羅非魚細(xì)菌性敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌拮抗菌株的篩選和鑒定

李夢茜 +張振旺

摘要：嗜水氣單胞菌是動物和人類的致病菌，會引起水產(chǎn)動物敗血癥和人類腹瀉病等，對我國已造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。采用細(xì)菌的分離、純化和篩選等步驟，獲得對嗜水氣單胞菌引起羅非魚敗血癥有抑制作用的菌株LFJK-11，并對其形態(tài)特征和生理生化特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該菌株屬于鏈霉菌屬。通過對其16S DNA比對及其系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，該菌株與鏈霉菌屬相似性達(dá)到100%，該結(jié)果與其形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：羅非魚；嗜水氣單胞菌；敗血癥；鏈霉菌；篩選；鑒定；形態(tài)特征；生理生化特征

中圖分類號： S943.125.42+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0129-02

收稿日期：2016-01-28

基金項(xiàng)目：生物化工廣西重點(diǎn)學(xué)科（河池學(xué)院）建設(shè)基金（201308）；廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（編號：KY2016LX286）；河池學(xué)院校級重點(diǎn)科研課題（編號：XJ2016ZD001）；廣西壯族自治區(qū)級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練主項(xiàng)項(xiàng)目（編號：201610605079）。

作者簡介：李夢茜（1986—），女，河南周口人，碩士，講師，從事微生物藥物學(xué)。E-mail：limengxi66@126.com。

通信作者：張振旺，博士研究生，從事生物技術(shù)研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）廣泛存在于含水量豐富的土壤、淡水、污水、沼澤和糞便中，一部分是動物和人類的致病菌，會引起水產(chǎn)動物敗血癥和人類腹瀉病等[1-2]。嗜水氣單胞菌一直嚴(yán)重危害著水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)和人類健康，已造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)因疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失超過100億元[4]，可見水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的任務(wù)十分艱巨。運(yùn)用生物防治的手段篩選和應(yīng)用嗜水氣單胞菌拮抗菌，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，減少化學(xué)試劑的使用，以減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

1材料與方法

1.1材料

指示菌為嗜水氣單胞菌HCLF-2，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從患敗血癥的羅非魚中分離得到；以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，從土壤分離篩選獲得拮抗菌株 LFJK-11。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株的篩選

采用平板稀釋培養(yǎng)法[5]培養(yǎng)菌株，根據(jù)微生物菌落特征（大小、形狀、邊緣形狀、表面結(jié)構(gòu)、光澤、透明度和顏色）將單菌落挑出并編號。將所獲得的土壤單菌落用PDA 培養(yǎng)基在28 ℃條件下培養(yǎng)4 d，采用抑菌圈法，以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，篩選對嗜水氣單胞菌HCLF-2抑菌作用的菌株并保存。

1.2.2拮抗菌株的培養(yǎng)特征

選擇拮抗性能最佳的菌株，并將其接種于蔗糖察氏、燕麥、無機(jī)淀粉、馬鈴薯、葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)3～7d，觀察并記錄待測菌在不同培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及色素。

1.2.3生理生化特征的鑒定

測定纖維素水解、明膠液化、碳源利用、淀粉水解和H2S 產(chǎn)生等試驗(yàn)[6]。

1.2.4菌株16S rDNA序列的測定及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株LFJK-11接種在LB 培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)12～18 h，參照文獻(xiàn)[7]的方法提取基因組DNA。以DNA 組為模板，以16S rDNA基因擴(kuò)增通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出16S rDNA，[JP3]其中引物序列為：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-[JP]3′；1492R。5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，用DNA 膠回收試劑盒純化，然后直接寄至上海生工測序部進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行比對分析，篩選出9株菌株16S rDNA的全序列，使用ClustalW軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株篩選結(jié)果

