• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    化瘀通絡(luò)灸法對(duì)VD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移變化的影響

    2017-05-02 06:52:56張曼楊駿王萍王頻
    上海針灸雜志 2017年4期
    關(guān)鍵詞:灸法血管性艾灸

    張曼,楊駿,王萍,王頻

    ?

    化瘀通絡(luò)灸法對(duì)VD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移變化的影響

    張曼1,楊駿1,王萍2,王頻1

    (1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,合肥 230038)

    目的 體外研究觀察化瘀通絡(luò)灸法治療后,大鼠血清的效應(yīng)物質(zhì)干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞增值、遷移變化的過(guò)程,探討化瘀通絡(luò)灸法治療血管性癡呆可能的促血管生成機(jī)制。方法 選取Wistar 雄性成年大鼠,采用四血管阻斷法(4-VO)制備血管性癡呆的大鼠模型,隨機(jī)分為艾灸組、西藥組、模型組,并設(shè)假模型組對(duì)照,共4組。艾灸組取百會(huì)隔附子餅灸,大椎、神庭穴懸灸治療,西藥組以茴拉西坦灌胃,15 d為1個(gè)療程,均為2個(gè)療程。每個(gè)療程結(jié)束后,艾灸組、假模型組、模型組大鼠眼眶取血。制備化瘀通絡(luò)灸法治療后的動(dòng)物血清,干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)培養(yǎng)過(guò)程,另設(shè)平行液組,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液。四甲基唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,細(xì)胞劃痕標(biāo)記法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。結(jié)果 2個(gè)療程治療結(jié)束后,通過(guò)MTT法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,與模型血清組、假模型血清組、平行液組比較,艾灸血清組大鼠血清干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)增殖明顯(<0.01)。2個(gè)療程治療結(jié)束后,通過(guò)細(xì)胞劃痕法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移,24 h后與模型血清組、假模型血清組、平行液組比較,艾灸血清組大鼠血清干預(yù)HUVEC-12的遷移率升高明顯(<0.01)。結(jié)論 化瘀通絡(luò)灸法在改善血管性癡呆大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移方面的效果明顯,從而獲取了化瘀通絡(luò)灸法體外促“血管生成”的有力證據(jù)。

    癡呆,血管性;內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;血管生成;大鼠;藥餅灸療法;艾條灸;針灸血清

    血管性癡呆(vascular dementia,VD)首先由Marie與Binswanger提出,其統(tǒng)一命名是在1992年WHO頒布的《ICD-10精神及行動(dòng)障礙分類》中。VD是由腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙臨床綜合征,主要表現(xiàn)為高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的智能障礙,特別是認(rèn)知功能障礙,包括學(xué)習(xí)、記憶、思維等障礙,也有失語(yǔ)、失用、失認(rèn)等神經(jīng)心理學(xué)癥狀及體征。VD多有卒中史,常表現(xiàn)波動(dòng)性病程或階梯式惡化。Craft等研究發(fā)現(xiàn),VD年發(fā)生率約3.8%,65歲以上人群中,癡呆的總患病率為8%,其中VD占13%~19%。有研究認(rèn)為該病的發(fā)生與丘腦、海馬[1]的缺血性改變有關(guān)[2]。同時(shí)有國(guó)外學(xué)者[3]認(rèn)為,治療缺血性疾病,應(yīng)當(dāng)盡快恢復(fù)缺血區(qū)血供,挽救瀕臨死亡的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元,促血管生成,因此刺激干預(yù)促腦內(nèi)毛細(xì)血管生成將成為新的臨床治療方法。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法,觀察化瘀通絡(luò)灸法對(duì)VD大鼠海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移變化的影響,探討化瘀通絡(luò)灸法治療血管性癡呆的可能的 “促血管生成”機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與藥物

    特制的清艾條,規(guī)格為10 mm×100 mm,由安徽省天長(zhǎng)市壽民灸具廠生產(chǎn);附子粉由安徽省中醫(yī)院中草藥房提供;茴拉西坦膠囊[Aniracetam Capsule,化學(xué)名為1-(4-甲氧基苯?;?-2-吡咯烷酮]0.1 g×30片/瓶,無(wú)錫市凱西藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20090112);水合氯醛由上海國(guó)際集團(tuán)生產(chǎn)(批號(hào)20080807); PRMI-1640培養(yǎng)液由GIBCO公司生產(chǎn)(批號(hào)981972/ 11875-093);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽-二苯基四氮唑溴鹽溶液(MTT)由Sigma公司生產(chǎn)(批號(hào)為M2128,TGL-20M);二甲基亞砜(DMSO)由Sigma公司生產(chǎn)(批號(hào)20110303661/D5879);高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)由長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn);DTT-2大鼠跳臺(tái)儀由北京中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院提供。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠60只,10月齡,體重(250±50)g,由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,其許可證號(hào)為SCXK(蘇)2008-0004。用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行篩選,保留48只,然后電腦隨機(jī)數(shù)字表法產(chǎn)生8只作為假模型組,其余大鼠復(fù)制血管性癡呆動(dòng)物模型,模型復(fù)制后4 d用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分再次篩選出合格癡呆大鼠24只,隨機(jī)分為艾灸組、西藥組、模型組,每組8只。

