升降散對DM大鼠雙歧桿菌、大腸桿菌及IL-6的影響

杜芬芬 孫曉澤 劉愛華*

1.河南中醫(yī)藥大學2014級碩士研究生，河南 鄭州 450046；2.河南省中醫(yī)院干部病房，河南 鄭州 450002

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升降散對DM大鼠雙歧桿菌、大腸桿菌及IL-6的影響

杜芬芬1孫曉澤2劉愛華2*

1.河南中醫(yī)藥大學2014級碩士研究生，河南 鄭州 450046；2.河南省中醫(yī)院干部病房，河南 鄭州 450002

目的：觀察升降散對糖尿病大鼠雙歧桿菌、大腸桿菌及IL-6的影響，探討其作用機制。方法：取70只SD雄性大鼠，隨機取10只作為正常對照組，余60只用高脂飼料喂養(yǎng)配合小劑量鏈脲佐菌素誘導建立糖尿病模型，取成模大鼠50只分為模型對照組、拜糖平組、升降散低劑量組、升降散中劑量組和升降散高劑量組，共分6組，每組10只，各組按相應藥物劑量干預6周后，每組取8只大鼠樣本采用Elisa法檢測IL-6、INS，RealtimePCR技術進行細菌定量測定。結果：治療前，模型對照組、拜糖平組、升降散低、中、高三個劑量組較正常對照組空腹血糖(FBG)、IL-6、INS及大腸桿菌數(shù)量均明顯升高，但雙歧桿菌數(shù)量明顯減少；治療前后，正常對照組及模型對照組組內(nèi)各指標無明顯變化。治療后，拜糖平組及升降散低、中、高劑量FBG在2周、4周及6周均逐漸降低，且高于同時間正常對照組，低于同時間模型對照組(P<0.05)；IL-6、INS、大腸桿菌數(shù)量較模型對照組明顯減少，但同時高于正常對照組(P<0.05)；雙歧桿菌數(shù)量較模型對照組、正常對照組明顯增多(P<0.01)。尤以升降散中劑量組增加雙歧桿菌數(shù)量、降低大腸桿菌數(shù)量，抑制炎癥因子、降低胰島素含量效果明顯。結論：升降散能通過增加益生菌數(shù)量，降低致病菌數(shù)量達到調整腸道菌群結構的目的，從而抑制炎癥狀態(tài)，降低血糖。其部分作用機制可能是通過調整腸道菌群、抑制炎癥因子而減輕胰島素抵抗(IR)，增加胰島素利用率實現(xiàn)的。

升降散；糖尿??；雙歧桿菌；大腸桿菌；IL-6 大鼠

隨著大量實驗研究證實腸道菌群與肥胖、糖尿病等代謝性疾病密切相關，腸道菌群已成為代謝性疾病防控的新方向。研究表明，腸道菌群失調可誘發(fā)慢性炎癥進而誘發(fā)胰島素抵抗，從而導致糖尿病發(fā)生，但其機制尚未十分明確。Zhang等[1]運用16Sr DNA高通量測序方法，發(fā)現(xiàn)機體代謝參數(shù)和菌群多樣性兩者間有明顯的關聯(lián)性。此為腸道菌群的結構可調控糖尿病的發(fā)病機制研究提供了證據(jù)?，F(xiàn)有關于腸道菌群失調導致肥胖及2型糖尿病發(fā)生的研究，多數(shù)觀點集中認為腸道乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的減少與糖耐量異常密切相關[2-4]。中藥升降散為臨床調理脾胃氣機的常用治療大法，前期研究證實，其改善糖尿病的癥狀及降低血糖效果頗佳。本研究通過制作DM大鼠模型，觀察升降散對DM大鼠腸道菌群(大腸桿菌、雙歧桿菌)結構變化及相關炎癥因子(IL-6)的影響，探討其部分作用機制，為升清降濁法調整腸道菌群、改善糖尿病炎癥狀態(tài)、改善糖尿病臨床預后提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 動物 SD雄性大鼠70只，SPF級，體重140～160g，由鄭州大學動物實驗中心提供，合格證號：41003100002297。清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度維持在25℃左右，自由攝水。

1.2 藥品與試劑 升降散藥物組成(僵蠶10g，蟬蛻6g，姜黃6g，大黃3g)，藥物購自河南省中醫(yī)院，由三九顆粒制藥提供，顆粒劑總重量為7g；拜糖平/阿卡波糖片(德國拜耳公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X))Fermentas公司)；Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker(TAKARA公司)；引物合成，擎科新業(yè)生物技術有限公司提供；基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號：DP328)；大鼠IL-6 Elisa檢測試劑盒(河南天馳生物有限公司，批號：CK-E30646R)。

