沙棘水提物對UVC輻射HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

陳曉昱，馬文宇(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001)

沙棘水提物對UVC輻射HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

陳曉昱，馬文宇
(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001)

目的 探討沙棘水提物對短波紫外線(UVC)輻射人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞株，將其隨機(jī)分成對照組、UVC模型組、沙棘水提物2 mg/mL組、沙棘水提物20 mg/mL組。對照組不加藥，不進(jìn)行UVC照射；UVC模型組去蓋置于UVC消毒燈管(30 W，輻射距離70 cm)下進(jìn)行照射，輻射劑量為20 J/m2，照射30 min；沙棘水提物組分別加入2 、20 mg/mL沙棘水提物5 min后，進(jìn)行UVC照射，輻射劑量及時間同上。輻射后用PBS洗2遍，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量變化，酶標(biāo)法測定細(xì)胞中的超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力,細(xì)胞中丙二醛(MDA)含量。結(jié)果 對照組細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣貼壁生長，細(xì)胞呈圓梭形，彼此之間伸出偽足連接，細(xì)胞核清晰可見。UVC模型組可見大量細(xì)胞碎片，大量細(xì)胞凋亡，細(xì)胞形態(tài)模糊不清，活細(xì)胞數(shù)明顯減少。各沙棘水提物組細(xì)胞損傷程度減輕，隨著沙棘水提物濃度的升高細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于正常，且凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，存活細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。與對照組比較，其余各組活細(xì)胞數(shù)減少(P均<0.05)；與UVC模型組比較，沙棘水提物2 mg/mL組、沙棘水提物20 mg/mL組活細(xì)胞數(shù)增加(P均<0.05)。與對照組比較，除沙棘水提物20 mg/mL組細(xì)胞SOD活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組細(xì)胞中SOD、CAT活力及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GSH-PX活力均降低，MDA含量升高。與UVC模型組比較，沙棘水提物2 mg/mL、20 mg/mL組細(xì)胞中SOD、CAT活力，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GSH-PX活力升高，細(xì)胞中MDA含量降低(P均<0.05 )。結(jié)論 沙棘水提物對UVC照射HaCaT細(xì)胞造成的損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用及增強(qiáng)細(xì)胞生存活力有關(guān)。

細(xì)胞損傷；短波紫外線;人角質(zhì)形成細(xì)胞;沙棘水提物；氧化應(yīng)激損傷

自然環(huán)境中的紫外線按照波長減小和能量增加的順序分為三個波段：長波紫外線(UVA，320～400 nm)、中波紫外線(UVB，290～320 nm)和短波紫外線(UVC，200～290 nm)。過量紫外線輻射可導(dǎo)致電光性眼炎、光老化(皮膚干燥、松弛、皺紋形成等)和癌癥等疾病。在三個波段中，因UVC經(jīng)過大氣層時多數(shù)被臭氧層吸收，雖然其具有比UVA和UVB更高的能量和生物殺傷能力，亦常被國內(nèi)外學(xué)者所忽略。目前，UVC獨具的生物殺菌功能已被廣泛應(yīng)用在日常生活中，如飲用水、食品包裝材料的殺菌，實驗室、學(xué)校、醫(yī)院等場所室內(nèi)常規(guī)消毒等方面，車間工人、醫(yī)生等特殊人群不可避免地受到UVC傷害。沙棘是一種能夠在極端環(huán)境(生長環(huán)境溫度為-40～40 ℃)下生存的沙棘屬固氮落葉灌木[1]，含有黃酮類、維生素類、氨基酸類、多酚類、糖類、超氧化物歧化酶(SOD)及各種微量元素等200多種有效成分，并已證實沙棘具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化和抑菌、免疫調(diào)節(jié)及放射防護(hù)功能[2～6]。2015年10月～2017年1月，本研究采用體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)，參照抗氧化功能評價方法，利用UVC輻射HaCaT細(xì)胞，探討沙棘水提物是否對UVC有防護(hù)作用，為未來保健食品、藥品、防護(hù)化妝品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 20∶1沙棘水提物(西安瑞林生物科技有限公司)，HaCaT細(xì)胞株(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，0.25%胰酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國GIBCO公司，SOD試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物研究所。BB150二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、KA-1000C低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、SIGMA 3K15離心機(jī)(SIGMA公司)、OLYMPUS-DP 72倒置顯微鏡(OLYMPU公司)、AxioCam ICc 5倒置顯微鏡(ZEISS公司)、xMark酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)、infinite M200PRO酶標(biāo)儀(TECAN公司)、DU800分光光度計(BECKMAN COULTER公司)、W201B水浴鍋(金壇市岸頭科輝儀器廠)、高級石英紫外線殺菌燈管(北京精英特種燈泡廠)等。

