%), 具有ACP基因家族的核心結(jié)構(gòu)域MPP_PAPs, 含有可能與金屬離子結(jié)合的多個(gè)位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明, 凡納濱對(duì)蝦ACP與羅氏沼蝦ACP聚為一支, 并且這兩個(gè)物種與致倦庫(kù)蚊構(gòu)成了節(jié)肢動(dòng)物分支, 符合生物進(jìn)化理論。

目前, ALP基因在動(dòng)物中進(jìn)行了廣泛的研究, ALP基因是在脊椎動(dòng)物發(fā)育中的表達(dá)水平在時(shí)間和組織特異性方面有所不同[19]。有研究報(bào)道, 人和鼠的基因已經(jīng)被克隆[20], 并且在人和鼠中存在多種ALP, 在人和鼠中分別具有3種和2種組織特異性ALP[21], 分別是人的腸ALP、胎盤(pán)ALP和生殖細(xì)胞ALP; 小鼠的腸ALP和胚胎ALP[22]。在人和鼠中還具有一種組織非特異性的ALP(tissue-non-specific alkaline posphatase), 在肝、早期胚胎、腎以及骨骼等多種組織中表達(dá)。同時(shí)有研究報(bào)道, 文昌魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中存在腸特異性ALP和非組織特異性2種ALP[21]。施志儀[16]等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 牙鲆ALP是組織非特異性的堿性磷酸酶類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)中, RT-PCR結(jié)果顯示, ALP基因在凡納濱對(duì)蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸和鰓5個(gè)組織中均有表達(dá), 從其mRNA的表達(dá)特點(diǎn)可知, ALP在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的分布是組織非特異性的ALP, 但是肝胰腺和鰓中表達(dá)量較高, 在肌肉、胃和腸中的表達(dá)量較低, 說(shuō)明ALP基因的表達(dá)水平在不同組織中存在差異性[23], 張輝[24]在對(duì)日本沼蝦的研究同樣表明了ALP基因在不同組織中的表達(dá)水平具有差異性。ALP是有一個(gè)多基因家族編碼, 在動(dòng)物的早期發(fā)育時(shí)期存在多種類(lèi)型, 對(duì)于ALP在凡納濱對(duì)蝦發(fā)育時(shí)期是否存在其他種類(lèi), 有待進(jìn)一步研究。ACP同樣是生物體內(nèi)分布很廣的磷酸酶類(lèi), 從低等生物大腸桿菌、酵母到高等動(dòng)植物體液、組織到人類(lèi)肝臟、前列腺等都廣泛存在[25]。但是目前的研究也多集中在ALP方面, 對(duì)于水生動(dòng)物的ACP表達(dá)分布研究較為匱乏, 本研究表明, 與ALP一樣, ACP在對(duì)蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸道和鰓中都普遍存在, 是組織非特異性的磷酸酶, 但是在不同組織中ACP的表達(dá)水平是不同的并且存在差異性, 至于在發(fā)育時(shí)期是否和ALP一樣存在多種類(lèi)型, 需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

3.2 鹽度調(diào)控對(duì)ALP基因和ACP基因的影響

ALP和ACP是生物代謝的重要酶類(lèi), 參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)以及對(duì)蝦體內(nèi)能量的收支平衡, 當(dāng)機(jī)體處于耗能狀態(tài)時(shí), ALP和ACP參與機(jī)體內(nèi)的能量代謝并且釋放能量, 來(lái)滿足機(jī)體生命活動(dòng)的需要。

