化瘀通絡(luò)灸法對(duì)VD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移變化的影響

張曼,楊駿,王萍,王頻

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化瘀通絡(luò)灸法對(duì)VD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移變化的影響

張曼1,楊駿1,王萍2,王頻1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,合肥 230038)

目的 體外研究觀察化瘀通絡(luò)灸法治療后,大鼠血清的效應(yīng)物質(zhì)干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞增值、遷移變化的過(guò)程,探討化瘀通絡(luò)灸法治療血管性癡呆可能的促血管生成機(jī)制。方法 選取Wistar 雄性成年大鼠,采用四血管阻斷法(4-VO)制備血管性癡呆的大鼠模型,隨機(jī)分為艾灸組、西藥組、模型組,并設(shè)假模型組對(duì)照,共4組。艾灸組取百會(huì)隔附子餅灸,大椎、神庭穴懸灸治療,西藥組以茴拉西坦灌胃,15 d為1個(gè)療程,均為2個(gè)療程。每個(gè)療程結(jié)束后,艾灸組、假模型組、模型組大鼠眼眶取血。制備化瘀通絡(luò)灸法治療后的動(dòng)物血清,干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)培養(yǎng)過(guò)程,另設(shè)平行液組,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液。四甲基唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,細(xì)胞劃痕標(biāo)記法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。結(jié)果 2個(gè)療程治療結(jié)束后,通過(guò)MTT法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,與模型血清組、假模型血清組、平行液組比較,艾灸血清組大鼠血清干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)增殖明顯(＜0.01)。2個(gè)療程治療結(jié)束后,通過(guò)細(xì)胞劃痕法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移,24 h后與模型血清組、假模型血清組、平行液組比較,艾灸血清組大鼠血清干預(yù)HUVEC-12的遷移率升高明顯(＜0.01)。結(jié)論 化瘀通絡(luò)灸法在改善血管性癡呆大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移方面的效果明顯,從而獲取了化瘀通絡(luò)灸法體外促“血管生成”的有力證據(jù)。

癡呆,血管性;內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;血管生成;大鼠;藥餅灸療法;艾條灸;針灸血清

血管性癡呆(vascular dementia,VD)首先由Marie與Binswanger提出,其統(tǒng)一命名是在1992年WHO頒布的《ICD-10精神及行動(dòng)障礙分類》中。VD是由腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙臨床綜合征,主要表現(xiàn)為高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的智能障礙,特別是認(rèn)知功能障礙,包括學(xué)習(xí)、記憶、思維等障礙,也有失語(yǔ)、失用、失認(rèn)等神經(jīng)心理學(xué)癥狀及體征。VD多有卒中史,常表現(xiàn)波動(dòng)性病程或階梯式惡化。Craft等研究發(fā)現(xiàn),VD年發(fā)生率約3.8%,65歲以上人群中,癡呆的總患病率為8%,其中VD占13%～19%。有研究認(rèn)為該病的發(fā)生與丘腦、海馬[1]的缺血性改變有關(guān)[2]。同時(shí)有國(guó)外學(xué)者[3]認(rèn)為,治療缺血性疾病,應(yīng)當(dāng)盡快恢復(fù)缺血區(qū)血供,挽救瀕臨死亡的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元,促血管生成,因此刺激干預(yù)促腦內(nèi)毛細(xì)血管生成將成為新的臨床治療方法。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法,觀察化瘀通絡(luò)灸法對(duì)VD大鼠海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移變化的影響,探討化瘀通絡(luò)灸法治療血管性癡呆的可能的 “促血管生成”機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥物

特制的清艾條,規(guī)格為10 mm×100 mm,由安徽省天長(zhǎng)市壽民灸具廠生產(chǎn);附子粉由安徽省中醫(yī)院中草藥房提供;茴拉西坦膠囊[Aniracetam Capsule,化學(xué)名為1-(4-甲氧基苯?；?-2-吡咯烷酮]0.1 g×30片/瓶,無(wú)錫市凱西藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20090112);水合氯醛由上海國(guó)際集團(tuán)生產(chǎn)(批號(hào)20080807); PRMI-1640培養(yǎng)液由GIBCO公司生產(chǎn)(批號(hào)981972/ 11875-093);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽-二苯基四氮唑溴鹽溶液(MTT)由Sigma公司生產(chǎn)(批號(hào)為M2128,TGL-20M);二甲基亞砜(DMSO)由Sigma公司生產(chǎn)(批號(hào)20110303661/D5879);高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)由長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn);DTT-2大鼠跳臺(tái)儀由北京中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠60只,10月齡,體重(250±50)g,由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,其許可證號(hào)為SCXK(蘇)2008-0004。用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行篩選,保留48只,然后電腦隨機(jī)數(shù)字表法產(chǎn)生8只作為假模型組,其余大鼠復(fù)制血管性癡呆動(dòng)物模型,模型復(fù)制后4 d用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分再次篩選出合格癡呆大鼠24只,隨機(jī)分為艾灸組、西藥組、模型組,每組8只。

