山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落多樣性分析

付新華, 劉國(guó)寧, 何健龍, 馬元慶, 宋秀凱, 孟 麗, 賈青妹

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山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落多樣性分析

付新華1, 劉國(guó)寧2, 何健龍3, 馬元慶3, 宋秀凱3, 孟 麗1, 賈青妹1

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山東濰坊261053; 2. 濰坊市海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站, 山東濰坊261041; 3. 山東省海洋環(huán)境與資源研究院, 山東煙臺(tái) 264006)

海洋微生物在生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)中發(fā)揮重要作用。為系統(tǒng)了解山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)表層海水微生物群落多樣性, 作者利用Illumina高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析技術(shù)研究了12個(gè)水體樣本的菌群構(gòu)成和多樣性特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 山東渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落豐富, 12個(gè)水體樣品OTU分屬于25門、56綱、103目、163科、227屬; 門、綱、目、科、屬分類等級(jí)上的優(yōu)勢(shì)類群分別為變形菌門(Proteobacteria)(57.95%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)(21.88%)、黃桿菌目(Flavobacteriales) (4.31%)、紅細(xì)菌Rhodobacteraceae)(10.68%)、(7.94%); 保護(hù)區(qū)內(nèi)表層海水微生物具有其獨(dú)特的菌群特征和多樣性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)海洋微生物多樣性與海洋生態(tài)環(huán)境保護(hù)的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

渤海海洋保護(hù)區(qū); 微生物群落; 多樣性分析

海洋微生物的種類繁多, 包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌等, 物種數(shù)高達(dá)2億~10億[1], 它們?cè)谏鷳B(tài)系統(tǒng)循環(huán)和生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)中都發(fā)揮重要作用。因此, 海洋微生物研究已成為當(dāng)今的一大熱點(diǎn), 并涉及環(huán)境、生態(tài)、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。王家生等[2]分析了海洋極端環(huán)境微生物活動(dòng)與油氣資源的關(guān)系; 余玥[3]研究了深海極端微生物正青霉(sp.)的化學(xué)成分。許多研究人員還從海洋微生物中分離得到多種糖類、肽類、甾醇類等具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等作用的活性物質(zhì)[4-6]。海洋微生物多樣性研究對(duì)了解群落結(jié)構(gòu)間的動(dòng)態(tài)變化及其生態(tài)功能、修復(fù)海洋生態(tài)系統(tǒng)以及微生物資源的合理開(kāi)發(fā)均具有重要意義。

Y市魔芋種植歷史悠久，是魔芋產(chǎn)地、粗加工及魔芋精粉配送的中心位置，被譽(yù)為“魔芋之鎮(zhèn)”。2014年，Y市還被中國(guó)魔芋協(xié)會(huì)評(píng)為全國(guó)九大“魔芋工業(yè)基地”之一，并且獲得了“農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志”的稱號(hào)。多年來(lái)，Y市當(dāng)?shù)剞r(nóng)科院、加工企業(yè)與省市技術(shù)部門合作，開(kāi)展了一系列有關(guān)魔芋的種植研究，包含魔芋高產(chǎn)新品種的選育、主要病害生態(tài)學(xué)及綜合防治技術(shù)研究等，使得Y市魔芋種植技術(shù)處于領(lǐng)先地位，科技含量高。

傳統(tǒng)的海洋微生物多樣性研究方法如平板培養(yǎng)法、核酸分子RFLP、DGGE等方法, 極大地促進(jìn)了海洋微生物生態(tài)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。但是這些方法僅能測(cè)定海水中的部分微生物種類, 而且靈敏度不夠高。高通量測(cè)序, 如454 Life Sciences公司及Illumina公司的第二代測(cè)序技術(shù)以及其他的單分子測(cè)序技術(shù)等, 以同時(shí)對(duì)上萬(wàn)的基因位點(diǎn)進(jìn)行分析為特色, 具有大規(guī)模平行測(cè)序、進(jìn)行定量等優(yōu)點(diǎn), 越來(lái)越多地用于基因組分析, 涉及基因測(cè)序和基因組學(xué)研究等多個(gè)方面[7-8]。而Illumina測(cè)序技術(shù)又具有低錯(cuò)誤率和低成本的優(yōu)點(diǎn), 使得簡(jiǎn)單、快速、較準(zhǔn)確地獲取海水微生物信息成為可能。16S rDNA是原核生物基因組中的高保守性和高特異性的DNA序列, 對(duì)其進(jìn)行序列分析已成為檢測(cè)和鑒定微生物的重要手段[9]。16S rDNA由保守區(qū)和高變區(qū)組成, 利用高變區(qū)可進(jìn)行物種多樣性分析[10]。對(duì)擴(kuò)增后的16S rDNA高變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序避免了海洋微生物難純培養(yǎng)等的困擾, 可使操作簡(jiǎn)單、分析全面而準(zhǔn)確。

