結(jié)腸癌組織中Six1、FOXC2及E-cad表達(dá)變化及臨床意義

王靜苗，賈喜花，宋泰寧，王曉博，鄭淑君

(保定市第一中心醫(yī)院，河北保定071000)

·臨床研究·

結(jié)腸癌組織中Six1、FOXC2及E-cad表達(dá)變化及臨床意義

王靜苗，賈喜花，宋泰寧，王曉博，鄭淑君

(保定市第一中心醫(yī)院，河北保定071000)

目的 觀察結(jié)腸癌組織中與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的同源盒蛋白1(Six1)、叉頭框蛋白C2(FOXC2)以及E-鈣黏蛋白(E-cad)表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)70例結(jié)腸癌組織和30例癌旁正常組織中的Six1、FOXC2及E-cad，分析三者在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 Six1、FOXC2在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.9%和74.3%，均高于癌旁正常組織中的16.7%和20.0%(P均<0.05)；E-cad在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為21.4%，低于癌旁正常組織的80.0%(P<0.05)。Six1、FOXC2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.426，P<0.05)，均與E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.480、-0.728，P均<0.05)。Six1、FOXC2及E-cad表達(dá)與結(jié)腸癌TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別及腫瘤直徑、分化狀態(tài)無(wú)關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 在結(jié)腸癌組織中，Six1和FOXC2高表達(dá)，E-cad低表達(dá)；三者可能共同促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

結(jié)腸癌；同源盒蛋白1；叉頭框蛋白C2；E-鈣黏蛋白；上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)現(xiàn)象與許多腫瘤的早期侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。E-鈣黏蛋白(E-cad)表達(dá)下調(diào)或抑制可以開(kāi)啟EMT，同源盒蛋白1(Six1)是一種促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而叉頭框蛋白C2(FOXC2)被證實(shí)是EMT的重要調(diào)節(jié)者之一。本研究采用免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸癌組織中的Six1、FOXC2和E-cad，為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年1月～2016年3月保定市第一中心醫(yī)院外科手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的原發(fā)性結(jié)腸腺癌組織70例。患者中男31例，女39例；年齡25～86歲，中位年齡61歲；組織高分化25例，中分化29例，低分化16例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移40例，無(wú)轉(zhuǎn)移30例。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期30例；浸潤(rùn)深度T1～T245例，T3～T425例?；颊咝g(shù)前均未行放化療及生物靶向等治療，病歷資料完整。另留取距腫瘤邊緣>5 cm的癌旁正常組織標(biāo)本30例作為對(duì)照。

1.2 Six1、FOXC2和E-cad檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法，通用免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。兔抗人Six1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人FOXC2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Arigo公司，兔抗人E-cad單克隆抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物試劑公司，3種抗體均以1∶100稀釋。將組織石蠟切片置于65 ℃烤箱中烤2 h，常規(guī)脫蠟；依次在二甲苯中室溫孵育10 min×2次，無(wú)水乙醇中室溫孵育5 min×2次，95%的乙醇中室溫孵育5 min×2次，蒸餾水洗2次，室溫孵育。PBS沖洗3 min。高壓抗原修復(fù)，PBS沖洗，5 min×3次。滴加一抗(用PBS液按1∶100)稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；PBS沖洗，5 min×3次；滴加HRP標(biāo)記二抗工作液50 μL，室溫孵育60 min；PBS沖洗，5 min×3次。DAB顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察，用蒸餾水洗滌終止顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，1%乙醇鹽酸分化；自來(lái)水返藍(lán)，蒸餾水洗滌，脫水、透明、封片。取已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。將染色切片在雙盲情況下由2名病理科醫(yī)師觀察評(píng)價(jià)，并進(jìn)行病理圖片采集。FOXC2、Six1和E-cad陽(yáng)性染色均呈棕黃色顆粒，前兩者主要定位于細(xì)胞質(zhì)，后者主要定位于細(xì)胞膜。①陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：每例標(biāo)本每個(gè)指標(biāo)隨機(jī)觀察5個(gè)高倍(×400)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0計(jì)0分，<10%計(jì)1分，10%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。②染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。兩項(xiàng)積分之積0～2為陰性表達(dá)，3～9為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析行Spearman檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌及癌旁組織中Six1、FOXC2和E-cad表達(dá)比較 Six1、FOXC2在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.9%(58/70)和74.3%(52/70)，在癌旁正常組織中分別為16.7%(5/30)和20.0%(6/30)，二者在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織(P均<0.05)；E-cad在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為21.4%(15/70)，低于癌旁正常組織的80.0%(24/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Six1、FOXC2和E-cad表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Six1、FOXC2、E-cad表達(dá)與結(jié)腸癌TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤直徑、分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Six1、FOXC2和E-cad表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 Six1、FOXC2和E-cad在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的關(guān)系 在結(jié)腸癌組織中，Six1與E-cad表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.480,P<0.01)，F(xiàn)OXC2與E-cad表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.728，P<0.05)，Six1與FOXC2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.426，P<0.01)。