1.3 造模方法及模型檢測(cè)

采用改良的Pulsinelli’s四血管阻斷動(dòng)物模型(4-VO)[4],將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg),腹腔注射麻醉后俯臥位固定,然后常規(guī)消毒,首先進(jìn)行背側(cè)頸正中部位切口,暴露出雙側(cè)第一頸椎橫突的翼小孔,用直徑0.5 mm的電凝針插入燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈,使其永久性閉塞。次日將大鼠仰臥位固定,保持其呼吸通暢,然后腹側(cè)頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用無(wú)創(chuàng)性動(dòng)脈夾,可逆性?shī)A閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)10 min,共夾閉3次,每次間隔10 min。術(shù)后手術(shù)部位施以適量青霉素抗感染,然后縫合常規(guī)飼養(yǎng)觀察。假模型組的處理方法與模型組相同,但不阻斷頸總動(dòng)脈(本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠有損傷性的操作,得到了相關(guān)部門(mén)的許可,符合動(dòng)物研究倫理)。采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī),訓(xùn)練及測(cè)試時(shí)將2只大鼠同時(shí)分別置于2個(gè)隔間內(nèi),適應(yīng)3 min后通以40 V的交流電,持續(xù) 5 min,開(kāi)始測(cè)試時(shí)將大鼠放在測(cè)試箱的平臺(tái)上,并開(kāi)始計(jì)時(shí),潛伏期為大 鼠第一次跳到銅柵上所需時(shí)間,錯(cuò)誤次數(shù)計(jì)算是5 min內(nèi)從跳下銅柵再跳回平臺(tái)上的次數(shù),潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)成績(jī),并進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)分。

1.4 治療方法

艾灸組大鼠固定于自制鼠板上,特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部,選取百會(huì)、大椎、神庭穴剃毛點(diǎn)記,百會(huì)穴隔物灸,穴位上放置制備的直徑約15 mm、厚約5 mm附子餅,點(diǎn)燃特制的清艾條,灸火直接灸在附子餅上,穴位皮膚局部出現(xiàn)灼熱潮紅時(shí)立即提起,過(guò)后再壓灸,反復(fù)灸20 min,不出現(xiàn)燙傷;大椎穴、神庭穴于施灸法當(dāng)天脫毛后用清艾條懸灸20 min。每天1次,15次為1個(gè)療程,共治療2個(gè)療程,療程之間休息1 d,常規(guī)飼養(yǎng)。西藥組采用茴拉西坦灌胃治療,灌胃劑量為0.0625 mg/g,和蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液,每天1次,療程與艾灸組同。假模型組和模型組與灸法治療組平行,只作鼠板上固定而不作其他任何處理。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

初次神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在模型復(fù)制后4 d進(jìn)行,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Longa EZ等[5]制定的6級(jí)評(píng)分法改進(jìn),0分為無(wú)功能障礙;1分為不能伸展前肢;2分為向一側(cè)旋轉(zhuǎn);3分為向一側(cè)傾倒;4分為無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制; 5分即死亡。

1.6 血清制備

艾灸血清組把艾灸組大鼠于每個(gè)療程結(jié)束后1 h,進(jìn)行目?jī)?nèi)眥處取血,每只2mL,離心15 min (3000 r/min),取上層的血清,同組血清混合,56℃、30 min滅活,經(jīng)0.22mm微孔濾膜過(guò)濾除菌,﹣20℃保存?zhèn)溆?假模型血清組和模型血清組血清制備方法與艾灸血清組相同;時(shí)間上與之平行。

1.7 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC-12)培養(yǎng)和血清干預(yù)