渤海為中國(guó)唯一內(nèi)海, 資源豐富, 其中漁業(yè)、港口、石油、旅游和海鹽是渤海的五大優(yōu)勢(shì)資源, 但是近封閉的內(nèi)海特征使得其水體交換能力很差。作為黃河、遼河、海河三大水系的匯聚地, 環(huán)渤海區(qū)域在經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的同時(shí), 其海區(qū)亦飽受污染事故的影響。海洋污染對(duì)海洋生物生存造成嚴(yán)重危害, 并影響了其生物多樣性[11]。雖為中國(guó)重要海域, 但是對(duì)渤海海洋微生物資源研究較少, 且主要集中在海洋沉積物微生物上[12-14]; 而海水微生物則鮮有報(bào)道, 僅限于采用非高通量測(cè)序方法的研究[15-16]。是以保護(hù)海洋自然環(huán)境為目的, 依法對(duì)具有特殊保護(hù)價(jià)值的海域、海岸、河口、島嶼等劃出一定面積予以特殊保護(hù)和管理的海洋相關(guān)區(qū)域。本研究采用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái), 研究了山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落多樣性, 本研究結(jié)果將對(duì)該海域生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)修復(fù)和微生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況、海水樣品采集與微生物收集

山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)位于山東省渤海區(qū)境內(nèi), 是為保護(hù)貝類、魚(yú)類等重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象、有關(guān)部門在山東省渤海區(qū)海域設(shè)立的海洋保護(hù)區(qū)。作者于2014年秋季在保護(hù)區(qū)內(nèi)選取了12個(gè)采樣點(diǎn), 采樣點(diǎn)位置見(jiàn)圖1, 取每個(gè)點(diǎn)的表層海水1 L, 封存后立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室供實(shí)驗(yàn)分析用。取樣及封存方法根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB17378.3-2007。

水樣先進(jìn)行過(guò)濾以除去水體中的大顆粒, 再用0.22 μm微孔濾膜抽濾, 將濾膜有菌面對(duì)折后用無(wú)菌錫箔紙包住, 裝于滅菌袋中, 標(biāo)記好后置于–20℃保存。

[8] Mardis E R. Next-generation DNA sequencing methods[J]. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2008, 9: 387-402.

水體微生物DNA提取采用水樣DNA提取試劑盒(OMEGA), 提取步驟參照說(shuō)明書(shū)。提取后的微生物DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 凝膠成像系統(tǒng)分析DNA提取的結(jié)果, 符合實(shí)驗(yàn)需求的基因組–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別用16sFF/16sFR、V3F/V3R和V4F/V4R 3對(duì)引物, 對(duì)水體微生物DNA的16S rDNA全長(zhǎng)、V3高可變區(qū)、V4高可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物序列見(jiàn)表1。對(duì)純化后質(zhì)量合格的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA文庫(kù)的構(gòu)建, 用合格的文庫(kù)進(jìn)行Illumina Paired-end測(cè)序。

表1 用于PCR反應(yīng)的3對(duì)引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與信息分析

