共表達磷脂酶C促進葡萄糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的胞外表達

姜 琪， 宿玲恰， 吳 敬， 陳 晟

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

共表達磷脂酶C促進葡萄糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的胞外表達

姜 琪， 宿玲恰， 吳 敬， 陳 晟*

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

磷脂酶C（PLC）能夠水解細胞膜主要成分磷脂，使細胞膜通透性增強，從而能夠釋放出胞內(nèi)物質(zhì)。作者構(gòu)建了PLC與天然胞內(nèi)定位蛋白葡萄糖異構(gòu)酶（GI）共表達的重組大腸桿菌，搖瓶發(fā)酵胞外上清液中GIC酶活達到3.4 U/mL，占胞外和胞內(nèi)總酶活的93%，表明GIC成功實現(xiàn)了胞外表達。將胞外上清液中的GIC進行分離純化和酶學(xué)定性，發(fā)現(xiàn)其比活為12.1 U/mg，最適反應(yīng)溫度為80℃，最適pH為10，均與對照菌單獨表達的GIO性質(zhì)基本一致。在此基礎(chǔ)上，對上述重組菌進行3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵周期為24 h，酶活達到17.7 U/mL，表明其良好的工業(yè)化放大生產(chǎn)前景。

磷脂酶C，葡萄糖異構(gòu)酶，共表達，胞外表達

大腸桿菌表達系統(tǒng)作為目前研究最深入和應(yīng)用最廣泛的表達系統(tǒng)，具備遺傳背景清晰、細胞結(jié)構(gòu)簡單、蛋白質(zhì)表達效率高、培養(yǎng)周期短、操作簡便等天然優(yōu)勢，是規(guī)?；苽渲亟M蛋白的首選表達系統(tǒng)之一[1-2]。大腸桿菌具有兩層細胞膜結(jié)構(gòu)，這一特點決定了蛋白質(zhì)的定位方式除了膜定位外，還有胞內(nèi)定位、周質(zhì)空間定位和胞外基質(zhì)定位。重組蛋白質(zhì)分泌至周質(zhì)空間或者胞外基質(zhì)比定位于胞內(nèi)更有助于蛋白質(zhì)折疊、減少包涵體的形成、降低胞內(nèi)雜蛋白質(zhì)的污染以及簡化下游分離提取過程，而胞外基質(zhì)定位蛋白質(zhì)的分離過程只需離心過濾除去細胞即可，在大規(guī)模生產(chǎn)生物制品中具有較大優(yōu)勢[3-4]。

對于胞內(nèi)蛋白質(zhì)來說，通常連接信號肽也無法利用宿主菌蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)實現(xiàn)胞外分泌，因此只能通過破碎細胞來獲取。常用的方法有機械法，包括高壓勻漿破碎、超聲波破碎等；非機械法，包括滲透壓沖擊破碎、凍融破碎，另外還有化學(xué)法破碎等。此外，還有研究者采用共表達一些噬菌體來源的溶解細胞蛋白實現(xiàn)蛋白質(zhì)的釋放[5-7]。這些使細胞完全裂解破碎的方法在過程中無法避免的釋放出細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、多糖等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會給下游的分離提取過程帶來不利影響。

本實驗室前期研究表明[8]，角質(zhì)酶具有磷脂酶B的水解活性，當(dāng)其在胞內(nèi)重組表達時能夠有限的水解細胞膜磷脂組分，在一定程度上對細胞膜形成破壞，提升其通透性，從而使內(nèi)容物能夠非正常釋放，但不會引起細胞裂解，因此能夠通過與角質(zhì)酶共表達實現(xiàn)胞內(nèi)目的蛋白質(zhì)胞外表達的目的。然而，由于角質(zhì)酶催化磷脂水解的作用位點為磷脂分子中1位和2位酯鍵[9]，其產(chǎn)物之一是溶血磷脂，屬于較強的表面活性劑，導(dǎo)致在發(fā)酵過程中大量起泡，不利于發(fā)酵調(diào)控和工業(yè)放大。