將凍于液氮中的HUVEC-12細(xì)胞株迅速取出,置于40℃溫水中不停搖晃,使其迅速溶解;待溶解后移至凈化臺(tái)內(nèi),用移液槍移至離心管內(nèi),加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)及5%100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素(雙抗液)的RPMI-1640的培養(yǎng)基將其稀釋5倍,混勻離心1000 r/min,離心5 min,棄上清液,加入完全培養(yǎng)液(PRMI-1640＋10%胎牛血清＋5%雙抗)反復(fù)吹打,使其混勻,移至培養(yǎng)瓶中,加入2 mL培養(yǎng)液,置于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),待其長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)時(shí)以0.25%胰酶溶液消化傳代。每2～3 d更換培養(yǎng)液或傳代1次,取對(duì)數(shù)期(細(xì)胞貼壁,胞漿延展)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)干預(yù)血清不同,將實(shí)驗(yàn)的HUVEC-12細(xì)胞株分為4組,分組及培養(yǎng)液中血清添加如下,艾灸血清組,配制含10%化瘀通絡(luò)灸法大鼠血清的RPMI-1640;模型血清組,配制含10%模型組大鼠血清的RPMI-1640;假模型血清組,配制含10%假造模大鼠血清的RPMI-1640;平行液組,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640。

1.8 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)HUVEC-12的增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC-12,按2×104接種于96孔板,正常培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,換上只含有0.5% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)處理24 h以達(dá)到細(xì)胞同步化;24 h后棄去該細(xì)胞培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)按分組更換各組培養(yǎng)液,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)20 h后,每孔加入20mL MTT溶液(5 mg/mL),于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸棄孔內(nèi)上清液,后加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,)溶液150mL,震蕩10 min,在490 nm波長(zhǎng)下用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值(OD)并記錄結(jié)果。

1.9 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)HUVEC-12的遷移

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC-12,以6×104接種于24孔板,每孔400mL。孔板底部預(yù)先畫(huà)好標(biāo)記線,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,待細(xì)胞間形成較緊密連接的單層后,用無(wú)菌200mL,槍頭在培養(yǎng)孔底部中央垂直劃一道痕跡(顯微鏡下可同時(shí)看到創(chuàng)面兩側(cè)),然后吸出原培養(yǎng)液后用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕吹打劃痕附近,倒除培養(yǎng)液,反復(fù)3次,將劃掉的細(xì)胞沖洗干凈。然后按分組各孔加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液400mL,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。此時(shí)在倒置顯微鏡下攝像(×200),記為0時(shí),然后利用顯微尺度選擇5個(gè)不同視野,分別觀察0 h、6 h、24 h后的劃痕創(chuàng)面愈合情況。細(xì)胞遷移能力以遷移率表示,細(xì)胞遷移率(%)=[(原劃痕寬度－現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度]×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析,組間均數(shù)的兩兩比較采用-檢驗(yàn)。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后4 d跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

造模后4 d跳臺(tái)儀檢測(cè)大鼠的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)并進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。造模組與假造模組的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較均有顯著性差異(＜0.01),表明VD大鼠模型制作成功。

表1 造模后4 d潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分檢測(cè)結(jié)果 (±s)

表1 造模后4 d潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分檢測(cè)結(jié)果 (±s)

組別n潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)(次)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(分) 造模組2442.62±9.581)5.4±1.231)2.45±0.761) 假模型組8226.00±43.561.02±0.43-

注:與假模型組比較1)＜0.01

2.2 艾灸效應(yīng)血清對(duì)HUVEC-12細(xì)胞增殖影響

經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細(xì)胞增殖比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),詳見(jiàn)表2。表明經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,在增加細(xì)胞增殖水平方面,艾灸組有非常顯著的效果。由圖1可見(jiàn),艾灸血清組培養(yǎng)的HUVEC增殖能力最強(qiáng)。

表2 細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果比較 (±s)

表2 細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果比較 (±s)

組別n光密度值(OD) 艾灸血清組60.191±0.0241)3)4) 假模型血清組60.159±0.0062) 模型血清組60.170±0.0065) 平行液組60.161±0.0172)

注:與模型血清組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與平行液組比較3)＜0.01;與假模型血清組比較4)＜0.01,5)＜0.05

