脊尾白蝦抗白斑綜合征病毒群體初步選育及重要免疫酶活性分析

史文軍++萬(wàn)夕和++陳海泉 喬毅 +沈輝 +王李寶++黎慧

摘要：以脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda Holthuis）為試驗(yàn)材料，以人工連續(xù)7 d投喂攜帶白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的死蝦為攻毒方式，得抗性試驗(yàn)組（Rm）；以人工連續(xù)7 d投喂不攜帶WSSV的死蝦為對(duì)照方式，得對(duì)照試驗(yàn)組（Vm），待存活率穩(wěn)定后，分析比較抗性試驗(yàn)組和對(duì)照試驗(yàn)組的存活率及酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）活性的差異性；然后待Rm組中雌性脊尾白蝦蝦卵接近孵化時(shí)，挑選40～50尾體格較大的抱卵雌蝦，分別放入事先準(zhǔn)備好的桶中，讓其自然孵化，以此得Rm1代；孵化完成后，收集各組親蝦并編號(hào)，用套式PCR法檢測(cè)各組親蝦WSSV攜帶情況，將陰性組及蝦卵孵化較少組淘汰，留下20組，重新編號(hào)Rm1代，然后將其喂養(yǎng)成成蝦；以此方式連續(xù)選育得到Rm3代。用同樣方法對(duì)Rm3代成蝦和自然環(huán)境中WSSV攜帶成蝦（Vn）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，然后檢測(cè)結(jié)果顯示Rm3代成蝦比Vn成蝦存活率要高出很多且免疫相關(guān)酶活性之間存在顯著性差異。

關(guān)鍵詞：脊尾白蝦；白斑綜合征病毒；抗病群體；免疫相關(guān)酶

中圖分類號(hào)： S945.4+99文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0126-03

我國(guó)是蝦類養(yǎng)殖大國(guó)，但是隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速擴(kuò)張，養(yǎng)殖環(huán)境惡化、種苗退化和病害高發(fā)等因素嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。其中，蝦類病害越來(lái)越嚴(yán)重，白斑綜合征（white spot syndrome，WSS）的暴發(fā)給蝦類養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，這種病毒在蝦類個(gè)體間可以經(jīng)口傳播，蝦類感染后，死亡率極高[3-6]。因此選育出具有一定抗性的群體及對(duì)相關(guān)免疫酶活性的研究具有重要意義。蝦類主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)進(jìn)行自身的免疫防御，其中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）常被用于衡量蝦類的免疫狀態(tài)、健康狀態(tài)以及篩選抗病家系等[7-9]。

脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda Holthuis）屬于甲殼亞門十足目長(zhǎng)臂蝦科白蝦屬，其環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、世代周期短且易于人工條件下周年繁殖，是我國(guó)常見(jiàn)蝦類養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種[10]。另一方面，脊尾白蝦對(duì)WSSV敏感性強(qiáng)，在養(yǎng)殖過(guò)程中感染W(wǎng)SSV后死亡率極高，容易造成嚴(yán)重的養(yǎng)殖損失。本研究以脊尾白蝦為試驗(yàn)材料，通過(guò)投喂攜帶WSSV的死蝦為攻毒方式，連續(xù)進(jìn)行3代選育；并分析抗性試驗(yàn)組與對(duì)照試驗(yàn)組存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差異，探討初步選育具有一定抗WSSV的脊尾白蝦群體并研究相關(guān)免疫酶的活性變化。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和病毒攜帶蝦來(lái)源

試驗(yàn)所用脊尾白蝦：2014年3月于江蘇省東臺(tái)市脊尾白蝦養(yǎng)殖區(qū)選取經(jīng)套式PCR法檢測(cè)WSSV攜帶情況為陰性池塘內(nèi)的蝦，體長(zhǎng)為（4.8±0.5） cm，體質(zhì)量為（1.9±0.4） g；

試驗(yàn)用病毒攜帶死蝦：2013年6月于江蘇省東臺(tái)市脊尾白蝦養(yǎng)殖區(qū)選取大規(guī)模死亡后經(jīng)套式PCR法檢測(cè)WSSV攜帶情況為陽(yáng)性池塘內(nèi)的蝦，迅速冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并存儲(chǔ)于-80 ℃冰柜中待用；

試驗(yàn)用自然環(huán)境病毒攜帶蝦：2015年6月于江蘇省東臺(tái)市脊尾白蝦養(yǎng)殖區(qū)選取經(jīng)套式PCR法檢測(cè)WSSV攜帶情況為陽(yáng)性蝦塘內(nèi)的活體成蝦，平均體長(zhǎng)為（5.1±0.3） cm，平均體質(zhì)量為（2.1±0.5） g。

1.2WSSV攻毒試驗(yàn)