1.3 儀器 血糖測定儀：穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀(強生醫(yī)療器械有限公司)；實時熒光定量PCR儀、熒光定量PCR管(ABI)；水平電泳儀、紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司)。

2 方法

2.1 動物造模 70只大鼠普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，隨機取10只作為正常對照組，標準飼料喂養(yǎng)，余60只予高脂飼料喂養(yǎng)至滿8周后，腹腔注射STZ30mg/kg，正常組對照組注射等體積0.1mol/L無菌枸櫞酸緩沖液。72h后測大鼠空腹血糖(禁食8～10h)，空腹血糖≥11.1mmol/L認為糖尿病大鼠造模成功[5]。剔除未成模及死亡大鼠10只。

2.2 分組與給藥 50只成模大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型對照組、拜糖平組、升降散高、中、低劑量組及未造模的正常對照組，共6組，每組10只。拜糖平組每日灌胃70 mg·kg-1；升降散低、中、高劑量組，每日灌胃升降散(0.753，1.506，3.012 g·kg-1)，模型對照組與正常組每日灌胃等量生理鹽水。每3天稱體重1次，根據(jù)體重調整給藥量。藥物干預6周后進行各指標的觀察檢測。

2.3 標本采集與指標檢測

2.3.1 一般情況 治療期間觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、飲水量、尿量、體重等。

2.3.2 生化指標檢測 每周血糖儀測空腹血糖值；治療第6周末，4%的水合氯醛動物麻醉后取血標本，每組取8只樣本進行ELISA法檢測血清IL-6、INS。2.3.3 Realtime PCR技術測定雙歧桿菌、大腸桿菌 每組取8只大鼠新鮮糞便樣本進行檢測,按試劑盒說明書每只大鼠取0.2g新鮮糞便進行基因組DNA提取，以其為模板做PCR擴增，擴增片段引物E.coli (95bp):E.coli F：CATGCCGCGTGTATGAAGAA,E.coli R：CGGGTAACGTCAATGAGCAAA ；Bifidobacterium genus (398bp):Bifi F：CAAGGGCATCTCCGTCA, Bifi R：GCGTTCAGGGTCTTCTCC。在PCR反應體系中，加入SYBR熒光染料，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

3 結果

3.1 一般情況觀察 正常組大鼠精神狀況良好，反應靈敏，飲食及尿量正常，毛色有光澤，體重穩(wěn)定增加。其余各組注射STZ后明顯消瘦，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿、精神萎靡，毛色發(fā)黃無關澤等癥狀。

3.2 各組大鼠不同時間點FBG的比較 治療前后，正常對照組及模型對照組組內(nèi)血糖無明顯變化，升降散低、中、高劑量組及拜糖平組血糖在2周、4周及6周逐漸降低，且均高于同時間正常對照組，低于同時間模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 見表1。

表1 不同時間點各組大鼠血糖值比較

組別FBG/mmol/L0周2周4周6周正常對照組4.8600±0.804434.9000±0.553774.8200±0.549344.8100±0.48408模型對照組21.0200±4.64992a23.5900±4.13372a25.1444±4.10491a26.6444±3.42458a拜糖平組21.0600±4.12962a18.9600±4.63829ab18.0500±1.89927ab17.1100±2.37929abc升降散低劑量組20.1700±4.09092a18.4700±5.11470ab17.2800±4.41281ab15.3000±4.20714abcd升降散中劑量組21.3900±3.76665a17.4800±2.54200ab14.5700±3.05252abc12.0300±2.94469abcd升降散高劑量組21.2200±2.92035a17.4222±4.41214ab15.1111±4.42873abc14.0000±4.8716abcd

注：與同時間點正常對照組比較，aP<0.05；與同時間點模型對照組比較,bP<0.05；治療前后組內(nèi)比較，cP<0.05；升降散低、中、高劑量組與拜糖平組同時間點比較，dP<0.05。

3.3 各組大鼠治療前后IL-6、INS的比較 治療前，模型對照組、拜糖平組及升降散低、中、高劑量組較正常組IL-6、INS水平均明顯升高(P<0.01)；治療前后，正常對照組及模型對照組組內(nèi)IL-6、INS水平無明顯變化；治療后，拜糖平組及升降散低、中、高劑量組IL-6、INS較模型對照組明顯減少，但同時高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中尤以升降散中劑量組IL-6、INS減少明顯。見表2。

