電針抗下肢肌萎縮的頻率組合優(yōu)化及其機(jī)制的初步研究

莊伊洢,黃曉卿,葉笑然,陳玄

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電針抗下肢肌萎縮的頻率組合優(yōu)化及其機(jī)制的初步研究

莊伊洢,黃曉卿,葉笑然,陳玄

(福建省中醫(yī)藥研究院,福州 350003)

目的 篩選電針治療肌萎縮的優(yōu)化電脈沖參數(shù)并探討機(jī)理。方法 SD大鼠40只,制作下肢肌萎縮模型后隨機(jī)分為A組(模型組,不電針)、B組(波寬0.5 ms,頻率2 Hz)、C組(波寬200 ms,頻率2 Hz)、D組(波寬200 ms,頻率1/2/3 Hz)。電針足三里和承山穴,共4個(gè)療程。觀察坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)、腓腸肌濕重比(GW)、腓腸肌纖維橫截面積比(GC)、腓腸肌細(xì)胞直徑比(GD)和腓腸肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化。結(jié)果 與A組比,C組和D組的SFI、GW、GC明顯增大,AI明顯減小(＜0.05);與B組比,C組、D組的AI明顯減小(＜0.05);與C組比,D組的AI明顯減小(＜0.05)。結(jié)論 以波寬200 ms,頻率1/2/3 Hz的電脈沖延緩肌萎縮為優(yōu)化電針參數(shù),其機(jī)制與抑制肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

針刺;電針;波寬;頻率;肌萎縮;細(xì)胞凋亡;大鼠

電針療法是通過(guò)電針儀實(shí)現(xiàn)的,電針儀以電針參數(shù)刺激為主[1-3]。電針參數(shù)中的頻率代表單位時(shí)間內(nèi)輸出的電脈沖個(gè)數(shù)。根據(jù)頻率組成的差異,目前通用各型電針儀的輸出波型有連續(xù)波、疏密波和斷續(xù)波3種[4-5]。連續(xù)波是指頻率為一固定值的脈沖串;疏密波是指兩頻率交替的脈沖串;斷續(xù)波是指固定頻率輸出強(qiáng)度斷續(xù)的脈沖串,“斷”時(shí)的強(qiáng)度為0[6]。這3種波型實(shí)質(zhì)上均屬于規(guī)則性脈沖串。在規(guī)則性頻率電刺激下,穴區(qū)下的神經(jīng)和組織會(huì)發(fā)生適應(yīng),適應(yīng)后組織對(duì)刺激的應(yīng)答力下降[7],容易引起針感的耐受;而頻率輸出值不固定的不規(guī)則頻率刺激較規(guī)則頻率的刺激保持應(yīng)答時(shí)間更長(zhǎng)[8]。

電刺激可以使肌肉節(jié)律性收縮,防止肌萎縮進(jìn)程。肌萎縮不伴隨壞死的細(xì)胞體積減少,細(xì)胞凋亡亦呈現(xiàn)細(xì)胞體積減少,目前電針治療肌萎縮的機(jī)理不明。不規(guī)則的頻率刺激可以抵抗針感耐受,那么,是否也能夠同時(shí)提高電針抗肌萎縮的療效?通過(guò)探討電針抗肌萎縮過(guò)程與細(xì)胞凋亡的變化關(guān)系是否可以闡明電針治療肌萎縮的機(jī)理呢?本文通過(guò)變化的頻率組合電參數(shù)來(lái)開(kāi)展電針抗肌萎縮的療效觀察,并初步探討相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 模型及分組

40只雄性SD大鼠以坐骨神經(jīng)切斷法制作右側(cè)下肢肌萎縮模型[9],左側(cè)下肢假手術(shù)。造模后大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為A組(模型組,不電針)、B組、C組、D組,每組10只。