1.2.1抗WSSV群體的獲得將試驗(yàn)用脊尾白蝦用活水車運(yùn)輸至江蘇省海洋水產(chǎn)研究所呂四養(yǎng)殖試驗(yàn)基地，按約5 ∶[KG-*3]1分為試驗(yàn)組和對(duì)照組（1 000尾 ∶[KG-*3]200尾），適應(yīng)性暫養(yǎng) 7 d，期間正常投喂事先檢測(cè)不攜帶WSSV的顆粒餌料并及時(shí)撈出死蝦及殘餌，待兩組蝦穩(wěn)定后；向試驗(yàn)組投喂攜帶WSSV的死蝦，向?qū)φ战M投喂不攜帶WSSV的死蝦，每日早晚各投喂1次并及時(shí)撈出殘餌及死蝦，根據(jù)前日殘餌量及時(shí)調(diào)整投喂量，連續(xù)投喂7 d，得到0代試驗(yàn)組（Rm0）和對(duì)照組，以后按正常的管理方法進(jìn)行換水和投喂顆粒餌料。每天觀察蝦的存活情況，及時(shí)撈出并記錄死蝦數(shù)量，待試驗(yàn)組蝦存活情況穩(wěn)定后，分析比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差異性；然后待Rm0組中雌性脊尾白蝦蝦卵接近孵化（蝦卵成亮白色，黑色眼點(diǎn)明顯可見(jiàn)）時(shí)，挑選40～50尾體格較大抱卵雌蝦，分別放入事先準(zhǔn)備好的桶中，讓其自然孵化，以此得Rm1代；孵化完成后，收集各組親蝦并編號(hào)，用套式PCR法檢測(cè)各組親蝦WSSV攜帶情況，將陰性組及蝦卵孵化較少組淘汰，留下20組，重新編號(hào)Rm1代，然后將其喂養(yǎng)成成蝦；按以上方法連續(xù)攻毒選育得到Rm3代。

1.2.2攻毒對(duì)Rm3和Vn的影響比較[JP2]為檢驗(yàn)經(jīng)歷WSSV連續(xù)感染淘汰后，Rm3代脊尾白蝦成蝦是否比自然環(huán)境中病毒攜帶蝦（Vn）的抗性強(qiáng)，并檢測(cè)相關(guān)免疫酶活性變化情況，進(jìn)行如下試驗(yàn)：從20組Rm3代脊尾白蝦成蝦中隨機(jī)挑選150尾，并隨機(jī)分為3組，每組50尾；另外隨機(jī)挑選Vn組脊尾白蝦成蝦150尾，隨機(jī)分為3組，每組50尾。向6組中分別投喂攜帶WSSV的死蝦，每日早晚各投喂1次并及時(shí)撈出殘餌，根據(jù)前日殘餌量及時(shí)調(diào)整投喂，連續(xù)投喂7 d，以后按正常的管理方法進(jìn)行換水和投喂顆粒餌料。每天觀察蝦的存活情況，及時(shí)撈出并記錄死蝦數(shù)量，待蝦存活情況穩(wěn)定后，分析比較Rm3代組和Vn組的存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差異性。[JP]

1.3WSSV攜帶情況檢測(cè)

為檢測(cè)脊尾白蝦WSSV攜帶情況，本試驗(yàn)采用套式PCR法，具體操作過(guò)程參照GB/T 28630.2—2012《白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測(cè)法》。

1.4總蛋白質(zhì)的提取及酶活檢驗(yàn)

[JP2]將所取脊尾白蝦的頭胸部取下作為樣品，于液氮中進(jìn)行研磨至均勻細(xì)致的粉末，用于相關(guān)免疫酶活性檢測(cè)[10]。酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，分別按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)脊尾白蝦中免疫相關(guān)酶活性。研磨細(xì)碎的粉末中總蛋白的含量采用Bradford法[11]測(cè)定。[JP]

1.5數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用平均值表示，且每組不少于3個(gè)平行，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，若P<0.05，表示試驗(yàn)組與對(duì)照組之間存在顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1脊尾白蝦耐受群體的獲得

脊尾白蝦抗WSSV群體由Rm0代到Rm3代共經(jīng)歷3次攻毒，每次攻毒后，試驗(yàn)組脊尾白蝦均出現(xiàn)大批量死亡，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的死蝦采用套式PCR法進(jìn)行WSSV攜帶情況檢測(cè)，結(jié)果顯示抗性試驗(yàn)組死亡的脊尾白蝦隨機(jī)抽樣都檢測(cè)到WSSV陽(yáng)性，說(shuō)明其死亡原因可能由WSSV感染所致；而對(duì)照組死亡的脊尾白蝦隨機(jī)抽樣都未檢測(cè)到WSSV，說(shuō)明其死亡原因并非WSSV感染所致。