3 討論

近年來(lái)，EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞在特定的病理和生理情況下轉(zhuǎn)化為具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象。近期研究表明，腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷EMT后獲得運(yùn)動(dòng)能力是其侵襲鄰近組織和發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提。目前，已有報(bào)道提示EMT現(xiàn)象在結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中均有發(fā)生；它通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞的侵襲性，促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，加速腫瘤的進(jìn)展[1]。

Six1是同源盒基因家族成員之一，定位于人類(lèi)染色體14q23上，其編碼的蛋白是由一個(gè)183 bp高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域(HD，61個(gè)氨基酸)和Six結(jié)構(gòu)域(SD，110～115個(gè)氨基酸)組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合的特異性決定了其靶基因的特異性，不僅可影響多種組織器官的發(fā)育成熟，而且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。已有研究證實(shí)，Six1過(guò)表達(dá)既可上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物，又可下調(diào)上皮標(biāo)志物，即其過(guò)表達(dá)能夠引起EMT[3]。目前研究表明，Six1的表達(dá)與胰腺癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。Jin等[6]研究表明，Six1過(guò)表達(dá)通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)通路導(dǎo)致EMT，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究顯示，Six1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，并且與腫瘤TNM分期、浸潤(rùn)深度有關(guān)。這表明Six1的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性程度和疾病進(jìn)展有著密切聯(lián)系，與之前的研究結(jié)果相一致。

FOXC2亦稱(chēng)為間充質(zhì)叉頭框1(MHF1)，定位于人類(lèi)染色體的6q22～16q24，無(wú)內(nèi)含子，僅由一個(gè)單獨(dú)編碼的外顯子構(gòu)成。其編碼的蛋白質(zhì)總共有494個(gè)氨基酸殘基，具有顯著的forkhead結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞核中影響DNA的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)[7]。近來(lái)研究表明，F(xiàn)OXC2既可促進(jìn)血管和淋巴管新生，又能作為EMT過(guò)程中的一個(gè)重要誘導(dǎo)因子，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT而增加侵襲轉(zhuǎn)移能力[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)多伴隨間質(zhì)表型如Vimentin、平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(α-SMA)、N-鈣黏蛋白(N-cad)表達(dá)上調(diào)，而上皮標(biāo)記物E-cad、細(xì)胞角蛋白表達(dá)缺失[9]；并且，在乳腺癌[10]、食管癌[11]等腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)FOXC2參與了對(duì)EMT的調(diào)控，主要表現(xiàn)為與相關(guān)EMT轉(zhuǎn)錄因子的共表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，抑制上皮性標(biāo)志物表達(dá)，從而促使腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力。Hollier等[12]研究表明，在乳腺癌中，F(xiàn)OXC2表達(dá)與EMT和干細(xì)胞特性相關(guān)，干擾FOXC2表達(dá)能抑制細(xì)胞的間質(zhì)表型和相關(guān)的侵襲行為及干細(xì)胞特性，而FOXC2過(guò)表達(dá)又能誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞特性及乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Nishida等[13]研究表明，F(xiàn)OXC2在食管癌中高表達(dá)，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)相關(guān)，可能是評(píng)估食管癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。FOXC2在結(jié)腸癌中亦有部分報(bào)道，鄧丹玲等[14]通過(guò)蛋白免疫印跡法、實(shí)時(shí)定量PCR法及免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2蛋白和mRNA在高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株，在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)也高于正常結(jié)直腸黏膜組織。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，其表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FOXC2高表達(dá)可能參與了結(jié)腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程，甚至促使結(jié)腸癌向更加惡性的階段進(jìn)展，同時(shí)也預(yù)示著FOXC2高表達(dá)可能與結(jié)腸癌患者的生存期短、預(yù)后不良具有相關(guān)性，這與之前的研究結(jié)果類(lèi)似。