    1.3 造模方法及模型檢測(cè)

    采用改良的Pulsinelli’s四血管阻斷動(dòng)物模型(4-VO)[4],將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg),腹腔注射麻醉后俯臥位固定,然后常規(guī)消毒,首先進(jìn)行背側(cè)頸正中部位切口,暴露出雙側(cè)第一頸椎橫突的翼小孔,用直徑0.5 mm的電凝針插入燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈,使其永久性閉塞。次日將大鼠仰臥位固定,保持其呼吸通暢,然后腹側(cè)頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用無(wú)創(chuàng)性動(dòng)脈夾,可逆性?shī)A閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)10 min,共夾閉3次,每次間隔10 min。術(shù)后手術(shù)部位施以適量青霉素抗感染,然后縫合常規(guī)飼養(yǎng)觀察。假模型組的處理方法與模型組相同,但不阻斷頸總動(dòng)脈(本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠有損傷性的操作,得到了相關(guān)部門(mén)的許可,符合動(dòng)物研究倫理)。采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī),訓(xùn)練及測(cè)試時(shí)將2只大鼠同時(shí)分別置于2個(gè)隔間內(nèi),適應(yīng)3 min后通以40 V的交流電,持續(xù) 5 min,開(kāi)始測(cè)試時(shí)將大鼠放在測(cè)試箱的平臺(tái)上,并開(kāi)始計(jì)時(shí),潛伏期為大 鼠第一次跳到銅柵上所需時(shí)間,錯(cuò)誤次數(shù)計(jì)算是5 min內(nèi)從跳下銅柵再跳回平臺(tái)上的次數(shù),潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)成績(jī),并進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)分。

    1.4 治療方法

    艾灸組大鼠固定于自制鼠板上,特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部,選取百會(huì)、大椎、神庭穴剃毛點(diǎn)記,百會(huì)穴隔物灸,穴位上放置制備的直徑約15 mm、厚約5 mm附子餅,點(diǎn)燃特制的清艾條,灸火直接灸在附子餅上,穴位皮膚局部出現(xiàn)灼熱潮紅時(shí)立即提起,過(guò)后再壓灸,反復(fù)灸20 min,不出現(xiàn)燙傷;大椎穴、神庭穴于施灸法當(dāng)天脫毛后用清艾條懸灸20 min。每天1次,15次為1個(gè)療程,共治療2個(gè)療程,療程之間休息1 d,常規(guī)飼養(yǎng)。西藥組采用茴拉西坦灌胃治療,灌胃劑量為0.0625 mg/g,和蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液,每天1次,療程與艾灸組同。假模型組和模型組與灸法治療組平行,只作鼠板上固定而不作其他任何處理。

    1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

    初次神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在模型復(fù)制后4 d進(jìn)行,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Longa EZ等[5]制定的6級(jí)評(píng)分法改進(jìn),0分為無(wú)功能障礙;1分為不能伸展前肢;2分為向一側(cè)旋轉(zhuǎn);3分為向一側(cè)傾倒;4分為無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制; 5分即死亡。

    1.6 血清制備

    艾灸血清組把艾灸組大鼠于每個(gè)療程結(jié)束后1 h,進(jìn)行目?jī)?nèi)眥處取血,每只2mL,離心15 min (3000 r/min),取上層的血清,同組血清混合,56℃、30 min滅活,經(jīng)0.22mm微孔濾膜過(guò)濾除菌,﹣20℃保存?zhèn)溆?假模型血清組和模型血清組血清制備方法與艾灸血清組相同;時(shí)間上與之平行。

    1.7 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC-12)培養(yǎng)和血清干預(yù)