當(dāng)機(jī)體處于高鹽環(huán)境時(shí), 凡納濱對(duì)蝦需將體內(nèi)多余的鹽分排出體外, 在較低的鹽度條件下又需要補(bǔ)入鹽分, 這個(gè)過(guò)程中, 凡納濱對(duì)蝦要消耗體內(nèi)儲(chǔ)存的能量進(jìn)行滲透調(diào)節(jié), 來(lái)維持機(jī)體內(nèi)正常的水分[26]。有研究認(rèn)為凡納濱對(duì)蝦的最適生長(zhǎng)鹽度在14~22[10], 當(dāng)機(jī)體處于這一鹽度下, 維持滲透壓所需要消耗的能量較少, 鹽度低于10和高于26時(shí), 因?yàn)樽陨泶嬖谳^大的滲透壓差, 蝦體為維持自身的滲透壓平衡, 消耗更多的能量, 并且有研究認(rèn)為肌肉、胃、腸和鰓作為機(jī)體的排鹽器官[27], 在機(jī)體機(jī)體調(diào)節(jié)滲透壓的過(guò)程中起著十分重要的作用。本次試驗(yàn)過(guò)程中, ALP基因在肌肉、胃、鰓和腸4個(gè)組織中在16的鹽度中表達(dá)量最低, ACP基因在以上4個(gè)組織中也具有相同的表達(dá)規(guī)律, 可能是因?yàn)楫?dāng)對(duì)蝦處于16的環(huán)境時(shí), 更接近它的等滲點(diǎn)(25)和最適生長(zhǎng)鹽度(14~22), 用于維持滲透壓所需要的的能量較少, 從而使ALP和ACP在排鹽器官中的表達(dá)量相對(duì)于原環(huán)境31的表達(dá)量有所減少, 當(dāng)機(jī)體處于3時(shí), 推測(cè)在耗能的過(guò)程可能刺激了ALP和ACP在排鹽器官中的表達(dá), 參與能量的代謝過(guò)程, 釋放出能量, 以維持機(jī)體對(duì)能量的需求。

在甲殼動(dòng)物所有組織中, ACP作為一種參與機(jī)體代謝和免疫的酶類(lèi), 廣泛分布于動(dòng)物組織中, 在人體主要存在于肝臟、脾臟、紅細(xì)胞和骨髓等部位[28]。ACP不僅參與磷酸酯代謝, 在酸性條下催化磷酸單酯水解, 在代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)化及信號(hào)傳導(dǎo)上起著重要作用。同時(shí), 作為溶酶體標(biāo)志酶, 參與消化生物大分子以維持細(xì)胞的正常代謝活動(dòng), 參與清除衰老或死亡的細(xì)胞和細(xì)胞器。參與識(shí)別、吞噬和降解入侵的病原體, 在免疫防護(hù)方面起重要作用[19], 同時(shí)肝胰腺是對(duì)蝦重要的器官之一, 是眾多生命大分子的主要合成場(chǎng)所, 在合成和分解代謝等方面具有重要功能[29], 組織細(xì)胞中的離子水平穩(wěn)定性對(duì)其完成正常生理功能非常重要[30]。不同鹽度養(yǎng)殖后, 肝胰腺中ACP基因在3和16兩組鹽度中表達(dá)量相對(duì)較高, 與其他組織的表達(dá)規(guī)律不同, 可能與凡納濱對(duì)蝦的機(jī)體的免疫狀態(tài)和機(jī)體器官有關(guān)系, 有關(guān)低鹽養(yǎng)殖中ACP在不同組織中的表達(dá)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