E-cad是一類(lèi)主要介導(dǎo)同質(zhì)細(xì)胞間黏附的跨膜糖蛋白，以二聚體形式分布于細(xì)胞膜表面，起到細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附與通訊的作用。E-cad表達(dá)缺失可使細(xì)胞之間的極性丟失，黏附能力下降，使其本身表現(xiàn)出非上皮細(xì)胞獨(dú)特性；在上皮細(xì)胞發(fā)生EMT及腫瘤發(fā)生過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)有E-cad表達(dá)下調(diào)；作為EMT現(xiàn)象最重要的標(biāo)志性變化，轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá)和信號(hào)通路的開(kāi)啟都與E-cad表達(dá)下調(diào)有著密切的關(guān)系[15]。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中Six1和FOXC2明顯高表達(dá)而E-cad呈低表達(dá)，Six1、FOXC2與E-cad的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，且二者表達(dá)呈正相關(guān)；表明Six1和FOXC2在促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，均可能通過(guò)某種途徑降低E-cad在細(xì)胞膜表面的表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生EMT,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Six1和FOXC2、E-cad在促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能存在相互作用，聯(lián)合檢測(cè)這三種蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平可能會(huì)為EMT導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及未來(lái)新靶點(diǎn)的治療提供新的理論基礎(chǔ)，具體通過(guò)何種途徑尚待進(jìn)一步研究。另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這三種蛋白的研究，可為后續(xù)隨訪研究進(jìn)一步探討其判斷結(jié)腸癌患者的臨床預(yù)后提供一定的研究基礎(chǔ)。

[1] Lim SH, Becker TM, Chua W, et al. Circulating tumour cells and the epithelial mesenchymal transition in colorectal cancer[J]. Clin Pathol, 2014,67(10)：848-853.

[2] Liu Y, Chu A, Chakroun I, et al. Cooperation between myogenic regulatory factors and Six family transcription factors is important for myoblast differentiation[J]．Nucleic Acids Res, 2010,38(20):6857-6871．

[3] 洪甜,李玲,李文超,等.人Six1基因缺失突變體對(duì)上皮鈣黏素啟動(dòng)子活性的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2016,32(2):224-227.

[4] Li Z, Tian T, Lv F, et al. Six1 promotes proliferation of pancreatic cancer cells via upregulation of cyclin D1 expression[J]. PLoS One, 2013,8(3):e59203.

[5] Wang CA, Jedlicka P, Patrick AN, et al. Six1 induces lym-phangiogenesis and metastasis via upregulation of VEGF-C in mouse models of breast cancer[J]. J Clin Invest, 2012,122(5):1895-1906.

[6] Jin H, Cui M, Kong M, et al. Sineoculis homeobox homolog protin is assiciated with breast cancer progression and survival outcome[J]. Exp Mol Pathol, 2014,97(2):247-252.

[7] Shimeld SM, Degnan B, Luke GN. Evolutionary genomics of the Fox genes: origin of gene families and the ancestry of gene clusters[J]. Genomics, 2010,95(5):256-260.

[8] Ren YH, Liu KJ, Wang M, et al. De-sumoylation of foxc2 by senp3 promotes the epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer cells[J]. Oncotarget, 2014,5(16):7093-7104.

[9] You W, Gao H, Fan L, et al. Foxc2 regulates osteogenesis and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. BMC Muscul Dis, 2013,14(1):1235-1245.

[10] Ye J, Wu D, Wu E, et al. The cancer stem cell niche:cross talk between cancer stem cells and their microenvironment[J]. Tumour Biol, 2014,35(5):3945-3951.

[11] Wang J, Wang C, Meng Q, et al. siRNA targeting Notch-1 decreases glioma stem cell proliferation and tumor growth[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(3):2497-2503.

[12] Hollier BG, Tinnirello AA, Werden SJ, et al. FOXC2 expression links eoithelial mesen chymaltransition and stem cell properties in breast cancer [J]. Cancer Res, 2013,73(6):1981-1992.

[13] Nishida N, Mimori K, Yokobori T, et al. FOXC2 is a novel prognostic factor in human esophageal squamous cell carcinnoma[J]. Ann Surg Oncol, 2011,18(2):535-542.

[14] 鄧丹玲,崔艷梅,廖雯婷,等.FOXC2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義[J].診斷病理學(xué)雜志,2016,23(4):272-275.

[15] 趙俊卿,李云峰,趙婷,等.腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究[J].腫瘤,2010,30(10):890-893.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.012

R735.3

B

1002-266X(2017)10-0039-03

2016-08-01)