口服降糖藥致低血糖對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響*

唐明薇，黎 瑤，王風(fēng)波

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,成都 610500)

論著·基礎(chǔ)研究

口服降糖藥致低血糖對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響*

唐明薇，黎 瑤，王風(fēng)波△

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,成都 610500)

目的 觀察糖尿病大鼠腦組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF) mRNA表達(dá)變化及口服降糖藥致低血糖的影響作用。方法 64只Wistar大鼠分為對(duì)照組(16只)、糖尿病模型組(48只)，制備高脂高糖飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素致2型糖尿病大鼠模型，模型組分為非藥物組(16只)、口服藥物治療組(16只)和低血糖組(16只)，口服藥物治療組和低血糖組大鼠均予格列本脲+二甲雙胍灌胃給藥，低血糖組劑量為口服藥物治療組5倍，每天1次，連續(xù)12 d，各組大鼠分別于低血糖反應(yīng)第3、6、9、12天取腦組織行RT-PCR法NGF mRNA檢測(cè)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，糖尿病模型組3組大鼠腦組織NGF mRNA表達(dá)均不同程度下降，低血糖降低最為顯著(P<0.01)，與非藥物組比較，口服藥物治療組升高明顯(P<0.01)，低血糖組則進(jìn)一步降低(P<0.01)。結(jié)論 口服降糖藥可有效增強(qiáng)糖尿病大鼠腦組織NGF mRNA表達(dá)，而口降糖藥致低血糖能使NGF mRNA表達(dá)進(jìn)一步下降，不利于糖尿病神經(jīng)病變的修復(fù)。

低血糖癥；糖尿??；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；口服降糖藥

據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患病率在世界范圍內(nèi)呈急劇上升趨勢(shì)，現(xiàn)今我國(guó)成年人的糖尿病患病率約為9.7%，成人糖尿病總數(shù)已超過9 240萬(wàn)，已成為世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家，其中2型糖尿病占90.0%以上。我國(guó)糖尿病患病率急劇增加的原因可能與城市化、老齡化、生活方式改變等因素相關(guān)[1]。糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病最常見并發(fā)癥之一，在2型糖尿病患者中發(fā)病率超過60.0%，是糖尿病患者致殘的重要因素，嚴(yán)重影響著糖尿病患者身心健康。目前，DPN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有研究證實(shí)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF) 及其受體的改變與缺失在其中起著重要作用，有效地控制血糖則有利于NGF的表達(dá)。糖尿病患者的治療過程中經(jīng)常發(fā)生低血糖反應(yīng)，低血糖給患者帶來的危害遠(yuǎn)較高血糖更快、更嚴(yán)重，輕者即可致神經(jīng)功能損害，對(duì)DPN的恢復(fù)顯然是很不利的。本研究通過口服常用降糖藥致糖尿病大鼠反復(fù)低血糖反應(yīng)，觀察大鼠腦組織NGF mRNA的表達(dá)變化情況，旨在進(jìn)一步探討低血糖對(duì)糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)病變臨床治療的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取64只Wistar成年雄性大鼠，體質(zhì)量260～300 g，均由成都大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；Trizol、DEPC(美國(guó)Gibco公司)；RT-PCR試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；引物合成(上海博亞生物技術(shù)有限公司提供)；格列本脲片(天津藥物研究院藥業(yè)公司)；鹽酸二甲雙胍片(齊魯藥業(yè))；血糖儀及試紙條(羅氏)。

1.2 方法

1.2.1 分組及糖尿病造模 64只健康Wistar大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫24 ℃左右，7 d后分為對(duì)照組(n=16)、糖尿病模型組(n=48)，糖尿病模型組又分為非藥物組(n=16)、

表1 各組大鼠血糖監(jiān)測(cè)情況比較

△：P<0.01，與對(duì)照組比較；*：P<0.01，與非藥物組比較；#：P<0.01，與口服藥物治療組比較。

表2 各組大鼠腦組織RT-PCR法NGF mRNA檢測(cè)情況比較

△：P<0.01，與對(duì)照組比較；*：P<0.01，與非藥物組比較；#：P<0.01，與口服藥物治療組比較；○：P<0.05，◇：P<0.01，與3 d比較。