高通量測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的序列。使用FLASH軟件[17]進(jìn)行序列拼接, 利用重疊關(guān)系將成對(duì)讀段(reads)拼裝成高變區(qū)的序列標(biāo)簽(Tags)。利用USEARCH軟件[18]將拼接好的Tags經(jīng)過(guò)優(yōu)化后, 在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的操作單元(OTU)。通過(guò)OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 進(jìn)行物種注釋和OTU的物種分類。計(jì)算常用的α生物多樣性指數(shù): Chao、ACE、Simpson和Shannon指數(shù), 分析微生物群落的多樣性, 通過(guò)稀疏度分析樣品的測(cè)序深度; 并采用QIIME 進(jìn)行主成分分析(PCoA), 分析不同樣品微生物多樣性的差異[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體微生物16S rDNA全長(zhǎng)、V3高變區(qū)、V4高變區(qū)擴(kuò)增

12個(gè)海水微生物樣本的總基因組DNA分別用3對(duì)引物擴(kuò)增16S rDNA、V3高變區(qū)、V4高變區(qū)結(jié)果顯示: 對(duì)于16S rDNA的擴(kuò)增, 所得單一產(chǎn)物長(zhǎng)度在1 000~2 000 bp, 條帶清晰規(guī)則較亮, 即濃度較高; 對(duì)于V3高變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶近似彌散, 且條帶較暗, 即濃度較低; 而對(duì)于V4高變區(qū)的擴(kuò)增, 所得單一產(chǎn)物長(zhǎng)度在250~500 bp, 條帶清晰規(guī)則較亮, 即濃度較高。綜上結(jié)果, 選取V4高變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。

2.2 高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)處理

對(duì)山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)12個(gè)水體微生物樣本進(jìn)行高通量測(cè)序, 共得到312 451條reads, 平均每個(gè)樣品26 037條, SD值為209; 共拼裝獲得310 330條Tags, 平均每個(gè)樣品25 860條, SD值為214; 共產(chǎn)生676個(gè)OUT。每個(gè)樣品OTU統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

建筑施工行業(yè)是一個(gè)勞動(dòng)密集型的產(chǎn)業(yè)，機(jī)械化水平較低，施工過(guò)程中需要依靠大量的工人參與手工作業(yè)，無(wú)法像工廠一樣大規(guī)模生產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)品，不可避免地會(huì)產(chǎn)生一些缺陷或偏差。

表2 樣品OTU統(tǒng)計(jì)

[7] 王興春, 楊致榮, 王敏, 等. 高通量測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2012, 32(1): 109-114. Wang Xingchun, Yang Zhirong, Wang Min, et al. High-throughput sequencing technology and its application[J]. China Biotechnology, 2012, 32(1): 109-114.

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 對(duì)OTU進(jìn)行物種分類, 并分別在門、綱、目、科、屬5個(gè)分類等級(jí)水平上對(duì)各個(gè)樣品作微生物物種構(gòu)成柱狀圖。圖2~圖6顯示了各樣品在不同分類等級(jí)上的物種構(gòu)成狀況, 從圖中可以直觀看出不同物種在每個(gè)樣品中所占的比例。門分類等級(jí)畫(huà)所有物種的柱狀圖, 從綱分類等級(jí)開(kāi)始, 將物種豐度在所有樣品均低于0.5%的物種全部合并成其他(Others)。12個(gè)水體樣品所有OTU分屬于25門, 56綱, 103目, 163科, 227屬。

2.3.1 門

總體上看, 12個(gè)水體樣品內(nèi)共有來(lái)自25個(gè)菌門的微生物種系型被鑒定出來(lái), 微生物群落多樣性樣品間存在差異。在門水平, 水體內(nèi)平均相對(duì)豐度處在前10位的微生物門類依次為變形菌門(Proteobacfteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、泉古菌(Crenarchaeota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、厚壁菌門(Firmicutes)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres, SAR406); 平均相對(duì)豐度大于1%的有6種, 其中變形菌門(Proteobacteria)豐度高達(dá)57.95%, 擬桿菌門(Bacteroidetes)達(dá)15.79%, 藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)達(dá)11.27%, 放線菌門(Actinobacteria)達(dá)6.62%, 泉古菌門(Crenarchaeota)達(dá) 3.70%, 疣微菌門(Verrucomicrobia)達(dá)1.34%; 其他菌門平均豐度在1%以下。各樣品在門分類等級(jí)上的微生物組成見(jiàn)圖2。