磷脂酶C （phospholipase C，PLC，EC3.1.4.3）是一種水解甘油磷脂C3位點磷酯酰鍵生成甘油二酯和磷酸膽堿、磷酸肌醇或磷酸乙醇胺等的水解酶[10]，有報道[11]中提到Bacillus cereus來源的磷脂酶C（PLC）同樣對細胞存在一定毒性。作者所在實驗室前期工作構(gòu)建了Bacillus cereus來源的磷脂酶C在大腸桿菌中重組表達的工程菌，研究表明，其能夠在不引起細胞裂解的情況下通過對細胞膜磷脂的部分水解提升膜透性，并且能夠避免角質(zhì)酶促進蛋白質(zhì)胞外表達過程中易起泡的缺陷。

葡萄糖異構(gòu)酶（glucoseisomerase，GI，EC5.3.1.5），又稱木糖異構(gòu)酶，能將葡萄糖、木糖、核糖等醛糖催化異構(gòu)為相應(yīng)的酮糖[12]。目前其主要應(yīng)用領(lǐng)域為將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖從而制備果葡糖漿。葡萄糖異構(gòu)酶來源廣泛，包括近百種細菌和放線菌[13]，其中絕大部分為胞內(nèi)酶，研究者在進行其重組表達時通常采取胞內(nèi)定位的形式。作者所在實驗室前期構(gòu)建了Thermobifida fusca來源的葡萄糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達的基因工程菌，研究表明其酶學(xué)特性和應(yīng)用性能良好，具備良好的工業(yè)化應(yīng)用潛力[14]。

作者研究了通過共表達B.cereus來源的磷脂酶C（PLC）和T.fusca來源的葡萄糖異構(gòu)酶，考察磷脂酶C是否能夠通過限制性地破壞細胞膜促使葡萄糖異構(gòu)酶的胞外“釋放”，并考察在這一過程中，葡萄糖異構(gòu)酶是否發(fā)生折疊不正常、性質(zhì)改變等問題。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coli JM109、BL21（DE3）菌株、葡萄糖異構(gòu)酶胞內(nèi)表達的重組E.coli BL21（DE3）及分別帶有磷脂酶C和葡萄糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pETDuet/plc和pET24a/glu：作者所在實驗室保藏。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ，堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIAP），T4DNA連接酶，DNA Marker及瓊脂糖：寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：天根生化科技有限公司；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）和氨芐青霉素（ampicillin，Amp）：生工生物工程（上海）股份有限公司；分子級酵母粉和胰蛋白胨：英國Oxoid公司；其它試劑：均為國產(chǎn)分析純試劑，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

LB液體培養(yǎng)基 （g/L）：酵母粉 5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加1.5～2.0 g/dL的瓊脂。

TB培養(yǎng)基（g/L）：甘油5.0，胰蛋白胨12.0，酵母粉24.0，K2HPO4·3H2O 16.4，KH2PO42.3。

LB（TB）-Amp培養(yǎng)基：在滅菌后的LB（TB）培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素。

3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）：甘油 8.0，KH2PO413.5，（NH4）2HPO44.0，檸檬酸1.7，MgSO4·7H2O 1.4，微量元素液 12.0 mL，工業(yè)級酵母粉2.4，工業(yè)級蛋白胨1.2，調(diào)pH 7.0。

微量元素液 （g/L）：FeSO4·7H2O 10.0，ZnSO4· 7H2O 5.25，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl22.0，（NH4）6Mo7O240.1。

補料液 （g/L）：甘油 600，MgSO49.0，工業(yè)級酵母粉2.4，工業(yè)級蛋白胨1.2。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建 提取作者所在實驗室保藏的重組質(zhì)粒pET24a/glu及pETDuet/plc，經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，割膠回收獲得glu基因及線性化的pETDuet/plc載體，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，氨芐青霉素抗性平板篩選。獲得的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切驗證正確，即質(zhì)粒pETDuet/plc/glu。將驗證正確的pETDuet/plc/glu質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，氨芐青霉素抗性平板篩選，-80℃甘油管保存。