口服藥物治療組(n=16)和低血糖組(n=16)。參照張玉領(lǐng)等[2]建立糖尿病大鼠模型：糖尿病模型組大鼠給予高脂高糖飼料(其中15.0%豬油，15.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽)，高脂高糖飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后，造模前禁食12 h，予腹腔注射25 mg/kg鏈脲佐菌素，注射前用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋，對(duì)照組大鼠腹腔注射等劑量0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射72 h后取尾靜脈血測(cè)血糖，隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病模型建立成功。對(duì)照組大鼠飼普通飼料常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 口服給藥方法 糖尿病造模成功后第4天開始給藥，口服藥物治療組和低血糖組大鼠均給予格列本脲片+鹽酸二甲雙胍片溶于生理鹽水灌胃?？诜幬镏委熃M按成人劑量給藥，即格列本脲片50 μg/kg，鹽酸二甲雙胍片5 mg/kg，每天2次，低血糖組劑量為口服藥物治療組5倍，每天1次，連續(xù)12 d。對(duì)照組及非藥物組大鼠灌胃同劑量生理鹽水。低血糖反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)：肢體抽搐，反應(yīng)遲鈍或昏迷，血糖小于或等于2.8 mmol/L。20 min后灌胃10%葡萄糖1 mL，低血糖癥狀緩解。各組大鼠給藥期間均普通飼料喂養(yǎng)，分別于給藥后第3、6、9、12天各取4只腦組織，斷頭取腦時(shí)間設(shè)定為低血糖反應(yīng)20 min左右，取腦大鼠不予灌胃葡萄糖。

1.2.3 腦組織RT-PCR法NGF mRNA檢測(cè) Trizol法提取大鼠腦組織總RNA，核酸紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品A260/A280在1.8～2.0。RT-PCR法：逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR反應(yīng)體系50 μL，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性55 s、57 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃終末延伸8 min；NGF上游引物序列:5′-GAT CGG CGT ACA GGC AGA AC-3′，下游引物序列:5′-GGC TCG CCA CTT GGT CTC GA-3′；β-actin上游引物序列:5′-GGT GAA GGT GGG TGG CAA-3′，下游引物序列:5′-TTC CCA TTC TCA GCC TTA AC-3′。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較 糖尿病造模成功后，大鼠在第2～3天逐漸出現(xiàn)不同程度的食量、飲水增加，尿量增多，消瘦，精神不振，體毛缺乏光澤，活動(dòng)遲緩?？诜幬镏委熃M大鼠上述癥狀隨治療進(jìn)程明顯改善，而低血糖組大鼠低血糖發(fā)作時(shí)肢體抽搐，反應(yīng)遲鈍明顯甚至昏迷，血糖顯著下降，灌胃葡萄糖水后緩解，但精神狀態(tài)更差，活動(dòng)減少。低血糖反應(yīng)后20 min各組大鼠血糖監(jiān)測(cè)情況，見表1。

2.2 4組大鼠腦組織RT-PCR法NGF mRNA檢測(cè)情況 與對(duì)照組相比，糖尿病模型組3組大鼠腦組織NGF mRNA表達(dá)均不同程度下降，低血糖組降低最為顯著(P<0.01)。與非藥物組比較，口服藥物治療組明顯升高(P<0.01)，低血糖組則進(jìn)一步降低(P<0.01)；不同時(shí)間窗比較，非藥物組12 d較3 d有一定下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低血糖組12 d明顯低于3 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，對(duì)照組、口服藥物治療組各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