2.3.2 綱

各樣品在綱分類等級(jí)上的微生物組成見(jiàn)圖3。12個(gè)水體樣品中共檢測(cè)到微生物56綱, 其中物種豐度在所有樣品中平均高于0.5%的共有19個(gè)。平均相對(duì)豐度大于10%的綱分別是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria) (21.88%)、g-變形菌綱(Gammaproteobacteria)(19.75%)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)(14.31%)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)(10.93%)。

2.3.3 目

②螺栓在下降的過(guò)程中，首扣出現(xiàn)了磕碰，造成了螺紋凸出螺紋表面，在旋入的過(guò)程中不斷把螺牙上的材料帶下來(lái)最終超過(guò)擰入的力矩保護(hù)值。咬死螺栓拆除后發(fā)現(xiàn)首扣螺紋有變形。

[10] 劉朝軍. 16SrDNA 序列測(cè)定在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用[J]. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 32(7): 774-776. Liu Zhaojun. Application of 16SrDNA sequencing for identification of bacteria[J]. J Chinese PLA Postgrad Med Sch, 2011, 32(7): 774-776.

2.3.4 科

通過(guò)安裝預(yù)應(yīng)力波紋管（見(jiàn)圖2），可以對(duì)孔道進(jìn)行保護(hù)，防止預(yù)應(yīng)力鋼筋束在穿束過(guò)程中對(duì)混凝土結(jié)構(gòu)造成損壞。固定塑料波紋管時(shí)，應(yīng)先在箍筋上確定預(yù)應(yīng)力曲線的具體的位置，然后通過(guò)鋼筋馬凳進(jìn)行支托，間隔為700mm，然后通過(guò)焊接將支托的鋼筋固定在箍筋上。為了保證塑料波紋管的施工的效果，避免在澆筑混凝土的過(guò)程中產(chǎn)生偏移，塑料波紋管和支托的鋼筋的固定必須牢固。

12個(gè)水體樣品中有微生物163科, 物種豐度在所有樣品平均高于0.5%的共有32個(gè)。相對(duì)豐度最大的5個(gè)科所占比例總和達(dá)36.6%, 分別是紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)(10.68%); 嗜甲基菌科(Methylophilaceae) (9.50%); 鹽單胞菌科(Halomonadaceae) (7.96%); 彎曲菌科(Campylobacteraceae)(4.31%)和OM60(4.15%)。各樣品在科分類等級(jí)上的微生物組成見(jiàn)圖5。

2.3.5 屬

各樣品在屬分類等級(jí)上的微生物組成見(jiàn)圖6。12個(gè)水體樣品中含有微生物227屬, 物種豐度在所有樣品平均高于0.5%的共有22個(gè)。相對(duì)豐度最大的5個(gè)屬所占比例總和達(dá)23.23%, 分別是(7.94%)、(4.72%)、弓(形)桿菌屬()(4.31%)、亞硝化侏儒菌屬() (3.69%)和海洋生菌屬()(2.57%)。

[9] Kolbert C P, Persing D H. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens [J]. Curr Opin Microbiol, 1999, 2(3): 299-305.

選擇底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間作為考查因素。底物質(zhì)量濃度設(shè)置為10，20，30，40，50，60 mg/mL；酶添加量設(shè)置為 0.5×105，1×105，2×105，8×105，14×105，20×105U/mg；酶解溫度設(shè)置為40，45，50，55，60，65℃；酶解時(shí)間設(shè)置為1，2，3，4，5，6 h。每個(gè)設(shè)計(jì)做3個(gè)平行樣取其平均值進(jìn)行計(jì)算分析。

樣品的a多樣性分析見(jiàn)表3, 12個(gè)水體樣品chao平均值為410.68, ace平均值為417.67, shannon平均值為4.30, simpson平均值為0.0313, 樣品微生物多樣性較高。

對(duì)教師A的反思日志總結(jié)后，主要內(nèi)容有：學(xué)生專業(yè)特點(diǎn)、學(xué)生課堂表現(xiàn)、師生互動(dòng)、教案中的課堂設(shè)計(jì)、教學(xué)方法、師生關(guān)系、對(duì)傳統(tǒng)課堂的反思。其中對(duì)學(xué)生專業(yè)特點(diǎn)和學(xué)生課堂參與度反思較多。