    將凍于液氮中的HUVEC-12細(xì)胞株迅速取出,置于40℃溫水中不停搖晃,使其迅速溶解;待溶解后移至凈化臺(tái)內(nèi),用移液槍移至離心管內(nèi),加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)及5%100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素(雙抗液)的RPMI-1640的培養(yǎng)基將其稀釋5倍,混勻離心1000 r/min,離心5 min,棄上清液,加入完全培養(yǎng)液(PRMI-1640+10%胎牛血清+5%雙抗)反復(fù)吹打,使其混勻,移至培養(yǎng)瓶中,加入2 mL培養(yǎng)液,置于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),待其長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)時(shí)以0.25%胰酶溶液消化傳代。每2~3 d更換培養(yǎng)液或傳代1次,取對(duì)數(shù)期(細(xì)胞貼壁,胞漿延展)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)干預(yù)血清不同,將實(shí)驗(yàn)的HUVEC-12細(xì)胞株分為4組,分組及培養(yǎng)液中血清添加如下,艾灸血清組,配制含10%化瘀通絡(luò)灸法大鼠血清的RPMI-1640;模型血清組,配制含10%模型組大鼠血清的RPMI-1640;假模型血清組,配制含10%假造模大鼠血清的RPMI-1640;平行液組,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640。

    1.8 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)HUVEC-12的增殖

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC-12,按2×104接種于96孔板,正常培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,換上只含有0.5% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)處理24 h以達(dá)到細(xì)胞同步化;24 h后棄去該細(xì)胞培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)按分組更換各組培養(yǎng)液,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)20 h后,每孔加入20mL MTT溶液(5 mg/mL),于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸棄孔內(nèi)上清液,后加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,)溶液150mL,震蕩10 min,在490 nm波長(zhǎng)下用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值(OD)并記錄結(jié)果。

    1.9 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)HUVEC-12的遷移

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC-12,以6×104接種于24孔板,每孔400mL。孔板底部預(yù)先畫(huà)好標(biāo)記線,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,待細(xì)胞間形成較緊密連接的單層后,用無(wú)菌200mL,槍頭在培養(yǎng)孔底部中央垂直劃一道痕跡(顯微鏡下可同時(shí)看到創(chuàng)面兩側(cè)),然后吸出原培養(yǎng)液后用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕吹打劃痕附近,倒除培養(yǎng)液,反復(fù)3次,將劃掉的細(xì)胞沖洗干凈。然后按分組各孔加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液400mL,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。此時(shí)在倒置顯微鏡下攝像(×200),記為0時(shí),然后利用顯微尺度選擇5個(gè)不同視野,分別觀察0 h、6 h、24 h后的劃痕創(chuàng)面愈合情況。細(xì)胞遷移能力以遷移率表示,細(xì)胞遷移率(%)=[(原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度]×100%。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析,組間均數(shù)的兩兩比較采用-檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 造模后4 d跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

    造模后4 d跳臺(tái)儀檢測(cè)大鼠的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)并進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。造模組與假造模組的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較均有顯著性差異(<0.01),表明VD大鼠模型制作成功。

    表1 造模后4 d潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分檢測(cè)結(jié)果 (±s)

    表1 造模后4 d潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分檢測(cè)結(jié)果 (±s)

    組別n潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)(次)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(分) 造模組2442.62±9.581)5.4±1.231)2.45±0.761) 假模型組8226.00±43.561.02±0.43-

    注:與假模型組比較1)<0.01

    2.2 艾灸效應(yīng)血清對(duì)HUVEC-12細(xì)胞增殖影響

    經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細(xì)胞增殖比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01),詳見(jiàn)表2。表明經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,在增加細(xì)胞增殖水平方面,艾灸組有非常顯著的效果。由圖1可見(jiàn),艾灸血清組培養(yǎng)的HUVEC增殖能力最強(qiáng)。

    表2 細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果比較 (±s)

    表2 細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果比較 (±s)

    組別n光密度值(OD) 艾灸血清組60.191±0.0241)3)4) 假模型血清組60.159±0.0062) 模型血清組60.170±0.0065) 平行液組60.161±0.0172)

    注:與模型血清組比較1)<0.01,2)<0.05;與平行液組比較3)<0.01;與假模型血清組比較4)<0.01,5)<0.05

    注:1為艾灸血清組,2為假模型血清組,3為模型血清組,4為平行液組

    2.3 艾灸效應(yīng)血清對(duì)HUVEC-12細(xì)胞遷移影響

    經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,4組間的細(xì)胞遷移的檢測(cè)結(jié)果有差異(<0.05,<0.01),見(jiàn)表3。0 h各組遷移率沒(méi)有明顯差異(>0.05);6 h后艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細(xì)胞遷移比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05);24 h后艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細(xì)胞遷移比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01)。表明經(jīng)過(guò)2個(gè)療程治療后,在加快細(xì)胞遷移水平方面,艾灸血清組有非常顯著的效果。