1.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 根據(jù)文獻(xiàn)[7]將原代HaCaT細(xì)胞接種于內(nèi)含10% FBS、10 U/mL青霉素和10 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，后將其置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的3～4代細(xì)胞進(jìn)行實驗。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至90%時，進(jìn)行胰酶消化，離心、計數(shù)，以每孔5×105個細(xì)胞均勻接種于六孔板中，將其隨機(jī)分成對照組、UVC模型組、沙棘水提物2 mg/mL組、沙棘水提物20 mg/mL組。對照組不加藥物，不進(jìn)行UVC照射；UVC模型組去蓋置于UVC消毒燈管(30 W，輻射距離70 cm)下進(jìn)行照射，輻射劑量為20 J/m2，照射30 min；沙棘水提物組分別加入2、20 mg/mL沙棘水提物5 min后，進(jìn)行UVC照射，輻射劑量及時間同上。輻射后用PBS洗2遍，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 各組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化 使用AxioCam ICc 5倒置顯微鏡觀察×4、×10、×20、×40倍數(shù)鏡下細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化，照相。并細(xì)數(shù)×20鏡下細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)6次。

1.4 細(xì)胞中SOD、CAT活力，培養(yǎng)上清液中GSH-PX活力，細(xì)胞MDA含量測定 采用酶標(biāo)法。吸取各組六孔板中上清液、留存(GSH-PX實驗待用)，PBS洗2遍，胰酶消化細(xì)胞2～3 min，加完全培養(yǎng)基終止消化，微量移液器輕輕吹打，離心(1 000 r/min，10 min)，棄上清，留沉淀細(xì)胞，再加入PBS 1 mL 輕輕吹打、離心(1 000 r/min，10 min)2遍，往各組沉淀細(xì)胞中加入適量緩沖液(每106個細(xì)胞中加入生理鹽水0.3～0.5 mL)，冰水浴下電動勻漿儀研磨3 min后待用。使用酶標(biāo)儀檢測OD值。采用說明書中公式計算各指標(biāo)含量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化 對照組細(xì)胞形態(tài)良好，呈上皮細(xì)胞樣貼壁生長，呈圓梭形，彼此之間伸出偽足連接，細(xì)胞核清晰可見。UVC模型組可見大量細(xì)胞碎片，大量細(xì)胞脫壁、變圓、皺縮，細(xì)胞形態(tài)模糊不清，呈凋亡態(tài)，部分存活細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核腫脹，活細(xì)胞數(shù)明顯減少。沙棘水提物2 mg/mL、20 mg/mL組與UVC模型組相比較，細(xì)胞碎片及脫壁細(xì)胞數(shù)量大量減少，細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，存活細(xì)胞膜完整，細(xì)胞腫脹程度減輕，活細(xì)胞數(shù)量有不同程度的增多。沙棘水提物20 mg/mL與2 mg/mL組相比較，細(xì)胞形態(tài)已趨于正常，細(xì)胞脫壁現(xiàn)象少見，活細(xì)胞數(shù)目明顯增多。沙棘水提物20 mg/mL組細(xì)胞形態(tài)基本正常，與對照組相比較無明顯差異，細(xì)胞碎片及脫壁現(xiàn)象極少。對照組、UVC模型組、沙棘水提物2 mg/mL組、沙棘水提物20 mg/mL組活細(xì)胞數(shù)分別為(1 180.17±47.72)、(92.00±11.56)、(371.33±19.8)、(811.17±16.87)個/20倍視野。與對照組比較，其余各組活細(xì)胞數(shù)減少(P均<0.05) ；與UVC模型組比較，沙棘水提物2 mg/mL組、沙棘水提物20 mg/mL組活細(xì)胞數(shù)增加(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞中SOD、CAT活力，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GSH-PX活力及細(xì)胞MDA含量比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞中SOD、CAT活力，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GSH-PX活力及細(xì)胞MDA含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與UVC模型組比較，#P<0.05。