裂縫寬度也稱裂縫開(kāi)度，開(kāi)度決定了裂縫的規(guī)模，同時(shí)開(kāi)度是裂縫物性參數(shù)計(jì)算中的關(guān)鍵參數(shù)，因此對(duì)裂縫開(kāi)度的定性研究成為儲(chǔ)層裂縫的重要研究?jī)?nèi)容。以肉眼能否識(shí)別為依據(jù)，裂縫的規(guī)?？珊?jiǎn)單分為大裂縫和微裂縫兩種類型。一般大裂縫反映形成時(shí)期的構(gòu)造應(yīng)力場(chǎng)較強(qiáng)，微裂縫則相反，反映形成時(shí)期的構(gòu)造應(yīng)力場(chǎng)較弱［1］。本次研究主要通過(guò)野外露頭、巖心觀察對(duì)大裂縫進(jìn)行定量描述，通過(guò)薄片觀察對(duì)微裂縫進(jìn)行研究。

稀疏曲線用來(lái)評(píng)估所測(cè)序列庫(kù)容中環(huán)境微生物的種類和數(shù)量。樣品稀疏曲線顯示12條曲線已達(dá)到平臺(tái)期, 表明通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù), 12個(gè)水體樣品中的微生物基本完全測(cè)出(圖7)。

[15] Zhang Jiaojiao, Ma Guannan, Deng Yuangao, et al. Bacterial diversity in Bohai Bay solar saltworks, China[J]. Current Microbiol, 2016, 72(1): 55-63.

3 討論

本研究利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落特征和多樣性進(jìn)行了初步研究, 列出了保護(hù)區(qū)海水微生物門、綱、目、科、屬不同分類等級(jí)上的優(yōu)勢(shì)群落類型和相對(duì)豐度。雖然本次研究所采集海水樣本的數(shù)量及其分布范圍有限, 但是Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用為進(jìn)一步對(duì)山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)內(nèi)海水微生物資源的調(diào)查積累了一定的經(jīng)驗(yàn)和新的技術(shù)支撐。本研究中, 12個(gè)樣品在遺傳距離0.03下的稀疏曲線已達(dá)到平臺(tái)期, 說(shuō)明通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)出的微生物包含了山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)內(nèi)水體樣品中微生物的絕大部分。微生物群落特征顯示, 山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)表層海水內(nèi)存在大量微生物群落, 并具有其獨(dú)特的菌群特征和多樣性。保護(hù)區(qū)內(nèi)表層海水微生物在門、綱、目、科、屬不同分類等級(jí)上的未分類OUT分別為0.40%、1.08%、11.89%、23.53%, 62.81%, 說(shuō)明隨著分類的細(xì)化無(wú)明確分類名稱信息的群落類型所占比例增大, 這可能與測(cè)序區(qū)間、序列長(zhǎng)度以及比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)等有關(guān)。

表3 樣品Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本研究在山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水中共檢測(cè)出變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)等25門, 其中變形菌門是相對(duì)豐度最高的微生物類群, 這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外關(guān)于水體微生物多樣性的很多研究相一致[20-22]。對(duì)黃海表層海水微生物多樣性的研究報(bào)道顯示, 其水體微生物群落主要有變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、疣微菌門、放線菌門和浮霉菌門[23]。渤海與黃海表層海水微生物組成在門分類等級(jí)水平上有較高的相似性, 這可能與兩者地理位置相近有關(guān)。微生物類群的相對(duì)豐度與其多樣性有關(guān), 研究中按97%相似性定義OTU是因?yàn)槲⑸锶郝洳⒉粌H僅是只含有少數(shù)高相對(duì)豐度的基因型, 而是含有大量相對(duì)獨(dú)特的基因型。

Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析[24], 包括observed species指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù), shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)等。前面4個(gè)指數(shù)越大, 最后一個(gè)指數(shù)越小, 說(shuō)明樣品中的物種越豐富。本研究中12個(gè)樣品chao平均值為410.68, ace平均值為417.67, shannon平均值為4.30, simpson平均值為0.0313, 表明渤海海洋保護(hù)區(qū)內(nèi)微生物多樣性較高。主坐標(biāo)分析(PCoA)可以展示樣品間微生物多樣性的差異大小, 如果兩個(gè)樣品距離較近, 則表示這兩個(gè)樣品的物種組成較相似。主坐標(biāo)分析圖中的一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品, 兩個(gè)點(diǎn)之間的距離越近, 說(shuō)明兩個(gè)樣品的微生物群落差異越小。本研究中12個(gè)取樣點(diǎn), 除兩個(gè)取樣點(diǎn)外的其他取樣點(diǎn)水體微生物樣品不能聚集在一起, 說(shuō)明渤海海洋保護(hù)區(qū)不同區(qū)域間微生物組成差異顯著。

水體污染會(huì)影響其微生物群落組成與多樣性[24-25]。渤海為中國(guó)內(nèi)海, 山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)距離陸地較近, 海洋微生物會(huì)由于海水的有機(jī)物污染而獲得大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 人類活動(dòng)會(huì)影響微生物的群落組成及其多樣性。對(duì)渤海海水微生物多樣性的研究不僅有利于對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)的了解, 而且有助于特殊功能微生物的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)。另外, 海水溫度、溶解氧和季節(jié)可能是影響渤海水體微生物群落結(jié)構(gòu)特征的重要因素。有研究表明, 海洋中微生物的組成及其多樣性與海水的溫度、季節(jié)、深度等環(huán)境條件相關(guān)[26-28]。2008年發(fā)生在黃海的滸苔災(zāi)害曾引起表層海水中a-變形菌和藍(lán)細(xì)菌的增加,g-變形菌綱和擬桿菌的減少[23]。因此, 有關(guān)溫度、溶解氧含量、浮游生物和季節(jié)等因素對(duì)渤海表層海水微生物分布和其群落結(jié)構(gòu)變化的影響, 有待深入研究。

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(3) 動(dòng)物園的安全警示是否充足。根據(jù)城市動(dòng)物園管理規(guī)定第三章第二十一條：動(dòng)物園管理機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)完善各項(xiàng)安全設(shè)施，加強(qiáng)安全管理，確保游人、管理人員和動(dòng)物的安全。動(dòng)物園方應(yīng)該設(shè)置足夠多且位于醒目位置的警示牌、在危險(xiǎn)區(qū)域安排足夠多的巡邏車、安裝數(shù)量充足的監(jiān)控?cái)z像頭保證二十四小時(shí)的不停歇監(jiān)控, 在發(fā)現(xiàn)游客有危險(xiǎn)舉動(dòng)時(shí)應(yīng)立即上前勸阻與阻攔。

2.相關(guān)政策章程的頒布及試點(diǎn)工作方案的細(xì)化，為試點(diǎn)工作制定了基本規(guī)范。2017年5月17日，財(cái)政部《關(guān)于在糧食主產(chǎn)省開(kāi)展農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險(xiǎn)試點(diǎn)的通知》發(fā)布以來(lái)，各地、各糧食主產(chǎn)省、各試點(diǎn)縣更為具體的試點(diǎn)方案細(xì)則紛紛出臺(tái)。其中，糧食大省山東于2017年6月24日率先出臺(tái)了《山東省農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險(xiǎn)試點(diǎn)工作方案》。相關(guān)政策細(xì)則相繼頒布，各地因地制宜地推出的地方性、區(qū)域性、個(gè)性化、特色化的農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險(xiǎn)試點(diǎn)工作方案，使農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險(xiǎn)的發(fā)展有章可循。

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2.3 水體微生物群落結(jié)構(gòu)

1.2 微生物DNA提取、擴(kuò)增和高通量測(cè)序

(1)通過(guò)鉆探、測(cè)井、二維地震三種勘探手段對(duì)比分析，查明了QN-06V井目的煤層(3號(hào))缺失的原因?yàn)闃?gòu)造(F4正斷層)斷失。

2.4 水體微生物多樣性指數(shù)