目前有關(guān)鹽度對(duì)于ALP和ACP影響的研究多集中在酶活方面, 通過(guò)鹽度脅迫來(lái)觀察酶活力的變化情況。有研究表明在對(duì)蝦的組織中, 鹽度為16組的ALP和ACP的活力明顯高于32和4組[31], 在對(duì)蝦肝胰腺中30組的ALP和ACP活力高于1.5[27]。李華[31]的研究中, 設(shè)置3個(gè)鹽度組(4、18、32)養(yǎng)殖30 d, 在0~15d內(nèi)對(duì)蝦必須進(jìn)行不斷的滲透調(diào)節(jié)而達(dá)到新的滲透平衡狀態(tài), 進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)蝦體內(nèi)(血淋巴組織)免疫生理指標(biāo)發(fā)生了變化, 15~30d時(shí), 各鹽度組對(duì)蝦體內(nèi)的免疫生理指標(biāo)(堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶)均趨于穩(wěn)定, 30 d的測(cè)定結(jié)果與15 d時(shí)相比差異很小, 鹽度32組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 未經(jīng)歷鹽度馴化過(guò)程, 各指標(biāo)表現(xiàn)基本穩(wěn)定。結(jié)果表明, 當(dāng)凡納濱對(duì)蝦適應(yīng)了新的養(yǎng)殖環(huán)境后, 各項(xiàng)免疫生理指標(biāo)均在鹽度18時(shí)最高, 鹽度4時(shí)次之, 鹽度32時(shí)最低, 鹽度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生不利的影響。梁萌青[28]研究發(fā)現(xiàn), 水體鹽度為30的凡納濱對(duì)蝦肝胰臟堿性磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性明顯高于1.5組的養(yǎng)殖對(duì)蝦。在本次試驗(yàn)中凡納濱對(duì)蝦經(jīng)過(guò)45 d的鹽度脅迫后, ALP和ACP基因的相對(duì)表達(dá)量在不同組織中的表達(dá)規(guī)律與現(xiàn)階段報(bào)道的酶活力的規(guī)律有所不同, 有研究認(rèn)為鹽度調(diào)控后, ALP和ACP基因在表達(dá)ALP和ACP的過(guò)程中的這些不同, 可能與蛋白質(zhì)合成的活性的迅速變化有關(guān)[32]。同時(shí)推測(cè)這些變化可能與組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及組織特性有關(guān), 在這個(gè)過(guò)程中發(fā)生的具體變化有待進(jìn)一步的研究。

綜上, 本實(shí)驗(yàn)從凡納濱對(duì)蝦中成功克隆到ALP和ACP基因的cDNA全長(zhǎng), 利用RT-PCR研究了不同鹽度下ALP和ACP基因在不同組織中表達(dá)情況, 這些數(shù)據(jù)可以為研究低鹽養(yǎng)殖環(huán)境下凡納濱對(duì)蝦的磷酸酶類(lèi)分子機(jī)制提供參考。

[1] 彭永興, 許祥, 程玉龍, 等. 海水和淡水養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的比較[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014, 32(8): 435-440. Peng Yongxing, Xu Xiang, Cheng Yulong, et al. Comparative analysis of nutrients in muscles of Pacific white leg shrimpcultured in seawater and freshwater[J]. Fisheries Science, 2014, 32(8): 435-440.

[2] 邱楚雯, 劉梅, 王寶杰, 等. 中國(guó)明對(duì)蝦血藍(lán)蛋白C末端片段在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性[J]. 海洋科學(xué), 2013, 37(6): 1-7. Qiu Chuwen, Liu Mei, Wang Baojie, et al. Recombinant expression and antimicrobial activity analysis of hemocyanin C-terminal fragments fromin[J]. Marine Sciences, 2013, 37(6): 1-7.

[3] 張立田. 水體中主要離子對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)存活、風(fēng)味及體內(nèi)代謝酶的影響[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2012: 5-7. Zhang Litian. Effect of major ions in water on survival and growth, shrimp taste, metabolic enzymes of[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2012: 5-7.

[4] 沈麗瓊. 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)與免疫功能的影響[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 12(2): 108-113. Shen Liqiong. Growth and immunities of the shrimp,(Boone) exposed to different salinity levels[J]. Journal of Jimei University, 2007, 12(2): 108-113.

[5] Ruscoe I M, Shelley C C, Williams G R. The combined effects of temperature and salinity on growth and survival of juvenile mud crabs (Forskal) [J]. Aquaculture, 2004, 238(14): 239-247.