3 討 論

盡管DPN在2型糖尿病患者中發(fā)病率很高，嚴(yán)重影響著糖尿病患者的身心健康，但目前DPN的發(fā)病機(jī)制仍然未能完全闡明。NGF又稱神經(jīng)誘向因子，作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的主要成員之一，具有使神經(jīng)細(xì)胞存活率升高和促神經(jīng)突觸生長(zhǎng)的生物活性，與特異性受體TrkA相結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功效，促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，延緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程，在神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育和神經(jīng)軸突的再生修復(fù)中均扮演著重要角色，目前已在阿爾茨海默病及新生兒缺血、缺氧性腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療應(yīng)用上得到了大量而肯定的研究成果[3]。NGF及其受體的異常在DPN的過程中亦起著重要作用，NGF合成障礙，逆向軸漿運(yùn)輸能力降低及受體TrkA表達(dá)異常等均可影響神經(jīng)損傷后再生修復(fù)，參與DPN的發(fā)生、發(fā)展[4]。近年來大量研究表明，有效控制血糖有利于增加NGF的表達(dá)，促進(jìn)DPN恢復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠下頜下腺NGF陽(yáng)性表達(dá)明顯降低，連續(xù)皮下注射胰島素治療2個(gè)月后糖尿病大鼠血糖得到顯著控制，下頜下腺NGF陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，接近或達(dá)到正常水平[5]。王蕾等[6]用降糖通絡(luò)湯灌胃2型糖尿病大鼠，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)到大鼠坐骨神經(jīng)組織中NGF表達(dá)呈漸行增高趨勢(shì)，與血糖控制水平呈正相關(guān)，且施萬(wàn)細(xì)胞凋亡率明顯降低。呂翠巖等[7]用糖痹康灌胃2型糖尿病大鼠，大鼠坐骨神經(jīng)組織中NGF水平與NGF mRNA表達(dá)顯著升高，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，遠(yuǎn)優(yōu)于單純甲鈷胺片營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)組對(duì)NGF表達(dá)的提升作用。有學(xué)者研究糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腰骶部神經(jīng)髓鞘水腫變性甚至脫落，神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)及膠質(zhì)空泡變性，同時(shí)腹腔內(nèi)注射胰島素和鼠NGF治療后，大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞和腰骶部神經(jīng)元中NGF的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，神經(jīng)變性明顯改善，優(yōu)于單純胰島素或鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組[8]。以上研究均說明，無論中藥或西藥，只要能夠有效控制血糖，均能增強(qiáng)神經(jīng)組織NGF的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)病變的再生修復(fù)。

低血糖是糖尿病臨床治療過程當(dāng)中常見的不良反應(yīng)，許多糖尿病患者由于缺乏對(duì)合理規(guī)范服用降糖藥物的良好認(rèn)識(shí)，常有低血糖的發(fā)生，甚至頻繁的低血糖反應(yīng)發(fā)作亦不鮮見。低血糖給患者帶來的危害遠(yuǎn)較高血糖更快更嚴(yán)重，輕者即可致神經(jīng)功能損害，對(duì)包括DPN在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷恢復(fù)是極其不利的。反復(fù)重度低血糖對(duì)糖尿病大鼠海馬PKA磷酸化水平發(fā)生明顯增高改變，提示可致腦損傷和認(rèn)知功能障礙，甚至神經(jīng)元的喪失[9]。有研究用胰島素誘導(dǎo)大鼠低血糖后在海馬區(qū)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Nogo-A，發(fā)現(xiàn)低血糖組大鼠海馬區(qū)Nogo-A表達(dá)明顯降低，而低血糖后葡萄糖再灌注大鼠Nogo-A表達(dá)進(jìn)一步降低，且細(xì)胞凋亡最多，提示低血糖不僅導(dǎo)致中樞神經(jīng)損傷，而且低血糖后葡萄糖再灌注可加劇這種損傷，對(duì)于臨床常用的補(bǔ)糖糾正低血糖的方法提出了一定警示作用[10]。格列本脲片及鹽酸二甲雙胍片均有較強(qiáng)的降低血糖作用，雖然格列本脲片不良反應(yīng)比較大，但是由于價(jià)格便宜，在我國(guó)廣大區(qū)域仍是臨床常用的口服降糖藥物，有報(bào)道服用格列本脲片可致較高的低血糖發(fā)生率，其中低血糖昏迷高達(dá)62.7%，服用格列本脲片的人群以老年人居多，往往合并心腦血管等各種慢性病，腎功能減退，長(zhǎng)期混合服用多種藥物，更易導(dǎo)致嚴(yán)重的低血糖反應(yīng)，持久且難以糾正[11]。本實(shí)驗(yàn)采用格列本脲片+鹽酸二甲雙胍片超劑量灌胃2型糖尿病大鼠致反復(fù)低血糖發(fā)作，觀察到低血糖組大鼠較未降糖治療糖尿病大鼠腦組織NGF mRNA的表達(dá)更低，并隨著時(shí)間呈逐漸加重趨勢(shì)，雖然未降糖治療糖尿病大鼠的表達(dá)也呈逐漸降低表現(xiàn)，但低血糖組是更加明顯，說明低血糖嚴(yán)重妨礙了NGF的合成及表達(dá)，尤其頻繁反復(fù)發(fā)作的低血糖影響作用更甚，非常不利于糖尿病性神經(jīng)病變的再生修復(fù)，為臨床上口服降糖藥治療糖尿病過程中的低血糖危害性的認(rèn)識(shí)提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013版) [J].中國(guó)糖尿病雜志，2014,22(8):2-38.