表2 各組大鼠治療前后IL-6、INS比較

組別 IL-6/pg/mL INS/mU/L 治療前治療后治療前治療后正常對照組61.8567±7.1836262.1883±8.2433218.9100±2.6423519.1017±2.81536模型對照組 123.4833±10.87966a126.2150±8.69627a36.1600±3.15012a36.3417±3.07838a拜糖平組 124.2533±11.27015a105.4000±4.34205abc36.4600±2.74491a30.7633±1.64692abd升降散低劑量組 124.1483±10.54044a94.3500±5.93904abdef37.2250±3.57589a27.2283±1.39280abdef升降散中劑量組124.9217±9.98448a83.5533±3.67516abdef36.7567±2.71178a23.3433±1.98522abdef升降散高劑量組 123.9450±11.29428a94.0933±3.36112abdef36.6483±3.28817a26.5950±1.57260abdef

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與模型對照組比較,bP<0.01；治療前后組內(nèi)比較，cP<0.05，dP<0.01；升降散低、中、高劑量組與拜糖平組比較，eP<0.01；升降散低、中、高劑量組間比較，fP<0.01。

3.4 雙歧桿菌、大腸桿菌Realtime PCR定量分析 治療前，模型對照組、拜糖平組及升降散低、中、高劑量組較正常組雙歧桿菌明顯降低、大腸桿菌量明顯升高(P<0.01)；治療前后，正常對照組及模型對照組組內(nèi)乳酸桿菌、大腸桿菌量無明顯變化；治療后，模型對照組、拜糖平組及升降散低、中、高劑量組雙歧桿菌量較模型對照組、正常對照組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，大腸桿菌數(shù)量較模型對照組明顯減少，但同時高于正常對照組(P<0.05)；其中尤以升降散中劑量組及拜糖平組升高乳酸桿菌量、降低大腸桿菌量明顯。見表3。

表3 各組大鼠治療前后雙歧桿菌、大腸桿菌的比較

組別 雙歧桿菌/109 大腸桿菌/1010 治療前治療后治療前治療后正常對照組6.3784±0.495506.5229±0.428268.4916±1.43562 8.4624±1.02783模型對照組3.5804±0.46232a 3.4362±0.55294a52.3229±14.08980a 52.8987±12.56822a拜糖平組3.7722±1.27251a 41.9090±14.68011ace50.7852±12.56644a 25.9502±11.61651bce升降散低劑量組3.6440±0.80915a 27.7655±7.42469acefg49.1260±11.08868a 34.6220±13.66367adef升降散中劑量組3.6572±1.22572a 37.5946±3.58789ace50.1154±11.50534a 27.4139±7.44699bce升降散高劑量組3.8067±0.99716a 30.6545±3.99961aceg52.6072±15.17083a 32.9847±12.69392ade

注：與正常對照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與模型對照組比較，cP<0.01，dP<0.05；治療前后組內(nèi)比較，eP<0.01；治療后升降散中劑量組與拜糖平組比較，fP<0.05；升降散低、高劑量組間比較，gP<0.05。

4 討論

腸道菌群做為人體最大微生態(tài)系統(tǒng)，參與并影響著人體物質與能量代謝，目前多項研究表明，腸道菌群與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關，其作用機制可能為[6-9]：首先，腸道細菌可提高能量轉化效率，能將食物中宿主自身不能分解的碳水化合轉化為代謝終產(chǎn)物—短鏈脂肪酸(SC-FAs)，腸道菌群失調可誘發(fā)機體內(nèi)SCFAs水平和構成發(fā)生異常，如此腸道抗炎癥反應能力、腦腸肽激素分泌功能等受到影響，會引起胰島細胞功能受損、胰島素抵抗的發(fā)生；其次，高脂飲食可改變腸道細菌的環(huán)境，腸道菌群失調導致革蘭陰性菌比例的增多、腸壁通透性增加或者腸道菌群移位，通過產(chǎn)生和吸收更多的 LPS，激活胰島的低度慢性炎癥，炎癥可能通過多種途徑導致胰島β細胞結構受損與功能障礙，促進β細胞凋亡。同時，2型糖尿病本身亦會導致腸道菌群紊亂，削弱腸道屏障作用，刺激機體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的IL-6、TNF-α等細胞因子，促使胰島細胞功能進一步受損，如此形成惡性循環(huán)。因此，通過調控腸道菌群的組成或許能為糖尿病的治療提供新策略。