    倒置顯微鏡(×200)下攝像圖片(5~16)顯示艾灸動(dòng)物血清培養(yǎng)的HUVEC遷移能力最強(qiáng)。詳見(jiàn)圖2。

    表3 各組細(xì)胞遷移的檢測(cè)結(jié)果 (±s)

    表3 各組細(xì)胞遷移的檢測(cè)結(jié)果 (±s)

    組別n0 h遷移率(%)6 h后遷移率(%)24 h后遷移率(%) 艾灸血清組6049.723±2.3182)4)6)88.689±3.2191)3)5) 假模型血清組6037.950±1.72)52.655±1.6132) 模型血清組6048.443±1.566)61.929±2.2346) 平行液組6038.29±1.4092)55.355±1.6742)

    注:與模型血清組比較1)<0.01,2)<0.05;與平行液組比較3)<0.01,4)<0.05;與假模型血清組比較5)<0.01,6)<0.05

    注:5~7為艾灸血清組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn);8~10為假模型血清組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn);11~13為模型血清組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn);14~16為平行液組0 h、6 h后、24 h后干預(yù)培養(yǎng)的HUVEC遷移表現(xiàn)

    3 討論

    《靈樞·海論》提出“腦為髓之?!韬2蛔?則腦轉(zhuǎn)耳鳴,脛酸眩冒……”清代王清任亦指出年老而記性較差者,其腦髓逐漸空虛。《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》:“……邪入于腑,即不識(shí)人?!壁w冰等[6]總結(jié)“謝海州治療老年性癡呆癥經(jīng)驗(yàn)”時(shí)指出,血管性癡呆癥的病因、病機(jī)比較復(fù)雜,由于年老體弱,飲食失節(jié),情志失調(diào),歷經(jīng)艱辛,勞逸不當(dāng),導(dǎo)致臟腑功能衰退,氣血不足,尤其是腎經(jīng)虧損,髓海失養(yǎng),腦髓失充,神明失司,代謝失調(diào),而致風(fēng)、火、痰、瘀蒙蔽心竅,上犯與腦,清竅失靈,神明失用,故其病在腦,其本在腎。《任繼學(xué)經(jīng)驗(yàn)集》中關(guān)于血管性癡呆這樣說(shuō):臨證當(dāng)抓住虛實(shí)綱領(lǐng),以“大實(shí)有羸狀,至虛有盛候”為辨證要點(diǎn)。認(rèn)為實(shí)者,以痰、瘀、毒、涎為主,而虛者則以精、髓、神、氣為要。

    我們課題組前期在取得了艾灸治療VD豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究成果的基礎(chǔ)上[7-12],發(fā)現(xiàn)以頭部穴位組合為主的艾條壓灸治療VD具有“化瘀通絡(luò)”之功效,我們臨床運(yùn)用化瘀通絡(luò)灸法治療VD取得了很好的療效,并在前期研究中發(fā)現(xiàn)針刺涌泉、中沖穴可顯著改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī),縮短P300的潛伏期,升高波幅[13],為該實(shí)驗(yàn)的研究做了準(zhǔn)備。

    本實(shí)驗(yàn)采用四血管閉塞法建立VD模型,大鼠腦組織可產(chǎn)生明顯的病理改變,皮層、丘腦、尾核、海馬等記憶區(qū)嚴(yán)重受損使Papez環(huán)路中段,但死亡率低,無(wú)明顯肢體運(yùn)動(dòng)障礙[14]。此外,本研究培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)單一,呈棱形或多角形,核橢圓居中,互不重疊。在低倍鏡下呈鵝卵石樣排列,易于與平滑肌細(xì)胞、纖維細(xì)胞區(qū)別;本研究中劃痕標(biāo)記法,成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、不需要特殊儀器設(shè)備,并且可以適用于各種培養(yǎng)細(xì)胞。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC-12)是研究血管生成的一種直觀有效方法。艾灸治療VD在研究中[15]療效已被驗(yàn)證[16-18],通過(guò)艾灸治療后的動(dòng)物血清干預(yù)HUVEC-12的體外培養(yǎng)研究,可以直觀地分析艾灸后血清的效應(yīng)物質(zhì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移變化的影響[19]。

