TRIM28在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

馬素珍，潘曉麗，張方方，劉丹丹，石寧，郝萬清，朱艷琴

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州450008)

·基礎(chǔ)研究·

TRIM28在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

馬素珍，潘曉麗，張方方，劉丹丹，石寧，郝萬清，朱艷琴

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州450008)

目的 觀察三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(TRIM)28在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。方法 采用免疫組化法檢測(cè)145例結(jié)直腸癌及其相應(yīng)癌旁組織中的TRIM28，分析其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及生存預(yù)后的關(guān)系。將結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染shTRIM28降表達(dá)質(zhì)粒、空載對(duì)照質(zhì)粒48 h，采用Western blot法檢測(cè)HT29細(xì)胞中的TRIM28，分別采用MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察HT29細(xì)胞的增殖及遷移能力。結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中TRIM28高表達(dá)97例，高于癌旁組織中的4例(P<0.01)；并且，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes分期高者TRIM28表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes分期低者(P均<0.05)。TRIM28高表達(dá)者3年無病生存率為68.0%,低于TRIM28低表達(dá)者的83.3%(P<0.01)；COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果顯示，TRIM28表達(dá)是結(jié)直腸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素(HR=3.26，P=0.01)。觀察組HT29細(xì)胞中TRIM28相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.01)，且觀察組細(xì)胞增殖OD值及遷移距離均小于對(duì)照組(P均<0.01)。結(jié)論 TRIM28在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，降低其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及遷移；其在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后指標(biāo)和潛在治療靶點(diǎn)。

結(jié)直腸癌；三結(jié)構(gòu)域蛋白家族；臨床病理指標(biāo)；生存預(yù)后；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

目前，結(jié)直腸癌發(fā)病率依然迅速上升，呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。雖然，腫瘤治療的方法有了較大進(jìn)步，但患者總生存期和無病生存期改善不顯著，所以尋找有效的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。大量研究顯示，三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(TRIM)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[2,3]。TRIM28也稱KAP1或TIF1β，由于它能與含有鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白相互作用，所以TRIM28被認(rèn)為是通用轉(zhuǎn)錄共抑制因子[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，TRIM28可以抑制p53活性從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA損傷的敏感性，而且TRIM28還能抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄及其促凋亡功能的發(fā)生[5]。TRIM28已經(jīng)被證實(shí)與多種腫瘤有關(guān)，但尚未見TRIM28表達(dá)與結(jié)直腸癌關(guān)系的報(bào)道。本研究通過檢測(cè)TRIM28在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，分析其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，并在結(jié)直腸癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2006年1月～2010年12月145例結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的組織標(biāo)本，包括結(jié)腸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤﹥5 cm)?；颊咝g(shù)前均未行化療及放療，所有腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸腺癌，癌旁組織證實(shí)無癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)。其中，男82例，女63例；年齡37～84歲，中位年齡61歲；高、中分化腺癌94例，低分化腺癌51例；浸潤(rùn)深度T1～T241例，T3～T4104例；Dukes臨床分期A期29例，B期60例，C期39例，D期17例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移92例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例。

1.2 結(jié)腸癌和癌旁組織中TRIM28檢測(cè) 采用免疫組化法。一抗TRIM28兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫組化專用一抗稀釋液、辣根過氧化物酶標(biāo)記通用二抗(PV-6000)及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)染色采用SP二步法?？贵w稀釋液1∶100稀釋一抗TRIM28，4 ℃孵育過夜；免疫組化通用二抗室溫孵育1 h，DAB顯色2 min。免疫組化結(jié)果判斷：細(xì)胞核被染成顆粒狀黃褐色為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分比<50%為低表達(dá)，≥50%為高表達(dá)。

1.3 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)及降表達(dá)TRIM28細(xì)胞系的構(gòu)建 將結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將TRIM28降表達(dá)序列TCTGTTCTCTGTCCTCTCGAGAGGACAGAGAACAGAGC

CAGG裝入載體pLK0.1，構(gòu)建shTRIM28降表達(dá)質(zhì)粒，空載體作為對(duì)照質(zhì)粒；然后分別將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集病毒感染HT29細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定降表達(dá)TRIM28的細(xì)胞系(觀察組)和對(duì)照細(xì)胞系(對(duì)照組)。

1.4 結(jié)腸癌細(xì)胞中TRIM28檢測(cè) 采用Western blot法。RIPA裂解液提取兩組細(xì)胞的蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)量蛋白濃度并均一；SDS-PAGE凝膠電泳90 min，Bio-Rad裝置濕轉(zhuǎn)蛋白于PVDF膜上，17 mA轉(zhuǎn)膜過夜；切取含目的條帶的PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育TRIM28抗體(1∶2 000)與β-actin內(nèi)參抗體(Santa Cruz公司，1∶5 000)4 ℃過夜， TBST洗膜10 min×3次；室溫孵育二抗(1∶10 000)1 h，再用TBST洗膜10 min×3次；ECL顯影，用Image J軟件分析并計(jì)算TRIM28相對(duì)表達(dá)量。