1.3.2 重組菌誘導(dǎo)表達 將葡萄糖異構(gòu)酶和磷脂酶C共表達的重組菌（以下簡稱共表達菌）與葡萄糖異構(gòu)酶單獨表達的對照重組菌 （以下簡稱對照菌）置于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8～10 h，以5%接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基中，25℃、200 r/min培養(yǎng)6 h后加入IPTG，至終濃度為0.1 mmol/L，繼續(xù)在25℃、200 r/min培養(yǎng)至發(fā)酵液中GI酶活不再上升。

1.3.3 葡萄糖異構(gòu)酶純化及SDS-PAGE凝膠電泳檢測

1）前處理：將共表達菌發(fā)酵液離心收集上清液。對照菌發(fā)酵液離心收集菌體，菌體用適量30 mmol/L磷酸鹽緩沖液（Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.5）復(fù)溶，超聲破碎細胞，離心收集上清液。將上述收集的共表達菌發(fā)酵上清液和對照菌破壁上清液于75℃處理15 min，離心，收集上清液。

2）硫酸銨沉淀：在經(jīng)過前處理的上清液中緩慢加入70 g/dL硫酸銨，鹽析過夜，4℃、8 000 r/min離心30 min；用適量緩沖液A（30 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.5）將沉淀充分溶解，4℃透析過夜，經(jīng)膜過濾后即為上樣樣品。

DEAE-Sepharose陰離子交換柱用緩沖液A平衡后上樣，依次用緩沖液A、含0～1 mol/L NaCl的緩沖液A、含1 mol/L NaCl的緩沖液A洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)，流速為1 mL/min。收集有酶活力組分進行酶活測定和蛋白質(zhì)電泳分析。

1.3.4 酶活力檢測方法 葡萄糖異構(gòu)酶活力檢測方法：以3 mol/L的葡萄糖溶液為底物，葡萄糖異構(gòu)酶將底物異構(gòu)化為果糖，進而采用咔唑-硫酸法測定果糖含量。異構(gòu)反應(yīng)為：0.1 mL的3 mol/L葡萄糖溶液，0.1 mL的50 mmol/L的MgSO4，0.1 mL的300 mmol/L pH 7.5 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，0.6 mL H2O混勻，70℃預(yù)熱5 min，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液（以水作空白），準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，立即用1 mL的0.5 mol/L HClO4終止反應(yīng)。顯色反應(yīng)：將上述反應(yīng)液稀釋一定倍數(shù)后取0.5 mL加入到比色管中，再分別加入0.1 mL半胱氨酸鹽酸鹽溶液，3 mL 75%的H2SO4和0.1 mL咔唑-酒精溶液，振蕩混勻后置于60℃水浴中反應(yīng)10 min。置于冰浴冷卻至室溫后，于560 nm處測定吸光度（空白為以水代替反應(yīng)液）。

酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol果糖所需的酶量為一個活力單位（U）。1.3.5 重組菌株生長曲線測定 從甘油管中接種共表達菌及對照菌于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h，5%接體積分數(shù)轉(zhuǎn)接于TB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，定時取樣測定OD600nm值及酶活力，做2組平行實驗。

1.3.6 重組GI最適溫度及最適pH測定 其他條件不變，分別在55、60、65、70、75、80、85、90℃測定純化共表達重組GI酶活，以酶活最高的為100%。

其他條件不變，分別測定pH 5.5～12之間的酶活，以酶活最高的為100%。

1.3.7 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法 從甘油管中吸取100 μL菌液，接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的工業(yè)級LB培養(yǎng)基（裝液量50/250 mL）中，37℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。將種子以10%的接種體積分數(shù)接入Infors 3 L全自動發(fā)酵罐中，初始裝液量1.2 L。誘導(dǎo)前培養(yǎng)溫度37℃、pH 7.0，溶氧20%。當(dāng)發(fā)酵初始碳源甘油基本消耗完時，開始流加補料液；流加方式為指數(shù)流加，比生長速率控制在μ=0.2 h-1[15]。當(dāng)菌體干重約為7.5 g/L左右時，加入甘氨酸，加量為10 g/L；菌體干重約為25 g/L左右時，開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方法為恒速流加乳糖，乳糖加量0.2 g/（L·h）。開始誘導(dǎo)后，每3小時取樣一次，測定菌體干重和培養(yǎng)基中酶活變化，培養(yǎng)基中酶活不再上升時，發(fā)酵過程結(jié)束。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