    血管生成,即通過(guò)細(xì)胞增殖、出芽的方式形成新的血管網(wǎng)的過(guò)程[20],是建立側(cè)支循環(huán)的一種主要方式,其過(guò)程包括內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖、遷移、中空的管腔形成以及已有的血管上萌發(fā)新血管等。細(xì)胞活化、增殖最重要的因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),促血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管型形成最重要的因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)[21],本課題組在前期研究中,已經(jīng)證實(shí)了化瘀通絡(luò)灸法可以有效提高VD大鼠海馬以及皮層 VEGF及其受體Flt-1、Flk-1MRNA,bFGF、BFGF-r的表達(dá),對(duì)改善VD大鼠的癥狀有顯著的效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)艾灸治療后動(dòng)物血清干預(yù)HUVEC-12的體外培養(yǎng)研究,直觀地分析艾灸后血清的效應(yīng)物質(zhì)對(duì)HUVEC-12活化、增殖、遷移、中空的管腔形成的影響,進(jìn)一步說(shuō)明血管生成對(duì)于治療VD的積極作用。模型血清組大鼠自身誘導(dǎo)促新生血管的生長(zhǎng)因子表達(dá)較模型血清組增多,但是結(jié)合其他指標(biāo),癥狀沒(méi)有明顯好轉(zhuǎn)。又進(jìn)一步表明了化瘀通絡(luò)灸對(duì)促血管生成的優(yōu)勢(shì)所在。

    老年期是經(jīng)驗(yàn)豐富的階段,一生中極為寶貴的時(shí)期,VD作為老年期癡呆第二位重要的疾病,正確的診斷和有效的治療至關(guān)重要。研究化瘀通絡(luò)灸法治療VD的機(jī)理,從中得到預(yù)防和治療的方法,具有重大的實(shí)際意義。

    [1] 黃新武,李國(guó)春,熊玉霞,等.大鼠血管性癡呆模型動(dòng)物中海馬神經(jīng)元凋亡和蛋白表達(dá)的研究[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2011,27(3):331-334.

    [2] Leal G, Afonso PM, Salazar IL,. Regulation of hipp- ocampal synaptic plasticity by BDNF[J]., 2015, 16(21):82-101.

    [3] Román GC. Facts, myths, and controversies in vascular dementia[J].,2004,226(1-2):49-52.

    [4] Schmidt-Kastner R, Paschen W, Ophoff BG,. A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats[J].,1989,20(7):938-946.

    [5] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,. Reversi- ble middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]., 1989,20(1):84-91.

    [6] 趙冰,張華東,張晨,等.謝海洲治療老年性癡呆經(jīng)驗(yàn)[J].中醫(yī)雜志,2006,47(4):258-259.

    [7] 朱才豐,楊駿,楊坤,等.通督化瘀灸法治療血管性認(rèn)知障礙臨床觀察[J].上海針灸雜志,2013,32(4):242-244.

    [8] 湯敬一,李飛.近5年針灸治療血管性癡呆的實(shí)驗(yàn)及臨床研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,29(1):51-53.

    [9] 何道有,王頻,李前輝.針灸治療血管性癡呆實(shí)驗(yàn)研究 [J].中醫(yī)藥臨床雜志,2015,27(7):926-928.

    [10] 王明潔,張慶萍,吳生兵,等.化瘀通絡(luò)灸法對(duì)皮質(zhì)下血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及額葉皮質(zhì)下組織病理變化的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2015,27(3):383-385,451.

    [11] 王明潔,張慶萍,吳生兵,等.化瘀通絡(luò)灸法對(duì)皮質(zhì)下血管性癡呆額葉超微結(jié)構(gòu)的影響[J].針灸臨床雜志,2015,31(11):59-61.

    [12] 王頻,楊駿,張慶萍,等.艾灸頭部組穴對(duì)VD大鼠腦內(nèi)VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2013,22(6):861-863,911.

    [13]李飛,蔡榮林,吳生兵,等.電針“涌泉”“中沖”穴對(duì)血管性癡呆大鼠事件相關(guān)電位P300的影響[J].針刺研究,2013,38(4):281-285.

    [14] 曾貴剛,李峻,彭海東,等.大鼠血管性癡呆動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(3):50-55.

    [15]陳浩,王頻,楊駿,等.艾灸對(duì)血管性癡呆患者癥狀及腦脊液中神經(jīng)肽類物質(zhì)水平的影響[J].中國(guó)針灸,2011,31(1):19-22.

    [16] 王頻,楊駿,楊帆,等.化瘀通絡(luò)灸法治療血管性癡呆的臨床觀察[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2009,18(2):172-174.

    [17] 王頻,楊駿,柳剛,等.艾灸頭部穴位為主對(duì)血管性癡呆患者腦脊液中生長(zhǎng)抑素和精氨酸血管加壓素水平影響的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2010,8(7):636-640.

    [18] 王頻,楊駿,楊帆,等.艾灸頭部組穴治療血管性癡呆的臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(10):1348-1351.