2.2Rm0～Rm2代及Vm群體存活率和免疫相關(guān)酶活性差異

通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算每次攻毒至穩(wěn)定后Rm0～Rm2代和Vm的脊尾白蝦存活率，結(jié)果見(jiàn)圖1。Vm中脊尾白蝦平均存活率達(dá)到91.60%，而Rm0脊尾白蝦幾乎完全死亡，平均存活率只有6.07%；Rm2中脊尾白蝦存活率略有提高，達(dá)到1260%，[JP2]Rm0～Rm2代和Vm的存活率均存在顯著性差異（P<005）。[JP]

[TPSWJ1.tif][FK）]

利用酶活檢測(cè)試劑盒對(duì)每次攻毒至穩(wěn)定后Rm0～Rm2代和Vm的脊尾白蝦ACP、AKP、SOD和PO的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出隨著攻毒次數(shù)的增加，4種免疫相關(guān)酶在脊尾白蝦體內(nèi)的酶活力均呈下降趨勢(shì)，其中ACP和PO的下降趨勢(shì)明顯、AKP下降趨勢(shì)次之、SOD下降趨勢(shì)最弱；但隨著攻毒次數(shù)的增加，Rm2代脊尾白蝦體內(nèi)4種免疫相關(guān)酶活力均顯著低于Vm中的酶活（P<0.05）。

2.3攻毒后Rm3及Vn群體存活率和免疫相關(guān)酶活性差異

參照上述的試驗(yàn)方法及檢測(cè)方法，分析比較Rm3和Vn群[CM（25]體在攻毒后的差異性，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出經(jīng)過(guò)WSSV連續(xù)攻毒選育后得到的Rm3比Vn 對(duì)經(jīng)口感染W(wǎng)SSV的耐受力要高；4種免疫相關(guān)酶ACP、AKP、SOD和PO在Rm3和Vn之間均存在顯著性差異（P<0.05）。

3討論

蝦類抗病群體或家系選育研究是目前國(guó)際上良種選育的重要方向。在我國(guó)，對(duì)蝦類抗病群體或家系選育研究也較為普遍，如朱其建等進(jìn)行了抗溶藻弧菌羅氏沼蝦群體的選育[12]、黃永春等進(jìn)行了抗WSSV凡納濱對(duì)蝦家系的選育[13-14]以及王專偉[15]和張濤[16]進(jìn)行了抗WSSV斑節(jié)對(duì)蝦家系的選育等。本研究以人工感染的方式對(duì)脊尾白蝦進(jìn)行了連續(xù)3次攻毒，將其中低耐受力個(gè)體淘汰，最終存活下來(lái)的群體被認(rèn)為是對(duì)WSSV具有高耐受力的脊尾白蝦群體；對(duì)Rm3和Vn[JP2]群體在攻毒后的差異性比較結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了這一選育方法的可靠性。當(dāng)然，想要最終得到一種高抗WSSV的脊尾白蝦新品種，選育的世代仍需繼續(xù)延續(xù)下去，但這種抗性能否穩(wěn)定遺傳仍需要通過(guò)分子生物學(xué)手段分析其進(jìn)化關(guān)系來(lái)確定。[JP]

甲殼類動(dòng)物主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)進(jìn)行免疫防御，其中免疫蛋白質(zhì)起到至關(guān)重要的作用。Chen等[17]、Sung等[18]和Qin等[19]的研究中均將ACP和AKP用作免疫能力變化的相關(guān)指標(biāo)；在Fridovich[20]和Johansson等[21]的研究中分別將SOD和PO作為免疫能力變化的相關(guān)指標(biāo)。本研究中，選取ACP、AKP、SOD和PO這4種免疫相關(guān)酶作為脊尾白蝦攻毒穩(wěn)定后，體內(nèi)免疫能力變化的指標(biāo)。由Rm0代到Rm2代，4種免疫酶活力均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與王專偉等[9]、馮寧寧等[10]、[JP2]張濤[16]和張曼等[22]研究WSSV對(duì)不同種蝦類免疫酶活性的影響相似；但在本試驗(yàn)中，雖然Rm2代4種免疫酶最終與Vm均存在顯著性差異，但ACP、AKP和PO的變化趨勢(shì)更為顯著，而SOD的變化趨勢(shì)較??；所以在脊尾白蝦對(duì)WSSV抗性強(qiáng)弱方面，ACP、AKP和PO這3種免疫相關(guān)酶活性的高低更具有指示性；但是否能真正作為脊尾白蝦對(duì)感染W(wǎng)SSV的主要免疫指標(biāo)還需進(jìn)行更加深入的研究。在Rm3代與Vn存活率及免疫相關(guān)酶活性比較分析中可以看出，經(jīng)過(guò)連續(xù)的攻毒選育，Rm3代成蝦比Vn成蝦對(duì)WSSV的抗性有所提高，免疫相關(guān)酶活性的變化也與前期研究具有一致性。[JP]

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