各樣品在目分類等級(jí)上的微生物組成見(jiàn)圖4。12個(gè)水體樣品中包含微生物103目, 其中物種豐度在所有樣品平均高于0.5%的共有30個(gè)。相對(duì)豐度大于5%的目分別是黃桿菌目(Flavobacteriales)(14.31%)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)(10.07%)、嗜甲基菌目(Methylophilales)(9.50%)和交替單胞菌目(Alteromonadales)(7.39%)

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使用主坐標(biāo)分析(PCoA)的方法展示12個(gè)水體樣品間微生物多樣性的差異大小。主成分PC1和次要成分PC2分析結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖可見(jiàn)多數(shù)樣品點(diǎn)之間距離較遠(yuǎn), 表明組間差異顯著。主成分分析結(jié)果顯示, PC1貢獻(xiàn)度為49.45%, PC2貢獻(xiàn)度為20.09%, 除5號(hào)和6號(hào)取樣點(diǎn)外的其他取樣點(diǎn)水體微生物樣品不能聚集在一起, 說(shuō)明樣品間水體微生物組成有差異。

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一路上周大國(guó)都在說(shuō)毛主任業(yè)務(wù)能力突出，為人謙恭，醫(yī)德高尚等。秦明月突然說(shuō)：“我聽(tīng)說(shuō)前段時(shí)間有患者家屬找他鬧事，是怎么一回事?。俊?/p>

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From the perspective of TCM theory,this could be explained as the occurrence of more severe spleen-kidney Yang deficiency and liver-Qi stagnation leading to the appearance of a greater number of corresponding symptoms and a more severe degree of male infertility.

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道路交通水泥路面混凝土質(zhì)量是行業(yè)發(fā)展競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)鍵，在施工中應(yīng)該思考科學(xué)有效的施工質(zhì)量管理理論與方法，將技術(shù)內(nèi)容付諸于管理與施工切實(shí)行為中實(shí)現(xiàn)，為公路建設(shè)建立基于全面質(zhì)量管理的完善化質(zhì)量保證體系。

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Analysis ofmicrobial communitydiversity in the Bohai Sea marine protected areas of the Shandong Province

FU Xin-hua1, LIU Guo-ning2, HE Jian-long3, MA Yuan-qing3, SONG Xiu-kai3, MENG Li1, JIA Qing-mei1

(1. Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2. Weifang Marine Environment Monitoring Centre, Weifang 261041, China; 3. Shandong Marine Resource and Enviroment Research Institute, Weifang 264006, China)

Marine microbes play an essential role in marine ecosystems. To systematically understand microbial community diversity in the Bohai Sea marine protected areas of the Shandong Province, we investigated the microbial community composition and diversity of 12 water samples using the Illumina high-throughput sequencing and bioinformatics analysis technology. Results for the 12 sampling points showed that the number of relative microbial groups included 25 phyla, 56 classes, 103 orders, 163 families, and 227 genera. Dominant groups at the phylum, class, order, family and genus classification levels were Proteobacteria (57.95%), Alphaproteobacteria (21.88%), Flavobacteriales (14.31%), Rhodobacteraceae (10.68%), and(7.94%), respectively. These findings suggest that Bohai Sea marine protected areas in the Shandong Province brine have high levels of microbial diversity. This diversity provides basic information and knowledge to further understand the relationship between marinemicrobial diversity andprotection ofoceanic environmentecology.

Bohai Sea marine protected areas; microbial community; diversity analysis

X55

A

1000-3096(2017)01-0039-09

10.11759//hykx20160329002

2016-03-29;

2016-04-27

山東省渤海海洋生態(tài)修復(fù)及能力建設(shè)項(xiàng)目(20140601); 山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(7J12LE51); 山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GSF117030); 濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(2016ZJ1047)

付新華(1976-), 女, 山東茌平人, 副教授, 博士, 主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究, 電話: 0536-8462531, E-mail: wfyxyfxh@163.com

Mar. 29, 2016

[Ecological Restoration and Capacity Building Program for Bohai Sea of Shandong Province, No.20140601; The Project of Shandong Province Higher Educational Science and Technology Program , No.7J12LE51; Science and Technology Development Projects of Shandong Province, No.2014GSF117030; Weifang Science and Technology Development Plan, No.2016ZJ1047]

(本文編輯: 譚雪靜)