注:1為艾灸血清組,2為假模型血清組,3為模型血清組,4為平行液組

2.3 艾灸效應(yīng)血清對(duì)HUVEC-12細(xì)胞遷移影響

經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,4組間的細(xì)胞遷移的檢測(cè)結(jié)果有差異(＜0.05,＜0.01),見(jiàn)表3。0 h各組遷移率沒(méi)有明顯差異(＞0.05);6 h后艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細(xì)胞遷移比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);24 h后艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細(xì)胞遷移比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。表明經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,在加快細(xì)胞遷移水平方面,艾灸血清組有非常顯著的效果。

倒置顯微鏡(×200)下攝像圖片(5～16)顯示艾灸動(dòng)物血清培養(yǎng)的HUVEC遷移能力最強(qiáng)。詳見(jiàn)圖2。

表3 各組細(xì)胞遷移的檢測(cè)結(jié)果 (±s)

表3 各組細(xì)胞遷移的檢測(cè)結(jié)果 (±s)

組別n0 h遷移率(%)6 h后遷移率(%)24 h后遷移率(%) 艾灸血清組6049.723±2.3182)4)6)88.689±3.2191)3)5) 假模型血清組6037.950±1.72)52.655±1.6132) 模型血清組6048.443±1.566)61.929±2.2346) 平行液組6038.29±1.4092)55.355±1.6742)

注:與模型血清組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與平行液組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與假模型血清組比較5)＜0.01,6)＜0.05

注:5～7為艾灸血清組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn);8～10為假模型血清組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn);11～13為模型血清組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn);14～16為平行液組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn)

3 討論

《靈樞·海論》提出“腦為髓之?！韬２蛔?則腦轉(zhuǎn)耳鳴,脛酸眩冒……”清代王清任亦指出年老而記性較差者,其腦髓逐漸空虛。《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》:“……邪入于腑,即不識(shí)人?！壁w冰等[6]總結(jié)“謝海州治療老年性癡呆癥經(jīng)驗(yàn)”時(shí)指出,血管性癡呆癥的病因、病機(jī)比較復(fù)雜,由于年老體弱,飲食失節(jié),情志失調(diào),歷經(jīng)艱辛,勞逸不當(dāng),導(dǎo)致臟腑功能衰退,氣血不足,尤其是腎經(jīng)虧損,髓海失養(yǎng),腦髓失充,神明失司,代謝失調(diào),而致風(fēng)、火、痰、瘀蒙蔽心竅,上犯與腦,清竅失靈,神明失用,故其病在腦,其本在腎。《任繼學(xué)經(jīng)驗(yàn)集》中關(guān)于血管性癡呆這樣說(shuō):臨證當(dāng)抓住虛實(shí)綱領(lǐng),以“大實(shí)有羸狀,至虛有盛候”為辨證要點(diǎn)。認(rèn)為實(shí)者,以痰、瘀、毒、涎為主,而虛者則以精、髓、神、氣為要。

我們課題組前期在取得了艾灸治療VD豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究成果的基礎(chǔ)上[7-12],發(fā)現(xiàn)以頭部穴位組合為主的艾條壓灸治療VD具有“化瘀通絡(luò)”之功效,我們臨床運(yùn)用化瘀通絡(luò)灸法治療VD取得了很好的療效,并在前期研究中發(fā)現(xiàn)針刺涌泉、中沖穴可顯著改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī),縮短P300的潛伏期,升高波幅[13],為該實(shí)驗(yàn)的研究做了準(zhǔn)備。

本實(shí)驗(yàn)采用四血管閉塞法建立VD模型,大鼠腦組織可產(chǎn)生明顯的病理改變,皮層、丘腦、尾核、海馬等記憶區(qū)嚴(yán)重受損使Papez環(huán)路中段,但死亡率低,無(wú)明顯肢體運(yùn)動(dòng)障礙[14]。此外,本研究培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)單一,呈棱形或多角形,核橢圓居中,互不重疊。在低倍鏡下呈鵝卵石樣排列,易于與平滑肌細(xì)胞、纖維細(xì)胞區(qū)別;本研究中劃痕標(biāo)記法,成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、不需要特殊儀器設(shè)備,并且可以適用于各種培養(yǎng)細(xì)胞。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC-12)是研究血管生成的一種直觀有效方法。艾灸治療VD在研究中[15]療效已被驗(yàn)證[16-18],通過(guò)艾灸治療后的動(dòng)物血清干預(yù)HUVEC-12的體外培養(yǎng)研究,可以直觀地分析艾灸后血清的效應(yīng)物質(zhì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移變化的影響[19]。

