鴨肝炎病毒多克隆抗體的制備與鑒定

高蕾蕾+張巫凡+張聰+相朝鋒+王臣

摘 要：本試驗旨在建立鴨肝炎病毒多克隆抗體。通過鴨肝炎病毒（DHV-I）在雞胚尿囊腔中增殖，收集尿囊液作為免疫原，并制定免疫程序，動物免疫后獲得兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體；同時通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定多克隆抗體水平，硫酸銨鹽析法提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體。在研究中獲得了較高純度的兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體，為進一步建立鴨病毒性肝炎的診斷與檢測技術(shù)奠定實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴨肝炎病毒；多克隆抗體；酶聯(lián)免疫法；硫酸銨鹽析法

鴨病毒性肝炎（DVH）是由鴨肝炎病毒（DHV-I）引起的雛鴨的一種高度致死性傳染病，以發(fā)病急、傳播快、病程短、死亡率高為主要特征。臨床表現(xiàn)痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，以肝腫脹和出血為特征性病變。多克隆抗體是由多種抗原決定簇刺激機體產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體混雜而成。它具有識別多個抗原表位、抗原與抗體特異性結(jié)合、制備時間短、成本低等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于研究和診斷方面。本研究目的為制備鴨肝炎病毒多克隆抗體，為進一步建立鴨病毒性肝炎的診斷與檢測技術(shù)奠定實驗基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.試驗材料

鴨肝炎病毒XZ株由河南科技大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室分離保存；2 kg 成年兔兩只購于孫旗屯；10日齡雞胚11枚購于洛陽現(xiàn)代禽業(yè)有限公司。

2.鴨肝炎病毒雞胚尿囊腔增殖

將鴨肝炎病毒注射到10日齡雞胚尿囊腔，收集24-72 h雞胚的澄清尿囊液，同時測定雞胚尿囊液的雞胚半數(shù)感染量。

3.動物免疫程序及兔抗鴨肝炎病毒多抗血清的收集

兩只成年兔分為兩組，一只實驗組，一只對照組；抗原注射以前收集5 mL正常血清，已備檢測抗體時作為陰性對照。多點注射鴨肝炎病毒雞胚尿囊增殖液1 mL；對照組正常飼養(yǎng)。一免一周后，采集實驗兔血液1 mL，放入28℃培養(yǎng)箱1 h后，再放入 4℃冰箱24 h，臺式離心機7000 r/min離心5 min，分離出血清，4 ℃保存?zhèn)溆?。一免二周后，采集實驗兔血? mL，分離出血清，4 ℃保存?zhèn)溆?；同時進行加強免疫，1 mL尿囊液背部多點注射。二免一周后，采集實驗兔血液1 mL，分離出血清，4 ℃保存。同時進行三免，1 mL尿囊液背部多點注射。三免一周后，進行心臟采血40 mL，分離出待檢血清，4 ℃保存。

4.間接ELISA法檢測兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體

分別于鴨肝炎病毒雞胚尿囊液首免實驗兔后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d采集血液，分離得到的血清采用間接ELISA法檢測兔抗鴨肝炎病毒血清多克隆抗體OD450值。

5.硫酸銨鹽析法提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體

采用硫酸銨鹽析法粗提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體。在紫外分光光度儀上測定多克隆抗體溶液的OD280和OD260值。

按公式計算：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋度。

二、結(jié)果與分析

1.鴨肝炎病毒雞胚增殖情況分析

鴨肝炎病毒接種10齡雞胚后，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收集24-72 h雞胚澄清的尿囊液。測定鴨肝炎病毒雞胚尿囊增殖液的雞胚半數(shù)感染量，檢測結(jié)果為：2.5×106/mL。

2.兔血清中抗鴨肝炎病毒多克隆抗體的動態(tài)變化

采用鴨肝炎病毒雞胚尿囊腔增殖液作為免疫原免疫成年兔，免疫兔后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d采血并分離血清，通過間接ELISA法檢測兔血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體的OD450值。間接ELISA法檢測結(jié)果如圖1顯示，血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體OD450呈上升趨勢。

3.血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體含量

采用硫酸銨鹽析法提純第28 d兔血清。紫外分光光度計測定多克隆抗體吸光度。根據(jù)公式計算多克隆抗體濃度為10.153 mg/mL。

三、討論

鴨病毒性肝炎最先發(fā)現(xiàn)于美國，其后，在英國、法國、德國、意大利、加拿大、印度等國陸續(xù)地報道有本病發(fā)生。1963年我國首次報道了上海某鴨場于1958年秋至1962年春暴發(fā)本病的情況。此后，全國各地都相繼報道了本病的爆發(fā)與流行。1980年至今，在我國多個地區(qū)已多次爆發(fā)該病，流行區(qū)域廣，且發(fā)病嚴重，卻沒有被很好地控制，仍然在主要的養(yǎng)鴨地區(qū)間歇發(fā)生，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的損失。雞胚尿囊腔增殖鴨肝炎病毒，獲得了病毒增殖液，測得雞胚半數(shù)感染量為2.5×106/mL；間接ELISA實驗結(jié)果表明，血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體水平逐漸升高；硫酸銨鹽析法提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體，紫外分光光度計檢測血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體濃度為10.153 mg/mL，通過鴨肝炎病毒在雞胚尿囊腔中增殖，收集的尿囊液作為免疫原，免疫家兔后獲得了兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體，為進一步建立鴨病毒性肝炎的診斷與檢測技術(shù)奠定實驗基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] Saif Y M， Bames H J， Fadly A M. Diseases of Poultry （1lth Edition） [M]. America： Iowa State Press.2003：339-351.

[2] 范偉興，袁秀芳.1株鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2000，26：17-18.

作者簡介：高蕾蕾（1994- ），女，河南濮陽人，本科學(xué)歷。

王臣（1979- ），男，安徽六安人，博士學(xué)歷，副教授，研究方向：動物分子病原學(xué)與免疫學(xué)。