1.5 結(jié)腸癌細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。取兩組細(xì)胞，先用0.05%胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，以2×103/孔接種96孔板；分別在24、48、72、96、120 h時(shí)取出96孔板，每孔加入5 mg/mL 的MTT 20 μL，孵育4 h后棄液；每孔中加入DMSO 150 μL，震蕩10 min；用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)各孔的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 結(jié)腸癌細(xì)胞遷移情況觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取兩組細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板；第2天用槍頭劃痕(寬約0.5 cm)，PBS清洗脫落的細(xì)胞；加入無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；在0、24、48 h拍照,并測(cè)量細(xì)胞遷移距離。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)；單因素生存分析采用Log-Rank檢驗(yàn)，多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌和癌旁組織中TRIM28表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織中TRIM28高表達(dá)97例、低表達(dá)48例，癌旁組織分別為4、141例，結(jié)腸癌組織中TRIM28表達(dá)高于癌旁組織(χ2=127.45，P<0.01)。

2.2 TRIM28表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 TRIM28表達(dá)與患者的年齡、性別、病理分化程度及腫瘤浸潤(rùn)深度沒有相關(guān)性；但存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes分期高者TRIM28表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes分期低者(P均<0.05)。見表1。

表1 TRIM28表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 TRIM28表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 隨訪截止2015年12月31日，TRIM28高表達(dá)者3年無病生存率為68.0%,顯著低于TRIM28低表達(dá)者的83.3%(P<0.01)。多因素分析顯示，腫瘤Dukes分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TRIM28表達(dá)是結(jié)直腸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素。見表2。

表2 影響結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的多因素分析結(jié)果

2.4 兩組結(jié)直腸癌細(xì)胞TRIM28表達(dá)量比較 觀察組結(jié)直腸癌細(xì)胞中TRIM28相對(duì)表達(dá)量為0.15±0.02，低于對(duì)照組的0.89±0.05(P<0.01)。

2.5 沉默TRIM28表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響 兩組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的OD值比較,見表3。

表3 兩組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的OD值比較±s)

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.6 沉默TRIM28表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響 觀察組結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移距離為(0.09±0.02)mm，低于對(duì)照組的(0.53±0.10)mm(P<0.01)。

3 討論

TRIM28蛋白具有一個(gè)N-末端的三重模體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)、2個(gè)B-boxes盒和1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域[6]。TRIM28首先通過含有KRAB結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白被招募到染色質(zhì)上，進(jìn)而作為支架蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾和泛素化。因此，在表觀遺傳方面，TRIM28通過多個(gè)轉(zhuǎn)錄共抑制復(fù)合物調(diào)控基因的表達(dá)[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，TRIM28在胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞干性、調(diào)控細(xì)胞分化、DNA損傷修復(fù)等多個(gè)生理方面發(fā)揮著重要的作用。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TRIM28高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞系中，TRIM28表達(dá)顯著升高[9]。在臨床試驗(yàn)中，也有許多研究發(fā)現(xiàn)TRIM28同樣參與了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。TRIM28高表達(dá)與宮頸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]，是腹膜轉(zhuǎn)移癌的獨(dú)立預(yù)后因素[2]；TRIM28高表達(dá)可能與胃癌和甲狀腺癌的臨床分期有關(guān)[11,12]，與早期肺癌的預(yù)后有關(guān)[13～15]；此外，TRIM28在胰腺癌中高表達(dá)，且與癌細(xì)胞侵襲有關(guān)[16,17]。但是，尚未見TRIM28表達(dá)與結(jié)直腸癌關(guān)系的報(bào)道。

在對(duì)結(jié)直腸癌的研究中，我們得到了與其他腫瘤相似的結(jié)論，TRIM28高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們首先采用免疫組化法檢測(cè)TRIM28在結(jié)直腸癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示TRIM28在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示REIM28高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)。而且，TRIM28表達(dá)水平越高，結(jié)直腸癌越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，高表達(dá)TRIM28的腫瘤Dukes分期較高，提示TRIM28與結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。此外，我們通過對(duì)145例結(jié)直腸癌患者的隨訪，發(fā)現(xiàn)TRIM28高表達(dá)者預(yù)后較差，而且TRIM28是結(jié)直腸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素。在分子生物學(xué)研究中，常通過過表達(dá)或沉默基因來研究其生物學(xué)功能。在本研究中，我們利用shRNA沉默TRIM28的表達(dá)，觀察TRIM28對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默TRIM28后結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低，這與我們?cè)诮M織中發(fā)現(xiàn)的TRIM28高表達(dá)患者更易發(fā)生轉(zhuǎn)移一致。以上結(jié)果提示，TRIM28在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中功能的發(fā)揮，主要是影響細(xì)胞的增殖、遷移能力。另外，研究[5,9,10,13]也發(fā)現(xiàn)TRIM28高表達(dá)與卵巢癌、肺癌、宮頸癌和乳腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

綜上所述，我們認(rèn)為TRIM28在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，而且TRIM28可作為結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)；并且，TRIM28在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用，TRIM28高表達(dá)具有一定的普遍性，有可能作為腫瘤靶向生物治療的潛在靶點(diǎn)。

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河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A310021)。

朱艷琴(E-mail: jc.zyqin@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.008

R735

A

1002-266X(2017)10-0028-03

2016-06-17)