qPCR常見問題及分析解決辦法

昆山吉和力儀器有限公司（以下簡稱“吉和力”）是一家提供專業(yè)服務和儀器設備的集成供應商，公司以用戶實際需求為導向，提供最合適、性價比最高的儀器，致力于打造一站式服務平臺。為了讓業(yè)內人士對qPCR進行更加深入的了解，吉和力整理了一些相關常見問題，并對這些問題一一進行了解答。

qPCR的英文全稱是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)，簡稱qPCR。

簡單來說，qPCR就是利用熒光信號的變化，實時監(jiān)測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。而常規(guī)的PCR無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時監(jiān)測。

如何提高RT-PCR反應的靈敏度與特異性？

①確定模板RNA完整性，無DNA污染；

②RNA模板中不應含有擴增反應抑制劑；

③為了防止模板降解，在反應體系中加入RNase抑制劑RNasin；

④使用適量的模板RNA，模板量太多會降低特異性，太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱；

⑤若模板中有二級結構，可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果；

⑥設計引物時，避免在引物3端含有互補序列，避免形成內部發(fā)卡結構。

避免RNA降解的方法有哪些？

①在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA；

②運用良好無污染技術分離RNA；

③將組織從動物體取出后立刻提取RNA，并將提取好的RNA反轉錄為cDNA進行低溫保存。

RNA中含有逆轉錄抑制劑時，怎么處理？

逆轉錄抑制劑包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽，可將對照RNA與樣品混合，同對照RNA反應比較產量以檢測RNA抑制劑；若對照RNA與樣品混合后產量降低，則說明樣品中存在逆轉錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對RNA沉淀進行清洗，以除去抑制劑。

如何減少RNA模板中的二級結構？

①將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性、退火，提高逆轉錄反應溫度；

②溫度超過60℃時，不能使用oligo（dT）引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP；

③RT-PCR產物的長度超過1kb時，反應溫度需保持在65℃。

RNA中有DNA污染的處理方式

①若是基因組DNA的污染，可使用DNaseI處理RNA，同時設置沒有逆轉錄對照組反應檢測DNA污染；

②若是受到外源DNA的污染，可使用抗氣霧劑和UDG酶。

qPCR探針設計的一般原則有哪些？

①擴增片段的長度不應太大，一般小于300bp；

②探針不能和任一引物互補，且其長度在保證特異性的前提下盡可能的短，長度不要超過30bp；

②探針的Tm值至少比引物的Tm值高5度；

③探針如用于檢測多態(tài)位點，多態(tài)位點應盡可能靠近探針中部；

④探針5端不能是堿基G，G對熒光基團有猝滅作用。

無反轉錄酶情況下，對照RNA仍有擴增結果

①體外轉錄時不可能將所有DNA模板消除，因而對照組會含有痕量的DNA。建議可將第一鏈cDNA稀釋1：10、1：100、1：1000倍以消除DNA污染造成的影響；

②可能是引物二聚體的條帶。

擴增產物滯留在加樣孔中

①可能是由于模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物，建議將第一鏈cDNA濃度稀釋至100倍再進行二次擴增；

②在二次PCR時，使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。

無Ct信號出現(xiàn)

①反應循環(huán)參數(shù)不夠，一般要在35個循環(huán)以上，但是過多的循環(huán)次數(shù)可增加背景值；

②檢測熒光信號的步驟有誤。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸時采集熒光信號，taqman法則是在退火結束或延伸結束時進行信號采集；

③引物或探針降解，可用PAGE電泳檢測其完整性，若是電泳條帶呈彌散狀，可考慮重新合成引物或探針；

④模板不足或降解，則可以重新提取核酸模板。

Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

①擴增效率低，反應條件不夠優(yōu)化，降低退火溫度，增加鎂離子濃度；

②反應成分降解或加樣量不足；

③PCR產物過長，一般采用80-150bp。

標準曲線線性關系不佳

①加樣存在誤差，是樣品濃度不成梯度；

②標準品出現(xiàn)降解，避免反復凍融；

③引物或者探針設計不佳；

④模板中存在抑制物或模板濃度過高。

溶解曲線存在多個主峰

①引物設計不夠優(yōu)化；

②引物濃度不佳，上下游引物濃度比例不一致；

③鎂離子濃度過高；

④模板基因組的污染。

同一樣品中，其中某一個熒光信號特別強

①試劑配制時反應液沒有完全溶化，導致探針量在一管增多；

②試劑配制時沒有充分混勻致各管中各成分的量不同；

③PCR儀熱槽被熒光物質污染，需要清除熱槽中的污染。

擴增曲線有一向上或向下的尖峰？

①反應過程中電壓不穩(wěn)定；

②可能在20個循環(huán)左右時，儀器有停下或儀器有開蓋，使光線突然增強；

③如果尖峰向下，可能是由鹵素燈老化所致，這時應更換。

部分樣本擴增效率過低？

①提取液殘留，一定程度抑制了PCR反應；

②反應液未嚴格取量混勻或分裝不均勻；

③試劑失效。

陰性對照或空白對照翹尾

①模板提取環(huán)境或操作過程有污染；

②配液過程存在污染。

直線型擴增曲線

①探針部分降解：一般稀釋的探針可在4℃保存至少3個月，探針的反復凍融或導致降解；或者探針在光線下暴露時間太長了；

②反應液中有PCR抑制物。

沒有擴增曲線

①PCR參數(shù)設置錯誤，在設計循環(huán)參數(shù)時將熒光信號讀取時間設在反應的第一步，即stage1階段；

②電腦設定了自動休眠。

基線下滑

基線選取范圍不對，可試著將基線范圍改大一些，這一問題常因試劑質量所致。

擴增曲線斷裂

基線選取范圍不對，基線終點大于Ct值，這通常是由于模板DNA濃度過高所致，因Ct值<15，而基線范圍仍取3～15，其中包含部分擴增信號，導致標準差偏大，閾值過高，解決辦法：減少基線終點至Ct前4個循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。

樣品濃度跨度過大

樣品濃度過高，導致陽性樣品擴增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，其解決方法同“擴增曲線斷裂”。

山坡形曲線

常因反應管封口不嚴，至反應液蒸發(fā)所致。