    [19]王頻,湯敬一,楊駿,等.艾灸對(duì)血管性癡呆大鼠海馬內(nèi)VEGF、flt-1、bFGF及bFGF-r表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32(1):97-101.

    [20] Krum JM, Mani A, Rosenstein JM. Angiogenic and astroglial responses to vascular endothelial growth factor administration in adult rat brain[J]., 2002,110(4):589-604.

    [21] Carmeliet P, Jain RK. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis[J]., 2011,473 (7347):298-307.

    The Effect of Stasis-eliminating and Meridian-unblocking Moxibustion on Vascular Endothelial Cell Proliferation and Migration in VD Rats

    1,1,2,1.

    1.230038,; 2.230038,

    Objective To investigate the in vitro intervening effect of rat serum effector substances on vascular endothelial cell proliferation and migration after stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion and explore the possible proangiogenic mechanism of stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion treatment for vascular dementia. Method Male adult Wistar rats were used. A rat model of vascular dementia was made by four-vessel occlusion (4-VO). The rats were randomized to moxibustion, Western medication and model groups. A sham operation group was established as a control. There was a total of four groups. The moxibustion group received aconite cake moxibustion on point Baihui(GV20) and suspended moxibustion on points Dazhui(GV14) and Shenting(GV24) and the Western medication, an oral gavage of aniracetam tablets. Treatment was given 15 days as one course for a total of two courses. Blood was taken from the Orbital cavity in the moxibustion, sham operation and model groups after each course of treatment. After stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion, animal serum was prepared to intervene in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) culture. Another parallel liquid group was set up. RPMI-1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) was prepared. Endothelial cell proliferation was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. Endothelial cell migration was examined by cell scratch labeling. Result After two courses of treatment, the examination of endothelial cell proliferation by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay showed that rat serum intervened significantly in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) proliferation in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (<0.01). At 24 hrs after two courses of treatment, the examination of endothelial cell migration by cell scratch labeling showed that rat serum intervention significantly increased the HUVEC-12 migration rate in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (<0.01). Conclusion Stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion has a marked improving effect on vascular endothelial cell proliferation and migration in vascular dementia rats, which provides strong evidence for its in vitro proangiogenic effect.

    Dementia, vascular; Endothelial cell; Cell proliferation; Cell migration; Angiogenesis; Rats; Medicinal cake-partitioned moxibustion; Moxa stick moxibustion; Acupuncture-moxibustion serum

    1005-0957(2017)04-0467-06

    R2-03

    A

    10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0467

    2016-08-20

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473785)