血管生成,即通過(guò)細(xì)胞增殖、出芽的方式形成新的血管網(wǎng)的過(guò)程[20],是建立側(cè)支循環(huán)的一種主要方式,其過(guò)程包括內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖、遷移、中空的管腔形成以及已有的血管上萌發(fā)新血管等。細(xì)胞活化、增殖最重要的因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),促血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管型形成最重要的因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)[21],本課題組在前期研究中,已經(jīng)證實(shí)了化瘀通絡(luò)灸法可以有效提高VD大鼠海馬以及皮層 VEGF及其受體Flt-1、Flk-1MRNA,bFGF、BFGF-r的表達(dá),對(duì)改善VD大鼠的癥狀有顯著的效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)艾灸治療后動(dòng)物血清干預(yù)HUVEC-12的體外培養(yǎng)研究,直觀地分析艾灸后血清的效應(yīng)物質(zhì)對(duì)HUVEC-12活化、增殖、遷移、中空的管腔形成的影響,進(jìn)一步說(shuō)明血管生成對(duì)于治療VD的積極作用。模型血清組大鼠自身誘導(dǎo)促新生血管的生長(zhǎng)因子表達(dá)較模型血清組增多,但是結(jié)合其他指標(biāo),癥狀沒(méi)有明顯好轉(zhuǎn)。又進(jìn)一步表明了化瘀通絡(luò)灸對(duì)促血管生成的優(yōu)勢(shì)所在。

老年期是經(jīng)驗(yàn)豐富的階段,一生中極為寶貴的時(shí)期,VD作為老年期癡呆第二位重要的疾病,正確的診斷和有效的治療至關(guān)重要。研究化瘀通絡(luò)灸法治療VD的機(jī)理,從中得到預(yù)防和治療的方法,具有重大的實(shí)際意義。

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The Effect of Stasis-eliminating and Meridian-unblocking Moxibustion on Vascular Endothelial Cell Proliferation and Migration in VD Rats

1,1,2,1.

1.230038,; 2.230038,

Objective To investigate the in vitro intervening effect of rat serum effector substances on vascular endothelial cell proliferation and migration after stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion and explore the possible proangiogenic mechanism of stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion treatment for vascular dementia. Method Male adult Wistar rats were used. A rat model of vascular dementia was made by four-vessel occlusion (4-VO). The rats were randomized to moxibustion, Western medication and model groups. A sham operation group was established as a control. There was a total of four groups. The moxibustion group received aconite cake moxibustion on point Baihui(GV20) and suspended moxibustion on points Dazhui(GV14) and Shenting(GV24) and the Western medication, an oral gavage of aniracetam tablets. Treatment was given 15 days as one course for a total of two courses. Blood was taken from the Orbital cavity in the moxibustion, sham operation and model groups after each course of treatment. After stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion, animal serum was prepared to intervene in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) culture. Another parallel liquid group was set up. RPMI-1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) was prepared. Endothelial cell proliferation was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. Endothelial cell migration was examined by cell scratch labeling. Result After two courses of treatment, the examination of endothelial cell proliferation by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay showed that rat serum intervened significantly in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) proliferation in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (＜0.01). At 24 hrs after two courses of treatment, the examination of endothelial cell migration by cell scratch labeling showed that rat serum intervention significantly increased the HUVEC-12 migration rate in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (＜0.01). Conclusion Stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion has a marked improving effect on vascular endothelial cell proliferation and migration in vascular dementia rats, which provides strong evidence for its in vitro proangiogenic effect.

Dementia, vascular; Endothelial cell; Cell proliferation; Cell migration; Angiogenesis; Rats; Medicinal cake-partitioned moxibustion; Moxa stick moxibustion; Acupuncture-moxibustion serum

1005-0957(2017)04-0467-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0467

2016-08-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473785)

張曼(1988—),2014級(jí)碩士生,Email:84198813@qq.com

楊駿(1958—),男,教授,研究方向?yàn)獒樉牡呐R床作用機(jī)理研究,Email:yangjunacup@126.com