1.2 電針

正常喂養(yǎng)4星期后,根據(jù)隨證取穴及近部取穴[6]的原則,電針大鼠患側(cè)足三里和承山穴。每日1次,每次30 min,5次1個(gè)療程,療程間隔2 d,共4個(gè)療程。B組以佳健牌CMNS6-1型電針儀為刺激源,波寬0.5 ms,頻率2 Hz;C組、D組以計(jì)算機(jī)控制式電針儀為刺激源,C組波寬200 ms,頻率2 Hz,D組波寬200 ms,頻率1/2/3 Hz(保證輸出頻率平均值為2 Hz),隨機(jī)交替,循環(huán)輸出。由小至大調(diào)節(jié)各組強(qiáng)度,以大鼠下肢肌肉在肉眼下輕微收縮、跳動(dòng),針柄明顯顫動(dòng)為度。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)

用拍照法[10]和墨水法[11]獲取足底圖形來(lái)檢測(cè)坐骨神經(jīng)功能。①足印長(zhǎng)度(print length,PL),足印的最長(zhǎng)距離,即從足跟到足尖。②足趾寬度(toe spread,TS),第1趾到第5趾連線距離。③中間足趾寬度(intermediary toe spread,IT),第2趾到第4趾連線距離,代入Bain公式檢測(cè)SFI。Bain公式為SFI=[109.5(eTS－nTS)/nTS－38.3(ePL－nPL)/nPL＋13.3(eIT－nIT)/nIT]－8.8(前綴e代表病損側(cè),前綴n代表健側(cè))。

SFI的范圍:SFI=0為正常,SFI＜0為不同程度的損傷。

1.3.2 肌濕重(GW)、肌纖維橫截面積(GC)、肌細(xì)胞直徑(GD)及細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)[10]

取各組大鼠雙下肢腓腸肌,稱量肌濕重。石蠟包埋處理后,分別對(duì)同一肌組織的2個(gè)蠟塊沿肌纖維橫、縱切面方向進(jìn)行切片。橫切片HE染色,縱切片TUNEL染色。

每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)高倍視野(×40)在Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)中處理。橫切片每個(gè)視野分別檢測(cè)腓腸肌纖維橫截面積及細(xì)胞直徑,縱切片每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù),AI=陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù);均求平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

GW、GC、GD均以患側(cè)與健側(cè)的測(cè)定值之比表示。各組的SFI、GW、GC、GD和患側(cè)AI均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1中,與A組比,拍照法獲得的C組、D組的SFI明顯增大(＜0.05)(圖1)。表2中,與A組比,C組、D組的GW、GC明顯增大(＜0.05);表2中,與A組比,C組、D組的患側(cè)AI明顯減小(＜0.05);與B組比,C組、D組的患側(cè)AI明顯減小(＜0.05);與C組比,D組患側(cè)AI明顯減小(＜0.05)(圖2、圖3)。

表1 電針足三里穴-承山穴對(duì)下肢肌萎縮大鼠下肢功能的影響 (±s)

表1 電針足三里穴-承山穴對(duì)下肢肌萎縮大鼠下肢功能的影響 (±s)

組別n坐骨神經(jīng)功能指數(shù)SFI 墨水法拍照法 A組10﹣67.48±12.55﹣73.45±9.25 B組10﹣61.64±15.34﹣64.98±9.53 C組10﹣55.52±11.89﹣56.57±9.641) D組10﹣64.52±13.17﹣57.96±9.311)

注:與A組比較1)＜0.05

表2 電針足三里穴-承山穴對(duì)下肢肌萎縮大鼠腓腸肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響 (±s)

表2 電針足三里穴-承山穴對(duì)下肢肌萎縮大鼠腓腸肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響 (±s)

組別n腓腸肌濕重比GW腓腸肌纖維橫截面積比GC腓腸肌細(xì)胞直徑比GD患側(cè)腓腸肌細(xì)胞凋亡指數(shù)AI(%) A組100.278±0.0740.450±0.1390.463±0.18720.21±1.13 B組100.305±0.0830.514±0.1720.527±0.21016.61±1.84 C組100.364±0.0781)0.658±0.2311)0.707±0.19511.27±2.121)2) D組100.374±0.0851)0.638±0.1101)0.710±0.2008.34±1.981)2)3)

