Wnt 信號(hào)通路阻滯劑DKK-1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116侵襲能力的影響

張延新，張印坡，趙琰 ，王記紅 ，張艷， 崔東濤

(1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002；2漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院)

Wnt 信號(hào)通路阻滯劑DKK-1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116侵襲能力的影響

張延新1，張印坡1，趙琰2，王記紅1，張艷1， 崔東濤1

(1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002；2漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院)

目的 探討Wnt 信號(hào)通路阻滯劑DKK-1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116侵襲能力的影響及其分子機(jī)制。方法 將HCT116細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，分別給予DKK-1 100 ng/mL及等量細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的變化，分別采用Western blot法、RT-PCR法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中Wnt 信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin、EMT調(diào)控因子Snail及上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)，結(jié)果 觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為(45.29±6.25)個(gè)/HP，低于對(duì)照組的(76.36±8.32) 個(gè)/HP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，觀察組HCT116細(xì)胞中β-catenin、Snail、Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低，E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)水平增高(P均<0.05)。結(jié)論 Wnt 信號(hào)通路阻滯劑DKK-1可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)而降低人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的侵襲能力。

結(jié)腸癌；Wnt 信號(hào)通路；通路阻滯劑；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；細(xì)胞侵襲

研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是許多惡性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制[1～3]，而Wnt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)將外源性Wnt 信號(hào)通路阻滯劑DKK-1作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，檢測(cè)細(xì)胞中Wnt 信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin、EMT調(diào)控因子Snail及上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)；采用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變，分析上述基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲能力變化間的關(guān)系,旨在為臨床進(jìn)一步探討如何抑制結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，DKK-1購(gòu)自Pepro Tech公司；兔抗人β-catenin抗體、Snail抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體均購(gòu)自Abcam公司，PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RT-PCR引物由北京博大泰克生物技術(shù)有限公司完成設(shè)計(jì)、合成，Transwell小室購(gòu)自Costar公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HCT116細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；以2.5 g/L胰酶消化后繼續(xù)培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[5]。將細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，分別給予DKK-1 100 ng/mL及等量細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 HCT116細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)。將Transwell小室放 24 孔板中，上室內(nèi)加入以0.2% BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)基 1∶5稀釋后的基質(zhì)膠50 μL/孔，37 ℃溫箱過(guò)夜使膠凝固。使用前在上室加入 100 μL 含0.2% BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)基，在下室加入 600 μL小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3的條件培養(yǎng)基[5]，水化 30 min。將兩組腫瘤細(xì)胞在0.2%BSA無(wú)血清培養(yǎng)基孵育過(guò)夜，制成5×105/mL 細(xì)胞懸液。吸出小室的上層培養(yǎng)基，取細(xì)胞懸液 100 μL 加入上室，5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h；常規(guī)蘇木素染色，400倍鏡下觀察。在每個(gè)濾膜上均隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)全部視野穿膜細(xì)胞平均數(shù)，作為一個(gè)濾膜每視野下侵襲細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 HCT116細(xì)胞中β-catenin、Snail、Vimentin、E-cadherin蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。 吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS漂洗后將腫瘤細(xì)胞刮下加到1.5 mL EP管中，以4 000 r/min離心3 min后收集細(xì)胞。加入200 μL裂解液冰上裂解60 min，4 ℃下以12 000 r/min離心30 min，取上清并測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品變性后按60 μg/道上樣于10 % SDS-PAGE 凝膠，加入電泳緩沖液，120 mV電泳2.5 h，按常規(guī)電轉(zhuǎn)移步驟將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；經(jīng)5 %的脫脂牛奶封閉1 h后，加入5% BSA/PBST緩沖液1∶1 000稀釋的兔抗人β-catenin、Snail抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST漂洗3 次，每次5 min；加入5%的脫脂牛奶/PBST緩沖液稀釋的二抗(濃度為1∶10 000)，室溫孵育1 h；PBST漂洗3次，每次5 min；ECL避光孵育2～3 min后，LAS-3000顯影曝光。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)各目標(biāo)條帶進(jìn)行掃描后并記錄其分子量及灰度值，計(jì)算各目標(biāo)條帶與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值之比，以此作為待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量[6，7]。

1.2.4 HCT116細(xì)胞中β-catenin、Snail、Vimentin、E-cadherin mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。根據(jù)Gene Bank收錄的基因序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST比對(duì)，經(jīng)過(guò)微機(jī)檢索與人類基因無(wú)同源性。由北京博大泰克生物技術(shù)有限公司合成，均進(jìn)行硫代磷酸化修飾。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