[6] Castille F L, Lawrence A L. The effect of salinity on the osmotic, sodium and chloride concentrations in the hemolymph of euryhaline shrimp of the genus[J]. Comp Biochem Physiol A, 1981, 68(1): 75-80.

[7] Samocha T M, Lawrence A L, Pooser D, et al. Growth and survival of juvenilein low salinity water in a semi-closed recirculating system[J]. Israeli Journal of Aquaculture, 1998, 50(2): 55-59.

[8] Bray W A, Lawrence A L, Leung-Trujillo J R, et al. The effect of salinity on growth and survival of, with observations on the interaction of IHHN virus and salinity[J]. Aquaculture, 1994, 122: 133-146.

[9] Ponce-Palafox J, Martinez-Palacios C A, Ross L G, et al. The effects of salinity and temperature on the growth and survival rates of juvenile white shrimp,Boone[J]. Aquaculture, 1997, 157: 107-115.

[10] 朱春華. 鹽度對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2002, 3: 25-27. He Chunhua. The influence of salinity on South America white shrimp growth performance[J].Agriculture, 2002, 3: 25-27.

[11] 何海琦, 孫鳳. 中國(guó)對(duì)蝦酸性和堿性磷酸酶的特性研究[J]. 海洋與湖沼, 1992, 23(5): 555-560. He Haiqi, Sun Feng. The study of’ acid phosphataseand and alkaline phosphatase featuer[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 1992, 23(5): 555-560.

[12] 李海兵. 對(duì)蝦腸道益生菌的篩選與免疫活性評(píng)價(jià)指標(biāo)的建立[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2008: 81-82. Li Haibing. Probiotic bacteria isolated from intestinal of shrimps and establishment of evaluable index of immune[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2008: 81-82.

[13] 陳瑛, 邱子健, 隋淑光, 等. 棘尾蟲(chóng)酸性磷酸酶的定位及誘導(dǎo)表達(dá)[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2003, 49(2): 218-223. Chen Ying, Qiu Zijian, Sui Shuguang, et al. Localization of ACPase and its expression by induction in[J]. Acta Zoologica Sinica, 2003, 49(2): 218-223.

[14] Pipe R K. Hydrolytic enzymes associated with the granular haemocytes of the marine mussel mytilus edulis[J]. Histochem, 1990, 22: 596-603.

[15] 孫姝娟, 劉梅, 彭勁松, 等. 中國(guó)明對(duì)蝦TOR基因的克隆及精氨酸、亮氨酸對(duì)其表達(dá)的影響[J]. 海洋科學(xué), 2010, 34(6): 71-80. Sun Shujuan, Liu Mei, Peng Jinsong, et al. Molecularcloning of the TOR gene fromand its expression in response to arginine or leucine[J]. Ocean Science, 2010, 34(6): 71-80.

[16] 施志儀, 顧一峰, 陳曉武, 等. 牙鲆堿性磷酸酶基因5'調(diào)控區(qū)的克隆及其功能檢測(cè)[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2008, 2: 207-213. Shi Zhiyi, Gu Yifeng, Chen Xiaowu, et al. Cloning and function detection of 5' regulation region of alkaline phosphatase from Japanese flounder[J]. Biotechnology Bulletin, 2008, 2: 207-213.

[17] 黃培堂, 俞煒源, 陳添彌, 等. PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1998: 267-288. Huang Peitang, Yu Weiyuan, Chen Tianmi, et al. The Experiment Guide of PCR Technology[M]. Beijing: Science Press, 1998: 267-288.

[18] 馮建軍, 姚志剛, 張子平, 等. 大黃魚(yú)堿性磷酸酶基因的克隆及表達(dá)特征分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014, 38(9): 1243-1254. Feng Jianjun, Yao Zhigang, Zhang Ziping, et al. Molecular cloning and expression analysis of alkaline phosphatase gene in[J]. Journal of Fisheries of China, 2014, 38(9): 1243-1254.