分別提取 pETDuet/plc質(zhì)粒及 pET24a/glu質(zhì)粒，經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，pETDuet/plc酶切之后再用CIAP去磷酸化處理以防止自連，目的片段回收后用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，氨芐青霉素抗性平板篩選。獲得的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切驗證，得到目的條帶，見圖1。重組質(zhì)粒pETDuet/plc/glu構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pETDuet/plc/glu NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切電泳圖Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of pETDuet/ plc/glu by NdeⅠand XhoⅠ

bp

2.2 重組葡萄糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的表達

將驗證正確的重組質(zhì)粒pETDuet/plc/glu轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3），篩選獲得轉(zhuǎn)化子，將該轉(zhuǎn)化子與實驗室前期構(gòu)建的單獨表達GI菌株按照上述1.3.2節(jié)方法進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果見圖2。共表達菌（以下簡稱共表達GI為GIC）與對照菌（以下簡稱單獨表達GI為GIO）生長情況相似，在發(fā)酵過程的前8個小時，共表達菌培養(yǎng)基中檢測不到GIC酶活，推測可能是此時PLC對細胞的破壞作用尚未達到能夠使GIC滲漏的程度。發(fā)酵8 h后，隨著時間的增加，培養(yǎng)基中GIC酶活逐漸增加，直至24 h，隨著時間的推移酶活幾乎不增長，發(fā)酵過程結(jié)束，此時培養(yǎng)基中GIC酶活達到3.4 U/mL，胞內(nèi)酶活約為0.3 U/mL，GIC總酶活為3.7 U/mL，因此釋放至胞外的酶活約占總酶活的93%。蛋白質(zhì)電泳結(jié)果見圖3。共表達菌培養(yǎng)基上清組分中在43 000處有明顯的條帶，與GI理論相對分子質(zhì)量一致，表明與PLC共表達時，GI被高效釋放到胞外上清液基質(zhì)中。此外，對照菌發(fā)酵過程結(jié)束，酶活達到4.2 U/mL，共表達菌與對照菌葡萄糖異構(gòu)酶表達量區(qū)別不大。

圖2 共表達菌和對照菌發(fā)酵過程生長和產(chǎn)酶曲線Fig.2 Growth and enzyme production by recombinant E.coli BL21（DE3）

2.3 重組蛋白質(zhì)的純化及定性

當(dāng)GI與PLC共表達時，PLC破壞細胞膜，GI被釋放到培養(yǎng)基中的過程是細胞非自然生長狀態(tài)下滲漏的結(jié)果。在這一過程中，可能伴隨著GI折疊不完全、結(jié)構(gòu)松散、酶學(xué)性能改變等現(xiàn)象。為了考察這些現(xiàn)象是否存在，對GIC進行了分離純化，并檢測了最適溫度、最適pH、比活等性質(zhì)，與實驗室保存的GIO純品性質(zhì)進行比較。

圖3 重組菌搖瓶發(fā)酵胞外上清液SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of culture supernatant of recombinant strains

根據(jù)前述1.3.3節(jié)方法對粗酶液進行分離純化。經(jīng)歷了兩步純化后，結(jié)果見圖4，達到電泳純。最終獲得純酶GIC比活11.9 U/mg，與作者所在實驗室純化GIO比活12.1 U/mg相近，見表1。

圖4 純酶GICSDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified GIC

表1 GIC純化過程參數(shù)Table 1 Purification scheme of recombinant GIC

獲得GIC純酶后，分別測定GIC和GIO純酶最適溫度和最適pH，分別選擇溫度范圍55～90℃和pH范圍5.5～12進行實驗，結(jié)果見圖5。GIC最適溫度為80℃，最適pH為10.0，與GIO一致。且二者隨著溫度和pH值變化，殘留酶活百分比趨勢基本一致。

圖5 溫度和pH對GIC和GIO酶活的影響Fig.5 Effects of temperature and pH on activity of GICand GIO