經(jīng)拮抗檢測篩選到1 株對嗜水氣單胞菌HCLF-2有較強(qiáng)拮抗作用的菌株，編號為LFJK-11，抑菌圈直徑平均為156 mm（圖1）。如表1 所示，LFJK-11菌株對蘇云金桿菌、金黃色葡萄球菌、黑霉菌、大腸桿菌也有一定的拮抗作用，且該菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌效果最強(qiáng)，對黑霉菌抑菌效果最弱；發(fā)酵液稀釋30～60 倍后對這幾種病原菌仍有拮抗作用，可見該菌株發(fā)酵性能良好。

2.2拮抗菌株培養(yǎng)特征觀察

用劃線法將菌株分別接種在蔗糖察氏、燕麥、無機(jī)淀粉、馬鈴薯、葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)7 d，結(jié)果如表2所示，葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基上的菌株生長最好，生長速度較快，菌落較大，邊緣呈放線狀向外擴(kuò)散，表面干燥有突起，孢子呈圓形，具有土腥味。馬鈴薯培養(yǎng)基菌株生長優(yōu)良，向外擴(kuò)散能力較強(qiáng)，且在培養(yǎng)3 d時菌落中出現(xiàn)金黃色疣，孢子呈鏈狀且菌落緊實(shí)不易挑取，培養(yǎng)7 d時顏色逐漸變深表面出現(xiàn)粉狀。

2.3菌絲特征

2.3.1MS培養(yǎng)基

應(yīng)用插片法觀察菌絲特征，即分別在培養(yǎng)7、25 d后從MS培養(yǎng)基上取出插片，放在載玻片上滴加清水，放入40倍光鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示，LFJK-11菌株菌絲較細(xì)，無隔膜，呈垂直直線狀，分枝較多，如樹枝般相互緊密交叉。待氣生菌絲成熟后，逐漸分化成圓形孢子。菌絲顏色由淺色至深黑色。

2.3.2種子培養(yǎng)基

洗下MS培養(yǎng)基上的LFJK-11菌株菌落[CM（25]，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，于30[KG*3]℃、150[KG*3]r/min下培養(yǎng)3、7、[CM）]

[FK（W9][TPLMQ2.tif][FK）]

9 d，[JP2]再分別用結(jié)晶紫染色后在40倍光鏡下觀察，結(jié)果如表3所示，菌株菌絲細(xì)長，生長旺盛，呈放射狀向外生長并逐漸縮短增粗，致密交聯(lián)在一起，最終菌絲團(tuán)松散、斷裂并向四周擴(kuò)散。

2.4LFJK-11菌株生理生化特性

多種生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，LFJK-11菌株產(chǎn)淀粉水解酶、H2S，可以液化明膠，但不產(chǎn)纖維素酶，葡萄糖是比較理想的可利用的碳源。

2.5LFJK-11菌株16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

LFJK-11菌株基因組測序所得16S rDNA 堿基序列，于 NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST上進(jìn)行比對，選取12株同源性高的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3 所示，LFJK-11菌株以100% 的同源性屬于鏈霉菌屬。

3結(jié)論與討論

菌株的拮抗菌，經(jīng)鑒定為鏈霉菌。通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LFJK-11菌株發(fā)酵液抑菌效果強(qiáng)，可以運(yùn)用其發(fā)酵液來防治水產(chǎn)病原物。本試驗(yàn)對LFJK-11菌株的生長特征、生理生化特征及其菌絲和基質(zhì)特征進(jìn)行研究，并對其進(jìn)行16S rDNA測序比對并構(gòu)建生物樹，最終確定該菌株為鏈霉菌屬菌株，所得結(jié)果與常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果一致。

本試驗(yàn)屬首次對LFJK-11菌株生長特征進(jìn)行研究，且其發(fā)酵產(chǎn)物對于嗜水氣單胞菌HCLF-2菌株拮抗作用顯著，是一種較好的拮抗菌，對水產(chǎn)動物病原菌有較強(qiáng)的抑制活性，起抗病能力。此研究對于探尋水產(chǎn)動物及人類腸道病原物的生物防治以及水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著十分重要的作用。

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