[2]張玉領(lǐng)，陳培，劉家秀，等.2型糖尿病大鼠模型的建立[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39(15)：3922-3924.

[3]于洋，洪仕君，趙麗萍，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF 的神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制及臨床應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(2)：148-151.

[4]Huang EJ，Reichardt LF.Trkreceptors:roles in neuronal signal transduction[J].Annu Rev Biochem，2003(72):609-642.

[5]桂麗，黃大可，王盛花，等.胰島素對(duì)糖尿病大鼠下頜下腺內(nèi)NGF及VEGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2014,23(3)：237-240.

[6]王蕾，呂楠，郝迪，等.降糖通絡(luò)湯對(duì)DPN大鼠NGF mRNA表達(dá)的影響及對(duì)雪旺細(xì)胞抗氧化、抗凋亡作用機(jī)制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30(10)：3671-3676.

[7]呂翠巖，李秋明，毛穎秋，等.糖痹康對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)NGF蛋白及NGF mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014,20(5)：157-161.

[8]郭學(xué)敬，郭躍先，白艷，等.糖尿病大鼠治療后膀胱和腰骶背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)研究[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2012,17(1)：42-45.

[9]項(xiàng)迎春，廖美華，田允，等.反復(fù)重度低血糖對(duì)糖尿病大鼠海馬PKA/PKC/CaMKⅡ磷酸化信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013,30(6)：586-590.

[10]王喜云，趙玉武.低血糖后葡萄糖再灌注大鼠海馬Nogo-A蛋白的表達(dá)[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2013，21(6)：441-445.

[11]郭美華，邱曉紅，馬滿玲，等.格列本脲致低血糖反應(yīng)的文獻(xiàn)分析[J].中國(guó)藥物警戒，2013,10(7)：424-431.

Effect of oral antidiabetic drugs on NGF mRNA expression in rats brain with diabetes*

TangMingwei,LiYao,WangFengbo△

(DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu,Sichuan610500,China)

Objective To observe the expression of NGF mRNA in rats brain with diabetes and the effects of hypoglycemia caused by oral antidiabetic drugs on NGF mRNA.Methods A total of 64 adult Wistar rats were randomly divided into control group(16)and diabetes model group(48).Using high fat and high sugar diet+intraperitoneal injection of streptozotocin to prepare type 2 diabetes model.The diabetes model group was randomly divided into non-medication group(16),oral medication group(16) and hypoglycemia group(16).The oral medication rats and hypoglycemia rats were given glibenclamide+metformin by intragastric administration once daily for 12 d,the dose of hypoglycemia rats was 5 times of treatment rats.The brain tissues of rats in each group were used respectively the RT-PCR method to detect NGF mRNA at 3,6,9 and 12 d.Results Compared with the control group,the expression of NGF mRNA in the brain tissues of the 3 groups of diabetic rats were decreased in different degrees and the non-medication group was the most obvious(P<0.01).Compared with the non-medication group,the oral medication group was significantly increased(P<0.01)，the hypoglycemia group was further decreased(P<0.01).Conclusion Oral hypoglycemic drugs can effectively enhance the expression of NGF mRNA in brain tissue of diabetic rats,but hypoglycemia caused by Oral antidiabetic drugs can make the expression of NGF mRNA further decreased.So hypoglycemia is not conducive to the repair of diabetic neuropathy.

hypoglycemia;diabetes mellitus;nerve growth factor;oral hypoglycemic drugs

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.004

四川省衛(wèi)生廳科研課題(120478)。 作者簡(jiǎn)介：唐明薇(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事內(nèi)分泌與代謝疾病診療工作?！?/p>

，E-mail:251205687@qq.com。

R587

A

1671-8348(2017)08-1017-03

2016-07-20

2016-09-18)