3 討論

酶類抗氧化系統(tǒng)(包括SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶)和非酶類抗氧化系統(tǒng)(包括黃銅類、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、植物多糖、甾醇、酚類化合物、硒、銅、鋅等成分)是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。正常生物體內(nèi)過氧化物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)存在動態(tài)平衡，而大量紫外線輻射會導(dǎo)致活性氧自由(ROS)過表達(dá)，超過自身抗氧化酶系的降解能力，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)而損傷細(xì)胞[8，9]。暴露于UVC中的細(xì)胞能夠產(chǎn)生比暴露于UVA、UVB下的細(xì)胞更多的ROS和超氧化物[10]。MDA是組織細(xì)胞被ROS損傷后形成的脂質(zhì)過氧化物[11]，能夠與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其含量能間接反映體內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞發(fā)生過氧化損傷程度，是機(jī)體衰老的重要指標(biāo)。SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶能夠?qū)筂DA等過氧化物對細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷，間接反映了機(jī)體細(xì)胞清除ROS的能力。

沙棘含有多種有效活性成分，在我國被作為藏藥、蒙藥和中藥，已有悠久的用藥歷史，遠(yuǎn)在8世紀(jì)末藏學(xué)典籍《四部醫(yī)典》已有記載，1997年并被《中國藥典》收錄，近年受到國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。胡芳等[12]試驗表明沙棘果渣醇提物可顯著提高小鼠血清、肝臟和腦組織中SOD、CAT、GSH-PX活力和總抗氧化能力，并明顯降低了組織細(xì)胞中的MDA含量。焦巖等[13]試驗證實，沙棘總黃酮(沙棘主要活性成分)能夠有效清除超氧陰離子、羥基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基等氧自由基。Hwang等[14，15]試驗證實，UVB輻射小鼠皮膚細(xì)胞后，沙棘提取物顯著提高了細(xì)胞中的SOD活力和含水量。本研究結(jié)果顯示，UVC模型組大量HaCaT細(xì)胞凋亡，細(xì)胞碎片及脫片現(xiàn)象嚴(yán)重，提示造模成功；沙棘水提物組的存活細(xì)胞形態(tài)明顯優(yōu)于UVC模型組，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其中沙棘水提物20 mg/mL組細(xì)胞形態(tài)基本正常，且數(shù)量上與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示沙棘水提物具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。此外，沙棘水提物組HaCaT細(xì)胞中SOD、GSH-PX、CAT活力明顯上升，MDA含量明顯下降。提示沙棘水提物具有抗氧化能力。

綜上所述，沙棘具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，對UVC照射HaCaT細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)能力，其機(jī)制可能與它的抗氧化作用及增強(qiáng)細(xì)胞生存活力有關(guān)。本實驗對沙棘水提物抑制細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制及能否促進(jìn)細(xì)胞增殖未進(jìn)行探討，尚需進(jìn)一步研究。

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青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計劃項目(2016-ZJ-792)。

馬文宇(E-mail:mawenyu730126@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.012

R392.2

A

1002-266X(2017)13-0042-03

2017-01-12)