中醫(yī)強調以整體辨證論治，對此單方面的研究甚少，對其病因病機的研究散見于消渴病的文獻中?？偨Y前人對其病因的認識大致為稟賦虛弱、飲食失節(jié)、情致失調及勞欲過度，其病機以陰虛燥熱為主。但疾病是發(fā)展的，病因病機亦是發(fā)展的。劉愛華教授基于多年對DM臨床觀察和總結的基礎上，應用中醫(yī)病因病機學基本理論、繼承脾胃學家李東垣、國醫(yī)大師李振華 “升清降濁”學說，并在查閱相關的文獻資料，運用類比、歸納、演繹多種方法，經(jīng)過較嚴密的邏輯思維過程，創(chuàng)新提出“脾失升清，濁毒下陷”之假說，認為DM的發(fā)病與脾胃氣機升降失常、痰濁瘀毒逆亂有關，而且認為“脾失升清，濁毒下陷”氣機升降是根本。故用升降散，以僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃，共研細末，以黃酒、蜂蜜為引導，蟬蛻、僵蠶升陽中之清陽；片姜黃、制大黃降陰中之濁陰，則雜氣之流毒頓消矣?，F(xiàn)代藥理亦研究證實升降散具有抗炎、抗病毒、抗過敏、解痙，利膽，抗驚厥，調節(jié)免疫等功能[10]。

本實驗結果顯示：治療前，模型對照組、拜糖平組、升降散低、中、高三個劑量組較正常對照組空腹血糖(FBG)、IL-6、INS及大腸桿菌數(shù)量均明顯升高，但雙歧桿菌數(shù)量明顯減少；治療前后，正常對照組及模型對照組組內(nèi)各指標無明顯變化。治療后，拜糖平組及升降散低、中、高劑量FBG在2周、4周及6周均逐漸降低，且高于同時間正常對照組，低于同時間模型對照組(P<0.05)；IL-6、INS、大腸桿菌數(shù)量較模型對照組明顯減少，但同時高于正常對照組(P<0.05)；雙歧桿菌數(shù)量較模型對照組、正常對照組明顯增多(P<0.01)。尤以升降散中劑量組增加雙歧桿菌數(shù)量、降低大腸桿菌數(shù)量，抑制炎癥因子、降低胰島素含量效果明顯。由此推測，升降散能通過增加益生菌數(shù)量，降低致病菌數(shù)量達到調整腸道菌群結構的目的，從而抑制炎癥狀態(tài)，減輕胰島素抵抗，增加胰島素利用率而降低血糖。

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Effects of Shengjiangsan on Bifidobacterium,e.coli and IL - 6 in DM Rats

DU Fenfen1SUN Xiaoze2LIU Aihua2*

1.The graduate student of 2014,Henan university of traditional Chinese medicine, Zhengzhou 4500046,China;2.The vip ward of henan province Chinese medicine hospital,Zhengzhou 450002,China

Objective To observe the effect and the mechanism of Chinese herbal medicine on Bifidobacterium, Escherichia coli and IL-6 in diabetic rats. Methods 70 SD male rats, 10 rats as normal control group, only more than 60 high fat diet combined with low dose of streptozotocin induced diabetic model was established, the model 50 rats were divided into model group, Bai Tangping group, Shengjiangsan low dose group, middle dose group Shengjiangsan Shengjiangsan and high dose groups were divided into 6 groups, 10 rats in each group, each group according to the corresponding dose of drug for 6 weeks, 8 rats from each group of samples was detected by Elisa IL-6, INS Realtime, PCR technology for quantitative determination of bacteria. Results Before treatment, model group and acarbose group, Shengjiangsan low, medium and high dose groups compared with normal control group, fasting blood glucose (FBG), IL-6, INS and the number of Escherichia coli were significantly increased, but the number of bifidobacteria was significantly reduced; before and after the treatment, the normal control group and model control group each index in the group had no obvious change. After treatment, acarbose Shengjiangsan group and low, middle and high dose of FBG in 2 weeks, 4 weeks and 6 weeks were gradually decreased, and higher than that of the normal control group, compared with model control group (P<0.05); IL-6, INS, the number of Escherichia coli than the model control group was significantly reduced, but at the same time higher than the normal control group (P<0.05); the number of bifidobacteria compared with model control group, normal control group increased significantly (P<0.01). Especially in the middle dose group, the number of bifidobacteria increased, the number of E.coli decreased, the inflammatory factors and insulin content were decreased significantly. Conclusion By increasing the number of probiotic bacteria, reducing the number of pathogens to adjust the structure of intestinal flora, thereby inhibiting the inflammatory state, reducing blood glucose. Part of its mechanism may be to reduce insulin resistance (IR) and increase insulin utilization by regulating intestinal flora and inhibiting inflammatory factors.

Shengjiangsan; DM rats; bifidobacterium; e. Coli; IL-6

杜芬芬(1991-)，碩士研究生在讀，研究方向為內(nèi)分泌及其代謝性疾病。E-mail:13598834275@163.com

劉愛華(1957-)，主任醫(yī)師，研究生導師，研究方向為內(nèi)分泌及其代謝性疾病。E-mail:liuaihua666888@sina.com

R

A

1007-8517(2017)08-0035-04

2017-2-20 編輯：陶希睿)