與磷脂酶C共表達的葡萄糖異構(gòu)酶和單獨表達的葡萄糖異構(gòu)酶在比活、最適溫度、最適pH等性質(zhì)方面沒有明顯差別，表明在共表達的過程中，葡萄糖異構(gòu)酶在被釋放出細胞前已經(jīng)正確地完成了整個蛋白質(zhì)合成過程，并且不存在折疊不完全等異常情況。

2.4 磷脂酶C與葡萄糖異構(gòu)酶共表達菌株3 L罐小試

為了考察葡萄糖異構(gòu)酶與磷脂酶C的共表達是否能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，用菌株pETDuet/plc/glu進行3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)。按照1.3.7節(jié)所述方法進行pETDuet/plc/glu菌株的3 L罐小試。接罐后約6.5 h，培養(yǎng)基中的甘油耗盡，開始補料。采用指數(shù)流加法進行流加補料，細胞干重約為25 g/L時，開始流加乳糖誘導(dǎo)。誘導(dǎo)開始后，每3小時取樣一次，結(jié)果見圖6。培養(yǎng)基中的酶活和細胞干重隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸增加。當(dāng)乳糖誘導(dǎo)約為18 h時，細胞干重不再明顯增加；當(dāng)乳糖誘導(dǎo)約為24 h時，培養(yǎng)基中酶活不再明顯增加，此時酶活達到了17.7 U/mL，是搖瓶發(fā)酵菌株培養(yǎng)基酶活的5.2倍，釋放到培養(yǎng)基中的酶活比例約為85%，電泳結(jié)果見圖7。

圖6 3 L罐小試菌體干重變化和產(chǎn)酶曲線Fig.6 Growth and enzyme production by recombinant E.coli BL21（DE3）under the fermentation condition

對重組磷脂酶C和葡萄糖異構(gòu)酶共表達的菌株進行的搖瓶發(fā)酵和3 L罐小試結(jié)果說明，葡萄糖異構(gòu)酶成功實現(xiàn)了胞外表達，并且這一過程具有表達效率高、發(fā)酵過程易調(diào)控、后期分離純化簡便等優(yōu)勢，有利于工業(yè)化制備葡萄糖異構(gòu)酶。

圖7 3 L罐小試GIC蛋白質(zhì)電泳圖Fig.7 SDS-PAGE analysis of extracellular fraction under the fermentation condition

3 結(jié)語

本研究通過共表達對細胞膜有傷害作用的磷脂酶C成功實現(xiàn)了天然胞內(nèi)蛋白葡萄糖異構(gòu)酶的胞外表達，并且獲得了較高的表達效率。然而過程中的一些實驗條件包括發(fā)酵條件等只是初步的探究，并未進行深入的優(yōu)化，仍然存在進一步發(fā)掘的潛力。在未來的研究中，可以進一步優(yōu)化實驗工藝，尤其是發(fā)酵工藝，以獲得更高的胞外酶活、更好的分泌效率以及更短的發(fā)酵周期等，為葡萄糖異構(gòu)酶工業(yè)化規(guī)模制備奠定基礎(chǔ)。

[1]YOON S H，KIM S K，KIM J F.Secretory production of recombinant proteins in Escherichia coli[J].Recent Pat Biotechnol，4（1）：23-29.

[2]JONG W S P，SAURI A，LUIRINK J.Extracellular production of recombinant proteins using bacterial autotransporters[J].Curr Opin Biotech，2010，21（5）：646-652.

[3]CHOI J H，LEE S Y.Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biot，2004，64（5）：625-635.

[4]MERGULHAO F J M，SUMMERS D K，MONTEIRO G A.Recombinant protein secretion in Escherichia coli[J].Biotechnol Adv，2005，23（3）：177-202.

[5]SHIN H D，CHEN R R.Extracellular recombinant protein production from an Escherichia coli lpp deletion mutant[J].Biotechnol Bioeng，2008，101（6）：1288-1296.

[6]CHIEN L J，LEE C K.Synergistic effect of co-expressing D-amino acid oxidase with T7 lysozyme on self-disruption of Escherichia coli cell disruption[J].Biochem Eng J，2006，28（1）：17-22.