注:與A組比較1)＜0.05;與B組比較2)＜0.05;與C組比較3)＜0.05;健側(cè)腓腸肌細(xì)胞凋亡指數(shù)AI(%)≈0

圖1 大鼠電針4個(gè)療程后拍照法獲得的足底圖形(左側(cè)為健側(cè)足底,右側(cè)為患側(cè)足底)

A組(健側(cè)) B組(健側(cè)) C組(健側(cè)) D組(健側(cè)) A組(患側(cè)) B組(患側(cè)) C組(患側(cè)) D組(患側(cè))

A組(健側(cè)) B組(健側(cè)) C組(健側(cè)) D組(健側(cè)) A組(患側(cè)) B組(患側(cè)) C組(患側(cè)) D組(患側(cè))

3 討論

電針療法是延緩肌萎縮及僵硬的有效辦法[12-13]。通用各型電針儀的輸出波寬為0.2～0.5 ms,屬于短脈沖波寬。研究表明[10]電脈沖100 ms和200 ms的寬波較0.5 ms的短波寬防治肌萎縮效果較好。本文選取200 ms寬波作為電針參數(shù)。

已知通用各型電針儀輸出頻率參數(shù)均屬于規(guī)則性頻率,故易發(fā)生適應(yīng)反應(yīng)。針對(duì)骨骼肌萎縮的疾病,不規(guī)則性的頻率刺激可以使萎縮的肌肉產(chǎn)生不同節(jié)律的收縮,達(dá)到延緩萎縮的目的[8,14]。而臨床電針治療中針感常伴有減弱甚至消失[15],這與規(guī)則性頻率促使神經(jīng)發(fā)生適應(yīng),造成局部對(duì)刺激的效應(yīng)降低有關(guān)。有學(xué)者[16]采用多種頻率交替且不規(guī)則的電針刺激身體不同體區(qū)的穴位,結(jié)果顯示不規(guī)則頻率能明顯延長(zhǎng)電針針感的持續(xù)時(shí)間。表1、表2結(jié)果顯示,與C組比,D組的肌組織學(xué)和肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的改善都更顯著,說(shuō)明D組的療效優(yōu)于C組,表明采用200 ms波寬并且脈沖頻率為低頻不規(guī)則的電針刺激療效優(yōu)于200 ms波寬,其原因可能與上述針感的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)相似。

SFI稱為坐骨神經(jīng)功能指數(shù),可以反應(yīng)大鼠下肢的整體功能,是公認(rèn)的評(píng)定坐骨神經(jīng)功能損傷和康復(fù)的指標(biāo),其獲取方法常用拍照法[10]和墨水法[11]。1993年,我國(guó)學(xué)者沈?qū)幗捎媚y(cè)量Bain公式中的SFI,該法在國(guó)內(nèi)被大量引用。具體操作是制作60 cm× 10 cm×10 cm的長(zhǎng)方形通道,內(nèi)底鋪上匹配的白紙,用墨水涂抹大鼠的雙腳掌,令大鼠自行走過(guò)通道,白紙面上會(huì)留下足印,顯示出足底各足趾間距等參數(shù)。但是該法獲得的足底印圖形往往因步行中拖帶造成足底印跡變形(如足印拖長(zhǎng))或因著色墨水不夠而出現(xiàn)足趾或足跡的缺失,這些問(wèn)題使得墨水法測(cè)得的足底印跡數(shù)據(jù)參數(shù)難以完整(圖4)。本文引用了2000年建立的拍照法獲得大鼠的足底圖形,避免了墨水法的不足[17]。表1結(jié)果可見(jiàn),墨水法測(cè)的各組SFI結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;拍照法測(cè)的SFI中,與A組比,B組的SFI無(wú)顯著性差異;C組、D組的SFI明顯增大。說(shuō)明采用200 ms波寬及200 ms波寬并且頻率為低頻不規(guī)則的電針都可以更好地改善下肢神經(jīng)損傷的步行功能。