[19] 王書(shū)平, 孔祥會(huì), 江紅霞, 等. 金魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中磷酸酶活性的變化[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2011, 30(7): 405-408. Wang Shuping, Kong Xianghui, Jiang Hongxia, et al. Changes in activities of acid phosphatase and alkaline phosphatase during embryonic development of goldfish,[J]. Fisheries Science, 2011, 30(7): 405-408.

[20] Manes T. Genomic structure and comparison of mouse tissue-specific alkaline phosphatase genes[J]. Genomics, 1990, 8: 541-554.

[21] 毛炳宇, 李艷, 張紅衛(wèi). 文昌魚(yú)早期發(fā)育中兩種堿性磷酸酶的表達(dá)[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 36(3): 336-340. Mao Bingyu, Li Yan, Zhang Hongwei. Expression pattern of alkaline phosphatase in amphioxus embyro and larva[J]. Jounal of Shandong University, 2001, 36(3): 336-340.

[22] Narisawa S. Embryonic alkaline phosphatase is expressed at M-phase in the spermatogenic lineage of the mouse[J]. Development, 1992, 116: 159-165.

[23] 田娟, 施志儀. 堿性磷酸酶在大菱鲆不同組織的表達(dá)及其與甲狀腺激素的關(guān)系[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2011, 18(1): 208-213. Tian Juan, Shi Zhiyi. Expression of alkaline phosphatase (ALP) gene in tissues ofmaximus and relationship between thyrid hormoneand alkalin phosphatase[J]. Journal of Fishery Sciencesof China, 2011, 18(1): 208-213.

[24] 張輝. 日本沼蝦肝胰腺堿性磷酸酶的純化及特性研究[D]. 河北: 河北大學(xué), 2000: 6-8. Zhang Hui. The purification and feature study of alkaline phosphatase in the hepatopancreas of[D]. Hebei: Hebei University, 2000: 6-8.

[25] 鄭明慧, 胡坤華, 張彤. 華支睪吸蟲(chóng)膜抗原/排泄分泌抗原酸性磷酸酶的克隆、表達(dá)、生物學(xué)特征分析及組織定位[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(11): 2059- 2065. Zheng Minghui, Hu Kunhua, Zhang Tong. Cloning, expression, biological characteristics and tissue localization of amembrane antigen / excretory-secretory antigen, acid phosphatase [J]. Chinese Journal of Pathophysiology, 2014, 30(11): 2059- 2065.

[26] 王興強(qiáng), 馬甡, 董雙林. 凡納濱對(duì)蝦生物學(xué)及養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 海洋湖沼通報(bào), 2004, 4(16): 94- 100. Wang Xingqiang, Ma Shen, Dong Shuanglin. Studies on the biology and cultural ecology of: a review[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2004, 4(16): 94-100.

[27] 李二超. 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生理影響及其營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2008: 18-20. Li Erchao. Physiological effects of ambient salinity onand nutrient modulation[D]. Shanghai: East China Normal University, 2008: 18-20.

[28] 梁萌青, 王士穩(wěn), 王家林, 等. 海水養(yǎng)殖與低鹽養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、酶活及RNA/DNA比值的差異[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2008, 29(4): 69-73. Liang Mengqing, Wang Shiwen, Wang Jialin, et al. Differencein growth performance, ACP and AKP aetivity and RNA/DNA ratio ofcultured in seawater and low salinity water[J]. Marine Fisheries Research, 2008, 29(4): 69-73.

[29] 朱孟凱, 姚翠鸞. 溫度脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺氧代謝及能量代謝的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2015, 39(9): 669- 678. Zhu Mengkai, Yao Cuiluan. The impact of temperature stress on the oxygen metabolism and energy metabolism in the hepatopancreas of shrimp[J]. Journal of Fisheries of China, 2015, 39(9): 669-678.