    張曼(1988—),2014級(jí)碩士生,Email:84198813@qq.com

    楊駿(1958—),男,教授,研究方向?yàn)獒樉牡呐R床作用機(jī)理研究,Email:yangjunacup@126.com

    猜你喜歡
    灸法血管性艾灸
    董氏奇穴聯(lián)合透灸法治療感冒后咳嗽驗(yàn)案
    灸法治療“未病”
    艾灸與耳穴治療假性近視
    家庭灸法輕松緩解眼疲勞
    一款多功能便巧艾灸輔助器
    遠(yuǎn)離斑禿 不再尷尬——用家庭灸法輔助治療斑禿
    冬病夏治 三伏艾灸效果好
    血管性癡呆中醫(yī)治療探析
    通絡(luò)止痛方治療血管性頭痛60例
    養(yǎng)腦復(fù)聰湯治療血管性癡呆33例
    免费在线观看黄色视频的| 久久久久久久久久久久大奶| 99国产极品粉嫩在线观看| 老司机亚洲免费影院| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲五月婷婷丁香| 在线天堂中文资源库| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 无限看片的www在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 大片电影免费在线观看免费| 精品久久蜜臀av无| 一级片'在线观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品一区二区在线不卡| 大片电影免费在线观看免费| 午夜久久久在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 少妇的丰满在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲av片天天在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 五月天丁香电影| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲国产欧美在线一区| 国产单亲对白刺激| 欧美精品av麻豆av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 午夜久久久在线观看| 91大片在线观看| 人人澡人人妻人| 成人精品一区二区免费| 色播在线永久视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲专区字幕在线| 岛国在线观看网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 91成人精品电影| 久久狼人影院| 国产91精品成人一区二区三区 | 精品第一国产精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 色综合婷婷激情| 一本久久精品| 下体分泌物呈黄色| 老熟妇仑乱视频hdxx| www.自偷自拍.com| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲第一av免费看| 另类亚洲欧美激情| 在线天堂中文资源库| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久99一区二区三区| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品成人在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 91大片在线观看| 91精品国产国语对白视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 在线 av 中文字幕| 激情视频va一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 一夜夜www| 国产成人影院久久av| aaaaa片日本免费| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲中文日韩欧美视频| 老司机亚洲免费影院| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品亚洲成国产av| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 1024视频免费在线观看| bbb黄色大片| 国产精品免费大片| 久久影院123| 丁香六月欧美| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 手机成人av网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品久久久av美女十八| 他把我摸到了高潮在线观看 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99re6热这里在线精品视频| 在线观看免费视频网站a站| 十八禁高潮呻吟视频| 一个人免费看片子| 欧美午夜高清在线| 国产午夜精品久久久久久| 大陆偷拍与自拍| 视频在线观看一区二区三区| bbb黄色大片| 欧美成人免费av一区二区三区 | 亚洲伊人久久精品综合| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 考比视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 69av精品久久久久久 | 在线观看www视频免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| h视频一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 黑丝袜美女国产一区| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 久久久久精品人妻al黑| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 天天添夜夜摸| 嫁个100分男人电影在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 成人18禁在线播放| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 999久久久国产精品视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 美女主播在线视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩视频在线欧美| 99精国产麻豆久久婷婷| 中文字幕人妻丝袜制服| 一进一出抽搐动态| 国产成人欧美在线观看 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99九九在线精品视频| 激情视频va一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 丰满饥渴人妻一区二区三| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品国产av在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 人成视频在线观看免费观看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲成国产人片在线观看| 制服人妻中文乱码| 国产精品熟女久久久久浪| 国产在线观看jvid| 免费在线观看完整版高清| 欧美在线一区亚洲| 亚洲人成电影免费在线| 成人18禁在线播放| 五月天丁香电影| 国产野战对白在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看 | 日本av免费视频播放| 成人18禁在线播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产亚洲一区二区精品| av天堂在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久精品成人免费网站| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲人成电影观看| 在线av久久热| 亚洲成人手机| 日韩免费av在线播放| 宅男免费午夜| 1024视频免费在线观看| 亚洲avbb在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 亚洲五月婷婷丁香| 在线播放国产精品三级| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区在线观看99| 国产麻豆69| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产精品一区二区免费欧美| 麻豆乱淫一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲中文日韩欧美视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久av网站| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美一级毛片孕妇| 美女午夜性视频免费| 搡老岳熟女国产| 亚洲九九香蕉| 亚洲国产av新网站| 丝袜美足系列| 欧美 日韩 精品 国产| 久久av网站| 国产黄频视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 9热在线视频观看99| 丝袜喷水一区| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人av教育| 黄色怎么调成土黄色| 女同久久另类99精品国产91| 国产高清激情床上av| 国产免费福利视频在线观看| 老司机福利观看| 国产精品国产高清国产av | 一区福利在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 女人精品久久久久毛片| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲成人免费av在线播放| 1024香蕉在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 窝窝影院91人妻| 好男人电影高清在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 狂野欧美激情性xxxx| 黄色成人免费大全| 免费在线观看完整版高清| 99精品久久久久人妻精品| 一级毛片精品| 久久久久久人人人人人| 黄色视频不卡| 日韩有码中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩有码中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久这里只有精品19| 黑人操中国人逼视频| 大型黄色视频在线免费观看| 露出奶头的视频| 国产麻豆69| 一区二区三区国产精品乱码| 在线观看www视频免费| 亚洲视频免费观看视频| 91国产中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲人成77777在线视频| av片东京热男人的天堂| 我要看黄色一级片免费的| 日本欧美视频一区| 交换朋友夫妻互换小说| 多毛熟女@视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 波多野结衣一区麻豆| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲中文日韩欧美视频| 免费看a级黄色片| 国产精品av久久久久免费| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品1区2区在线观看. | 老司机靠b影院| 男女床上黄色一级片免费看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产1区2区3区精品| 亚洲专区中文字幕在线| 大陆偷拍与自拍| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 不卡av一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产高清videossex| 动漫黄色视频在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最新美女视频免费是黄的| av免费在线观看网站| 宅男免费午夜| 成人黄色视频免费在线看| 99国产精品99久久久久| 免费看a级黄色片| 精品福利永久在线观看| 欧美精品av麻豆av| 亚洲三区欧美一区| 天堂动漫精品| 久久久国产成人免费| 91大片在线观看| 日韩免费av在线播放| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品免费大片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 岛国毛片在线播放| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲视频免费观看视频| 99香蕉大伊视频| 一区二区三区乱码不卡18| 国产xxxxx性猛交| 国产精品成人在线| 黑人操中国人逼视频| 国产av一区二区精品久久| 十八禁网站网址无遮挡| 99久久精品国产亚洲精品| 成年人午夜在线观看视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 午夜视频精品福利| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产在线视频一区二区| 国产区一区二久久| 一二三四在线观看免费中文在| 91精品三级在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品一区二区在线不卡| 国产深夜福利视频在线观看| cao死你这个sao货| 国产精品 欧美亚洲| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久99一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品免费大片| 下体分泌物呈黄色| 国产一区二区三区综合在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 我要看黄色一级片免费的| 蜜桃在线观看..