圖4 墨水法測(cè)SFI的大鼠足印圖(×4)

腓腸肌濕重比(GW)、腓腸肌纖維橫截面積比(GC)、腓腸肌細(xì)胞直徑比(GD)以及細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)是肌肉組織細(xì)胞學(xué)的經(jīng)典指標(biāo),可以反應(yīng)電針治療肌萎縮的療效。表2中可見(jiàn),與A組比,B組GW、GC和GD均無(wú)明顯增大;C組和D組GW、GD明顯增大,說(shuō)明C組和D組療效優(yōu)于B組,表明200 ms波寬及200 ms波寬并且 頻率為低頻不規(guī)則的電針刺激都可以提高肌萎縮的組織學(xué)的療效。各組AI均為患側(cè)測(cè)量值,與A組比,B組AI無(wú)明顯減小;C組和D組AI明顯減小,表明200 ms波寬能抑制肌細(xì)胞凋亡。與C組比,D組AI明顯減小,表明加寬波并加上電針頻率的變化可以更進(jìn)一步提高電針抑制肌細(xì)胞凋亡的效果。表2中A組行自左而右看,GW、GC和GD均小于1,其AI值約20%,這表明肌組織萎縮明顯且伴隨發(fā)生了肌細(xì)胞凋亡。B組、C組、D組AI值均小于17%,即小于A組?？梢?jiàn),電針治療后會(huì)造成肌萎縮組織學(xué)變化的減輕伴隨細(xì)胞凋亡的減輕。表2中各組GW、GD和AI列自上而下看,與B組比,C組GW、GD明顯增大,AI明顯減小,說(shuō)明C組療效好于B組,這表明200 ms波寬的療效優(yōu)于0.5 ms。與C組比,D組GC和AI改善都更顯著,這表明采用200 ms波寬并且頻率為低頻不規(guī)則的電針刺激的療效優(yōu)于200 ms波寬。電針治療的效應(yīng)一方面使肌萎縮組織學(xué)變化的減輕,另一方面使伴隨的細(xì)胞凋亡程度減輕。各組患側(cè)AI結(jié)果表示,寬波電針組的療效優(yōu)于常規(guī)電針,而寬波變頻電針的療效優(yōu)于寬波電針的療效。可見(jiàn),細(xì)胞凋亡參與肌萎縮,也參與電針延緩肌萎縮的過(guò)程。

綜上所述,電脈沖參數(shù)中以寬波且低頻變化頻率的電針參數(shù)具有更好的延緩肌萎縮的效果,并能夠抑制細(xì)胞凋亡,該效果明顯優(yōu)于常規(guī)電針儀的電脈沖。本研究暫不能明確肌萎縮與細(xì)胞凋亡的先后關(guān)系;研究結(jié)果提示有可能通過(guò)阻斷凋亡的信號(hào)通路,達(dá)到延緩肌萎縮的療效。

[1] 莊伊洢,黃曉卿,陳玄,等.電刺激參數(shù)在電針療法中的選用現(xiàn)狀及存在問(wèn)題[J].中醫(yī)臨床研究,2015, 7(23):139-141.

[2] 姚文平,王舒,馬津全,等.不同電針刺激參數(shù)對(duì)腦缺血耐受效應(yīng)的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2010, (9):1806-1808.

[3] 趙天易,席強(qiáng),郭義.電針治療手術(shù)后疼痛刺激參數(shù)的研究現(xiàn)狀和分析[J].上海針灸雜志,2015,34(5): 464-467.

[4] 鹿傳嬌,李響,張洪蕊.不同電針波形治療脊髓損傷神經(jīng)源性膀胱療效觀察[J].上海針灸雜志, 2016,35(12):1442-1444.

[5] 尤陽(yáng).電針不同波形聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練治療腦卒中遲緩期上肢功能障礙的療效觀察[J].中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué),2015,24(2):168-170.