取兩組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，PBS液洗滌，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)總RNA純度、濃度和完整性，檢測(cè)合格后將 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 1.0 μg，Oligo(dT)18 μg(0.5 μg/μL)，2×ES Reaction Mix 10 μL，EasyScript RT 1 μL，補(bǔ)DEPC水至30 μL。42 ℃反應(yīng)30 min，99 ℃滅活5 min,4 ℃ 5 min,置于-20 ℃?zhèn)溆?。? μL用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：CDNA 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，10×Easy Tag Buffer(Mg2+) 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Easy Tag DNA Polymerase 0.5 μL，補(bǔ)雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30s(引物不同退火溫度不同)，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。陰性對(duì)照用無(wú)RNA酶的水代替cDNA進(jìn)行反應(yīng)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合后，加入含2%瓊脂糖凝膠(0.5 μg/mL EB)的加樣孔中，電壓4～10 V/cm條件下進(jìn)行電泳。采用D-140圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行記錄及分析，Quantity One軟件分析，目的基因表達(dá)量以目的基因的DNA條帶和β-actin 的DNA條帶灰度值比值表示[8]。

2 結(jié)果

2.1 兩組HCT116細(xì)胞侵襲能力比較 觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為(45.29±6.25)個(gè)/HP，明顯低于對(duì)照組的(76.36±8.32) 個(gè)/HP(P<0.05)。

2.2 兩組HCT116細(xì)胞β-catenin、Snail、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組HCT116細(xì)胞中β-catenin、Snail、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組HCT116細(xì)胞β-catenin、Snail、Vimentin、E-cadherin mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組HCT116細(xì)胞中β-catenin、Snail、Vimentin、E-cadherin mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，這也是影響患者臨床治療效果、生存率及生活質(zhì)量的重要因素，因而研究結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

EMT被認(rèn)為是許多惡性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲與轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制[1～3]，而β-catenin依賴的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[4]。Wnt 蛋白分子與胞膜相應(yīng)受體結(jié)合后，β-catenin磷酸化降解受抑，在胞質(zhì)內(nèi)逐漸堆積[9，10]，并影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；導(dǎo)致上皮源性細(xì)胞逐漸失去上皮樣表型，細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間的緊密連接減少，而間質(zhì)樣表型逐漸增強(qiáng)，遷移、游走能力增強(qiáng)，即發(fā)生EMT[11]。這對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞而言，侵襲能力增強(qiáng)。研究表明作為EMT調(diào)控因子，Snail參與了多種惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)將外源性Wnt 信號(hào)通路阻滯劑DKK-1作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞侵襲能力變化。結(jié)果顯示，觀察組腫瘤細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示阻斷Wnt 信號(hào)通路能明顯降低人結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。另外，本研究顯示，觀察組腫瘤細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin、EMT調(diào)控因子Snail、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)均較對(duì)照組降低，上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)均較對(duì)照組增高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示DKK-1可能通過(guò)阻斷經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路，降低 β-catenin 在胞質(zhì)內(nèi)聚積[12，13]，進(jìn)而抑制EMT調(diào)控因子Snail表達(dá)；Snail表達(dá)降低，對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin的抑制作用減弱，也不能上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin的表達(dá)[14]，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞EMT減弱、侵襲能力降低。

綜上所述，將外源性Wnt 信號(hào)通路阻滯劑DKK-1作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HCCT116，其可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞EMT降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，為進(jìn)一步探索抑制結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移有效途徑提供了一定的理論依據(jù)。

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Effects of Wnt signaling pathway antagonist DKK-1 on invasion ability of colon cancer cell line HCT116

ZHANGYanxin1,ZHANGYinpo,ZHAOYan,WANGJihong,ZHANGYan,CUIDongtao

(1LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China)

Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Wnt signal pathway antagonist DKK-1 on invasion ability of colon cancer cell line HCT116. Methods Conlon cancer HCT116 cells were divided into the experimental group and control group, which were cultured with exogenous DKK-1 (100 ng/mL) and the same amount of cell culture medium for 48 h, respectively. Transwell was used to observe the change of invasion ability. The protein and mRNA expression of β-catenin, Snail, E-cadherin and Vinentin in the HCT116 cells was observed by Western blotting and RT-PCR. Results The number of transmembrane cells in the experimental group was (45.29±6.25)/HP which was obviously lower than that in control group〔(76.36±8.32)/HP〕, and the difference was statistically significant (P<0.05). The protein and mRNA expression of β-catenin, Snail and Vinentin was lower and the expression of E-cadherin protein and mRNA was higher in the experimental group than that of the control group, and the differences were statistically significant (allP<0.05). Conclusion Wnt signal pathway antagonist DKK-1 can decrease the invasion ability of conlon cancer cell line HCT116 by inhibiting the process of epithelial-mesenchymal transition in tumor cells.

colon carcinoma; Wnt signaling pathway; pathway antagonist; epithelial-mesenchymal transition; cell invasion

河南省教育廳青年教師資助項(xiàng)目(2012GGJS-269)。

張延新(1974-)，男，副教授，主要研究方向?yàn)橄的[瘤病理。E-mail: zhangyx448@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.003

R735.3

A

1002-266X(2017)10-0008-03

2016-11-21)