[7]MORITA M，ASAMI K，TANJI Y，et al.Programmed Escherichia coli cell lysis by expression of cloned T4 phage lysis genes[J]. Biotechnol Progr，2001，17（3）：573-576.

[8]SU Lingqia，CHEN Sheng，YI Li，et al.Extracellular overexpression of recombinant Thermobifida fusca cutinase by alphahemolysin secretion system in E.coli BL21（DE3）[J].Microbial Cell Factories，2012，11（1）：8.

[9]DE Maria L，VIND J，OXENBOLL K M，et al.Phospholipases and their industrial applications[J].Appl Microbiol Biot，2007，74（2）：290-300.

[10]孟慶飛，溫其標(biāo).磷脂酶C水解大豆油磷脂提高油脂精煉率的研究[J].中國油脂，2006，31（1）：36-38.MENG Qingfei，WEN Qibiao.Improving refining yield of crude oil by using phospholipase C to hyolrolyze soybean gwms[J]. China Oils and Fats，2006，31（1）：36-38.（in Chinese）

[11]劉菲菲，張梁，顧正華，等.蠟狀芽孢桿菌磷脂酶C基因在大腸桿菌中的異源表達[J].食品科學(xué)，2013，34（11）：182-187. LIU Feifei，ZHANG Liang，GU Zhenghua，et al.Cloning and heterologous expression of phospholipase C gene from Bacillus cereus in E.coli[J].，2013，34（11）：182-187.（in Chinese）

[12]CALIK P，ANGARDI V，HAYKIR N I，et al.Glucose isomerase production on a xylan-based medium by Bacillus thermoantarcticus[J].Biochem Eng J，2009，43（1）：8-15.

[13]朱國萍，程陽，宮春紅，等.葡萄糖異構(gòu)酶的生物工程研究進展[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2000，27（2）：127-131. ZHU Guoping，CHENGYANG，GONG Chunhong，et al.Progress in biological engineering of D-glucose isomerase[J].Progress in Biochemistry and Biophysics，2000，27（2）：127-131.（in Chinese）

[14]ZHANG Fan，DUAN Xuguo，CHEN Sheng，et al.The addition of Co2+enhances the catalytic efficiency and thermostability of recombinant glucose isomerase from Thermobifida fusca[J].Process Biochem，2013，48（10）：1502-1508.

[15]CHENG Jing，WU Dan，CHEN Sheng，et al.High-level extracellular production of r-cyclodextrin glycosyltransferase with recombinant Escherichia coli BL21（DE3）[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59：3797-3802.

Co-Expression of Phospholipase C and Glucose Isomerase Which Promoting the Extracellular Expression of Glucose Isomerase in E.coli

JIANG Qi， SU Lingqia， WU Jing， CHEN Sheng*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，JiangNan University，Wuxi 214122，China）

Phospholipase C（PLC）hydrolyzes the phospholipids in the membrane.The hydrolysis was partial，which would enhance the cell membrane permeability，and then proteins in the cytoplasm were released into culture medium.In this study，PLC was co-expressed with glucose isomerase（GI）.In shake flask fermentation of recombinant E.coli BL21（DE3），the activity of GICin culture supernatant was 3.4 U/mL，which was 93%of the total enzyme activity in culture supernatant and cytoplasm.GICwas released into culture medium.The GICwas purified and characterized.The specific activity of GICwas 12.1 U/mg，the optimum temperature was 80℃，and the activity of GICwas maximal at pH 10.The characteristics of GICwere similar to GIO，In addition，The enzyme activity reached 17.7 U/mL in 24 hours by utilizing fed-batch strategy in 3 L fermentor.

phospholipase C，glucose isomerase，co-expression，released into culture medium

Q 814

A

1673—1689（2017）03—0236—07

2015-03-06

國家杰出青年基金項目（31425020）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20140132）。

*通信作者：陳 晟（1981—），女，江蘇常州人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物、酶工程、發(fā)酵工程與技術(shù)方面的研究。E-mail：chensheng@jiangnan.edu.cn

姜琪，宿玲恰，吳敬，等.共表達磷脂酶C促進葡萄糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的胞外表達[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（03）：236-242.