[6] 石學(xué)敏.針灸學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2008: 170-171.

[7] Kebaetse MB, Binder-Macleod SA. Strategies that imp- rove human skeletal muscle performance during repetitive, non-isometric contractions[J]., 2004,448(5):525-532.

[8] Kebaetse MB, Lee SC, Johnston TE,. Strategies that improve paralyzed human quadriceps femoris muscle performance during repetitive, nonisome- tric contractions[J]., 2005,86 (11):2157-2164.

[9] 吳廣智,劉浩宇,崔樹(shù)森.大鼠坐骨神經(jīng)切斷后丙戊酸鈉對(duì)相應(yīng)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元p-S473-Akt表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(11):1980-1982.

[10] 莊伊洢,陳玄,葉笑然,等.寬波電脈沖電針足三里防治下肢肌萎縮研究[J].上海針灸雜志,2016,35(6):742- 744.

[11] 沈?qū)幗?朱家愷.坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在神經(jīng)功能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].中華顯微外科雜志,1993,16(4):284.

[12] 劉夏菲,鮑春齡,東貴榮.五臟俞為主電針治療格林巴利綜合征肌萎縮2例[J].上海針灸雜志,2013,32(12): 1054-1055.

[13] 吳珍元,黃英如,冼華,等.電針對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮及纖維化的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2016,31(2): 177-182.

[14] 張金寶,梁炳生.失神經(jīng)骨骼肌萎縮電刺激治療研究進(jìn)展[J].國(guó)際骨科學(xué)雜志,2009,30(1):45-47.

[15] 陳玄,鄭忠楷,葉笑然,等.計(jì)算機(jī)控制式電針刺激脈沖裝置的研制及其應(yīng)用檢測(cè)[J].中國(guó)醫(yī)療設(shè)備,2011,26 (5):57-60.

[16] Chen X, Ye XR, Ge SY,. Frequency steps and com- positions determine properties of needling sensation during electroacupuncture[J]., 2015,35(2):154-159.

[17]Dijkstra JR, Meek MF, Robinson PH,. Methods to evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the withdrawal reflex[J]., 2000,96(2):89-96.

A Preliminary Study of the Optimal Frequency Combination and Mechanism of Electroacupuncture Treatment for Lower Limb Myatrophy

350003,

Objective To sift out the optimized electric pulse parameters for electroacupuncture treatment for lower limb myatrophy and explore the mechanism of its treatment. Method A model of lower limb myatrophy was made in 40 SD rats. The rats were then randomized to groups A (model group without electroacupuncture), B (a pulse duration of 0.5 ms and a frequency of 2 Hz), C (a pulse duration of 200 ms and a frequency of 2 Hz) and D (a pulse duration of 200 ms and a frequency of 1/2/3 Hz). Points Zusanli(ST36) and Chengshan(BL57) were given electroacupuncture for four courses of treatment. The sciatic function index (SFI), gastrocnemius muscle wet weight ratio (GW), gastrocnemius muscle fiber cross-sectional area ratio (GC), gastrocnemius muscle cell diameter ratio (GD) and gastrocnemius muscle cell apoptosis index (AI) were determined. Result SFI, GW and GC increased significantly and AI decreased significantly in groups C and D compared with group A (＜0.05). AI decreased significantly in groups C and D compared with group B (＜0.05). AI decreased significantly in groups D compared with group C (＜0.05). Conclusion A pulse duration of 200 ms and a frequency of 1/2/3 Hz are the optimized electric pulse parameters for electroacupuncture delaying myatrophy. Its mechanism is related to inhibiting myocyte apoptosis.

Acupuncture; Electroacupuncture; Pulsewidth; Frequency; Myatrophy; Apoptosis; Rats

1005-0957(2017)04-0473-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0473

2016-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373733);福建省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1035-4)

莊伊洢(1988—),女,實(shí)習(xí)研究員,碩士,Email:zyy.roy@hotmail.com

陳玄(1979—),女,助理研究員,碩士,Email:chenxuanfz@aliyun.com