[30] 孔祥會(huì), 王桂忠, 李少菁, 等. 低溫馴化下鋸緣青蟹肝胰腺的抗氧化效應(yīng)及ATPase活性變化[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2005, 12(6): 708-713. Kong Xianghui, Wang Guizhong, Li Shaoqing, et al. Antioxidant effects and ATPase activity changes in hepatopancreas of mud crabunder low temperature acclimation[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2005, 12(6): 708-713.

[31] 李華, 李強(qiáng), 曲健鳳, 等. 不同鹽度下凡納濱對(duì)蝦血淋巴免疫生理指標(biāo)比較[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 37(6): 927-930. Li Hua, Li Qiang, Qu Jianfeng, et al. Comparison of immune and physiological parameters in the haemolymph ofat different salinities[J]. Periodical of Ocean University of China, 2007, 37(6): 927-930.

[32] Wang Weina, Wang Anli, Bao Lai, et al. Changes of protein-bound and free amino acids in the muscle of the freshwater prawnin different salinities[J]. Aquaculture, 2004, 233: 561-571.

cDNA cloning and gene expressionin response to salinity of alkaline phosphatase and acid phosphatase from

ZHANG Ming-ming1, 3, WANG Lei2, 3, WANG Bao-jie2, 3, LIU Mei2, 3, ZHAN Wen-bin1, JIANG Ke-yong2, 3

(1. Fisheries College, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

In this study, alkaline phosphatase (ALP) and acid phosphatase (ACP) genes were cloned fromby the rapid amplification of cDNA endsmethod.The full-length cDNA sequence of ALP was 1 910 bp, encoding 536 amino acids, whereas the full-length cDNA sequence of ACP was 1 544 bp, encoding 439 amino acids.A salinity regulation experiment was performed with three treatments: 31‰ (control), 16‰, and 3‰ salt water.ALP and ACP gene expression was determined in tissues of the hepatopancreas, muscle, stomach, intestine and gills with real-time PCR after 45 days in saline. RT-PCR reveals that the ALP gene was detected in five tissues with the highest expression in the hepatopancreas(<0.05) and the lowestin theintestine (<0.05). The ACP gene was also detected in five tissues, and the gene expression in the hepatopancreas and gills was higher than that in the other tissues (<0.05). After the salinity regulation experiment, the ALP and ACP genes presented different expression patterns among the various tissues. In the stomach and gill tissues, the higher expression level of the ALP gene occurred in the 31‰ saline group compared with the other two salinity groups (<0.05); in the hepatopancreas and intestinal tissues, the expression level of the ALP gene in the 16‰ saline group was significantly lower than that in the other two salinity groups (<0.05); in muscle tissue, the expression level of the ALP gene was the highest in the 31‰ saline group (<0.05) and the lowest in the 16‰ salinegroup (<0.05). Whereas in the hepatopancreas, the expression level of the ACP gene in the 31‰ salinegroup was significantly lower than that in the other two salinity groups (<0.05); in muscle and gill tissues, the expression level of the ACP gene in the 31‰ salinegroup was significantly higher than that in the other two salinity groups (<0.05); in the intestines, the expression of the ACP gene was the highest in the 3‰ salinegroupand was significantly higher than that in the other two groups (<0.05); in the stomach, the expression level of the ACP gene was not significantly different among the three groups. These results provide useful data for the molecular mechanism ofphosphatase metabolism under conditions of low salinity.

; alkaline phosphatase; acid phosphatase; cloning and expression; salinity

S968.22

A

1000-3096(2017)01-0083-13

10.11759//hykx20160112002

2016-01-12;

2016-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41271547, 41401644); 中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)(XDA05010400)

張明明(1989-), 女, 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖工作, 電話: 13075370324, E-mail: zmm15092858971@163.com;蔣克勇, 通信作者, E-mail: jiangkeyong@qdio.ac.cn

Jan. 12, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.41271547,41401644; Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No.XDA05010400]

(本文編輯: 譚雪靜)