| 午夜精品久久久久久毛片777| av不卡在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 女同久久另类99精品国产91| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产高清视频在线播放一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成年版毛片免费区| 久久久久精品人妻al黑| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久热爱精品视频在线9| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 色综合婷婷激情| 在线观看免费视频网站a站| tocl精华| 亚洲专区字幕在线| 亚洲视频免费观看视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产亚洲一区二区精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 人人澡人人妻人| 国产在线观看jvid| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜福利视频精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品国产一区二区久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲黑人精品在线| 中文字幕av电影在线播放| 美女午夜性视频免费| 一进一出抽搐动态| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 大陆偷拍与自拍| 午夜成年电影在线免费观看| 91字幕亚洲| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久久久久免费视频了| 国产又色又爽无遮挡免费看| 热99re8久久精品国产| 一二三四在线观看免费中文在| 91av网站免费观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 丁香欧美五月| bbb黄色大片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久99热这里只频精品6学生| 国产又爽黄色视频| 女警被强在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 91成年电影在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产成人系列免费观看| 99热国产这里只有精品6| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日本黄色日本黄色录像| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产黄色免费在线视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| av天堂在线播放| 亚洲人成电影观看| 老司机亚洲免费影院| 国产三级黄色录像| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久狼人影院| 亚洲国产av影院在线观看| 久久国产精品影院| 国产男女超爽视频在线观看| 黄片播放在线免费| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| tocl精华| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美国产精品一级二级三级| 男人操女人黄网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 777米奇影视久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩有码中文字幕| 久久久精品区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲成人手机| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产日韩欧美亚洲二区| bbb黄色大片| 妹子高潮喷水视频| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美精品av麻豆av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 电影成人av| 在线 av 中文字幕| 99国产综合亚洲精品| 怎么达到女性高潮| 亚洲成人国产一区在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲成人免费电影在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 一区二区av电影网| 亚洲精品中文字幕在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产在线视频一区二区| 成人影院久久| h视频一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 飞空精品影院首页| 黄片大片在线免费观看| 少妇 在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| netflix在线观看网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 最近最新中文字幕大全电影3 | 天堂8中文在线网| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲第一av免费看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲专区中文字幕在线| 69精品国产乱码久久久| 精品国产亚洲在线| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲人成77777在线视频| 丁香六月欧美| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人av激情在线播放| 丁香六月天网| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费看a级黄色片| 日本wwww免费看| 精品国产亚洲在线| 1024视频免费在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 男男h啪啪无遮挡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产在线一区二区三区精| 久9热在线精品视频| 国产亚洲av高清不卡| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 成人精品一区二区免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一级毛片精品| 国产91精品成人一区二区三区 | 91麻豆精品激情在线观看国产 | 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲国产欧美网| 国产男女超爽视频在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av成人一区二区三| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| 91大片在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 怎么达到女性高潮| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜免费鲁丝| 国产在线视频一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产精品电影一区二区三区 | 国产在线视频一区二区| 最新美女视频免费是黄的| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人啪精品午夜网站| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品免费大片| 国产淫语在线视频| 桃花免费在线播放| 精品人妻1区二区| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 18禁观看日本| aaaaa片日本免费| 国产深夜福利视频在线观看| 国产一区二区在线观看av| 亚洲美女黄片视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 高清视频免费观看一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲中文av在线| 亚洲成人手机| 俄罗斯特黄特色一大片| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产欧美亚洲国产| 亚洲午夜理论影院| 99国产综合亚洲精品| 热99国产精品久久久久久7| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩av久久| 久久精品91无色码中文字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 在线观看人妻少妇| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美大码av| 黄色视频不卡| 丰满少妇做爰视频| 亚洲七黄色美女视频| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 免费黄频网站在线观看国产| 老司机福利观看| 亚洲视频免费观看视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 高清欧美精品videossex| 交换朋友夫妻互换小说| 激情视频va一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 一区二区三区国产精品乱码| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 一级黄色大片毛片| 国产色视频综合| 飞空精品影院首页| 女人精品久久久久毛片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品免费大片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日日夜夜操网爽| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美日韩精品网址| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜视频精品福利| 日韩大片免费观看网站| 一区福利在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品卡一卡二卡四卡免费|